قياس الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

Summary

الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +} ديناميات هي مهمة جدا في علم وظائف الأعضاء الحيوانات المنوية والكالسيوم ^{2 +} حساسة الأصباغ الفلورية تشكل أداة مرنة لدراستها. وتستخدم التجارب السكان (قياس التألق وتوقف تدفق قياس التألق) والتجارب خلية واحدة (التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة) لتعقب المكانية والزمانية [كا ^{2 +}] تغيرات في خلايا الحيوانات المنوية البشرية.

Abstract

الحيوانات المنوية هي خلايا التناسلية للذكور صمم خصيصا للوصول والتعرف عليها وتندمج مع البيضة. لأداء هذه المهام، الخلايا المنوية يجب أن يكون مستعدا لمواجهة بيئة متغيرة باستمرار والتغلب على العديد من الحواجز المادية. يجري في جوهر transcriptionally وtranslationally صامتة، وهذه الخلايا متحركة تعتمد بشكل كبير على آليات متنوعة مما يشير إلى توجيه نفسها والسباحة بطريقة موجهة، ويتعامل مع ظروف بيئية قاسية خلال رحلتهم للبحث عن البيض. على وجه الخصوص، كا ^{2 +} إشارات بوساطة أمر حيوي لعدة وظائف الحيوانات المنوية: تفعيل الحركة، وتمكين الطاقات (عملية معقدة التي تعد الحيوانات المنوية للتفاعل الجسيم الطرفي) وردود الفعل الجسيم الطرفي (حدثا exocytotic التي تسمح الانصهار الحيوانات المنوية البيضة). استخدام الأصباغ الفلورية لتتبع تقلبات الخلايا من أيون هذا له أهمية ملحوظة نظرا لسهولة تطبيقها، والحساسية، وبراعة ديتection. باستخدام بروتوكول واحد واحد صبغ التحميل نستخدم أربع تقنيات مختلفة لمراقبة فلوروميتريك الحيوانات المنوية كا ^{2 +} ديناميات. يوفر كل تقنية المعلومات المتميزة التي تمكن القرار المكانية و / أو الزماني، وتوليد البيانات سواء في خلية واحدة ومستويات السكان الخلية.

Introduction

كا ^{2 +} هو رسول الثاني العالمي لمسارات نقل الإشارة في الخلايا حقيقية النواة. داخل الخلايا كا ^{2 +} (كا ^{2 +} _ط) يشارك في تنظيم العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية في الخلايا على حد سواء منفعل وغير منفعل. مشتق أهمية وعالمية كا ^{2 +} كرسول الثانية خلال الأحداث نقل الإشارة من تنوعها المكانية والزمانية في نقل المعلومات داخل الخلية. بينما كا ^{2 +} لا يمكن توليفها من جديد أو المتدهورة داخل الخلية، وتركيزه داخل الخلايا ([كا ^{2 +]} _ط) يتم الاحتفاظ ضمن حدود صارمة للغاية من خلال الآليات الخلوية المختلفة التي العازلة بشكل مستمر، تنحية، تجزئة، و / أو تتراكم كا ^{2 +.} يمكن أن تحدث تغييرات في تركيز أيون في هذه المناطق المترجمة للغاية داخل الخلية ^1، وفك رموز هذه التقلبات أمر ضروري لاكتساب ديفهم EPER من (1) دورهم في آلية يشير، (2) أهميتها الفسيولوجية، و (3) آليات العام للإشارة الخلية. كا ^{2 +} إشارات بوساطة له أهمية خاصة في علم وظائف الأعضاء الحيوانات المنوية ^2. الحيوانات المنوية على الحركة هي واحدة من أهم وظائف للنجاح الإخصاب، في واقع الأمر، يمكن أن العديد من العيوب الحيوانات المنوية على الحركة يسبب العقم ^3-5. أهمية الكالسيوم ^{2 +} في حركة سوطي وقد أدركت منذ فترة طويلة ^6، ولكن آلية لكيفية كا ^{2 +} يتحكم في شكل محدد من أشكال سوطي الانحناء ليست مفهومة تماما.

قبل التفجير مع البويضة، يجب أن تخضع الحيوانات المنوية وتمكين الطاقات، وهي عملية معقدة تعتمد على الإقامة الحيوانات المنوية داخل المسالك الإناث. خلال تمكين الطاقات، يتم تعديل بنية الدهون غشاء الحيوانات المنوية ومنظمة، وذلك أساسا نتيجة لإزالة الكوليسترول من غشاء البلازما. بالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتينات هي التيروزين-الفوسفورylated ^7. الأهم من ذلك، خلال تمكين الطاقات هناك زيادة في درجة الحموضة داخل الخلايا (درجة الحموضة _ط) و في [كا ^{2 +]} _ط، وhyperpolarizes غشاء المحتملة في بعض الأنواع ^2. تمكين الطاقات يستغرق سوى مكان في جزء من السكان من الحيوانات المنوية (20-40٪)، والآليات التي تشارك في كل هذه التغيرات الخلوية لا تزال بعيدة عن الوضوح. ومن المسلم به عموما أن فقط جزء من السكان من الحيوانات المنوية باكتسابها الخضوع لتفاعل الجسيم الطرفي (AR) عندما تتعرض لفائف الفسيولوجية. ع هو أيضا كا ^{2 +} حدث التنظيم المطلوب للإخصاب في جميع الأنواع امتلاك الجسيم الطرفي (عضية المتخصصة مع الأغشية الخارجية والداخلية). خلال هذه العملية الصمامات غشاء الجسم الطرفي الخارجي مع غشاء البلازما المنوية، والإفراج عن الانزيمات حلمهي التي تسمح للخلية الحيوان المنوي على اختراق مصفوفة غليكو-البروتينية المحيطة البيض (المنطقة الشفافة، أو ZP). أيضا يعرض AR جديدة fusogenic الحيوانات المنوية سطح الخلية التي تتفاعل معغشاء البلازما البيض للانصهار النهائي كل من الأمشاج. هناك عدة بروابط الخلوية التي تحفز AR، البروجسترون كونها واحدة من أكثر درس فيما بينها.

في هذا العمل نقدم أربع تقنيات مختلفة تنطوي على استخدام كا ² صبغة الفلورسنت حساسة ⁺ لقياس [كا ^{2 +]} _ط التغيرات في الحيوانات المنوية البشرية الناجمة عن البروجسترون (باستثناء التدفق الخلوي، الذي قمنا بقياس [كا ^{2 +} ] _أنا يسببها زيادة خلال عملية تمكين الطاقات في المختبر). في هذه الحالة بالذات كنا فلوو-3 AM (الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، صبغة نفاذية الغشاء مع K _د = 325 نانومتر. في المختبر فإننا رصد التغيرات مضان بوصفها وظيفة من الوقت مع ثلاثة من المنهجيات، ومع تقنية الرابع قمنا بقياس القيم مضان في نقطة واحدة معينة من الزمن. هذه المقاربات المختلفة تكمل بعضها البعض، تماما منذ أنها توفر الدقة المكانية والزمانيةolution في كل من خلية واحدة ومستويات السكان الخلية.

السكان الخلية أو التجارب السائبة

وتستخدم تقنيات السائبة على نطاق واسع ليس فقط لأن الصكوك التي تتطلب متوفرة بسهولة، ولكن أيضا لأنها بسيطة، راسخة، والسماح للفي المتوسط ​​من المعلومات من القياسات التي أجريت على ملايين الخلايا في تجربة واحدة.

تقنية # 1. قياس التألق التقليدية
هذه التقنية تراقب التغيرات في مضان بوصفها وظيفة من الزمن؛ يتم تنفيذ التجارب في cuvettes الزجاج مع حجم العينة تتراوح ما بين 200 إلى 1،000 ميكرولتر. الخلط السليم من الكواشف وأضاف يتطلب التحريك المغناطيسي، وبالتالي فإن القرار الزماني حصلنا عليها في ترتيب ثواني. نموذجية خلية تركيز مجموعة من العينات التي تم تحليلها هي 10 ⁵ -10 ⁸ خلية / مل.

تقنية # 2. توقف تدفق قياس التألق
Tأسلوبه أيضا تراقب التغيرات في مضان بوصفها وظيفة من الوقت، ولكن الكواشف بسرعة تختلط معا (باستخدام ضغط) في كفيت تسجيل يحتوي على حجم عينة صغيرة جدا (تتراوح 25-100 ميكرولتر). ولذلك، تجانس الكواشف بشكل فوري، مما يتيح قرار زمنية عالية في ترتيب ميلي ثانية. تحليل مضان مقابل الوقت مما آثار هي مناسبة لتحديد معدلات التفاعل، توضيح مدى تعقيد آلية رد الفعل، والحصول على معلومات عن رد فعل وسيطة لم يدم طويلا، وما إلى ذلك مجموعة تركيز خلية مشتركة من العينات التي تم تحليلها هي 10 ⁵ -10 ⁷ خلية / مل.

تجارب خلية واحدة

تجارب السائبة تقرير السلوك متوسط ​​لعدد كبير من الخلايا، ومع ذلك، قد يبلغ عدد سكانها تظهر في كثير من الأحيان الخصائص غير المتجانسة التي يتم التغاضي عنها خلال هذا النوع من القياسات. وبالتالي تستخدم تقنيات خلية واحدة لتكمل المعلومات البريد التي تم الحصول عليها مع التجارب السكان الخلية.

تقنية # 3. التدفق الخلوي
وعلى الرغم من أهمية المعلومات الناتجة عن القياسات خلية واحدة، فمن المهم لتحليل عدد كبير من الخلايا من أجل منع استقراء الخاطئة من خصائص خلية محددة لشعب بأكمله. لهذا السبب، ويفضل التقنيات الإنتاجية العالية والأسلوب الأكثر شعبية هو التدفق الخلوي، التي يتم تحليلها في تقليديا 10،000 خلية لكل حالة. تمكن هذه الطريقة تحليل متعدد حدودي من السكان غير متجانسة لأنها تصنف الخلايا وفقا لحجمها (مبعثر إلى الأمام (FSC))، تحبب (مبعثر الجانب (SSC)) وكثافة مضان (وضع العلامات المحددة مع الأجسام المضادة، علامة السلامة، الخ.) ، وبالتالي توفير المعلومات عن توزيع المعلمات "لمجموعة من الخلايا. التدفق الخلوي يوفر الفوري بدلا من المعلومات التي تعتمد على الوقت ^8. إلى الأمام والجانب مبعثر القيم عيجب أيضا أن يدرج ه مفيدة أيضا لاختيار البوابة التي تشمل الخلايا ولكن يميز الحطام الخلوية، والغبار، وغيرها للحصول على قياسات مضان، مضان ضوابط السلبية والإيجابية. إذا تم استخدام قناة مضان أكثر من واحد، وهي عملية تعرف باسم التعويض يجب أن يؤديها (لمزيد من التفاصيل انظر http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). التعويض يسمح للتداخل الطيفية التمييز بين fluorophores. التدفق الخلوي كما يتيح التمييز من الخلايا الميتة، عموما عن طريق propidium تلطيخ يوديد.

تقنية # 4. التصوير خلية واحدة
المجهري هو طريقة أخرى شائعة لدراسة سلوك خلية واحدة، بل هي مناسبة تماما للدراسات التي تعتمد على الوقت وأنه يوفر أيضا القرار المكانية. والعيب الرئيسي هو أن تحليل الإنتاجية العالية ليست سوى في بداياتها في الوقت الحاضر 9.

Protocol

في هذه الورقة ونحن التقرير استخدام أربعة أساليب المذكورة أعلاه لقياس [كا ^{2 +]} _ط التغيرات في خلايا الحيوانات المنوية البشرية. كنا البروجسترون لاشعال كا ^{2 +} ردا على ذلك، كما يتم تأسيس جيدا أن هذا الستيرويد تنتج عابر [كا ^{2 +]} _ط زيادة في الحيوانات المنوية. ولا سيما، في الحيوانات المنوية البشرية، ينشط هرمون البروجسترون مباشرة كا ^{2 +} قناة (أي CatSper) أعرب حصرا في غشاء البلازما من خلايا الحيوانات المنوية ^10،11. نحن أيضا قياس يستريح [كا ^{2 +]} _ط قبل وبعد تمكين الطاقات بالنظر إلى أن أيضا مقبولة على نطاق واسع أن أي زيادة في [كا ^{2 +]} _ط يحدث خلال تمكين الطاقات. لتقنيات تتطلب مراقبة إيجابية استخدمنا كا ^{2 +} حامل الأيون-ionomycin للحث القصوى كا ^{2 +} امتصاص داخل الخلية، وبالتالي، استجابة مضان القصوى؛ لأدنى قيمة مضان، استخدمنا المنغنيز ^{2 +} لإرواء مضان.

1. الحيوانات المنوية تحضير العينة بواسطة الأسلوب السباحة (انظر الشكل 1)

استخدام أنزلت عينات فقط (التي تم الحصول عليها عن طريق الاستمناء) التي تفي معايير التي وضعتها الطبعة الأخيرة من منظمة الصحة العالمية مختبر دليل (متوفر في الخصائص http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241547789_eng.pdf ) لإجراء الفحص وتجهيز السائل المنوي البشري.

1. الحصول على عينة السائل المنوي داخل وعاء معقم ووضعه (مع غطاء خففت) داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO ₂ 5٪ / بضغط الهواء 95٪ خلال 30 دقيقة. هذه الخطوة هي للتسييل عينة.
2. مكان 500 ميكرولتر مأخوذة من عينة السائل المنوي المسال على الجزء السفلي من أنابيب الاختبار الزجاجية نظيفة (1.0 × 7.5 سم). وهناك حاجة إلى ما يقرب من ثمانية أنابيب اختبار لعينة حجم متوسط ​​(4 مل).
3. بعناية طبقة 1 مل من هام F-10 متوسطة (سو. pplemented مع 2 مم CaCl ₂ و 5 ملغ / مل مصل بقري الزلال لتعزيز وتمكين الطاقات في المختبر) على رأس كل قسامة السائل المنوي (انظر الشكل 1) نصيحة: المس جدار الأنبوب مع غيض من micropipette، والاستغناء بلطف وفوق المتوسطة العينة. فمن الأهمية بمكان أن تفعل ذلك ببطء كما مزج كل من طبقات (عينة والمتوسطة) يجب تجنبه.
4. تتكئ بعناية الأنابيب إلى زاوية 30 درجة تقريبا. سيؤدي هذا إلى زيادة مساحة السطح بين السوائل اثنين، ومن ثم تعزيز النزوح (السباحة) من الخلايا البشرية من العينة إلى متوسطة أثناء الحضانة.
5. وضع مجموعة من أنابيب الاختبار انحنى داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO ₂ 5٪ / بضغط الهواء 95٪ لمدة 1 ساعة.
6. باستخدام micropipette إزالة بعناية ميكرولتر 700 العلوي من لحم الخنزير في F-10 المتوسطة (التي تحتوي على الحيوانات المنوية القادرة على الحركة الآن) من كل أنبوب وبركة جميع العينات التي تم جمعها في أنبوب زجاجي نظيف واحد (1.0 × 7.5 سم، لكميات أكبر استخدام 15 ملأنبوب الصقر)، وتجنب تشكيل فقاعة. مكان 10 ميكرولتر من عينة مجمعة على الزجاج المسطح البصرية للMakler عد قاعدة الدائرة، ثم وضع غطاء زجاجي (مرة واحدة الغطاء في مكانه، وتجنب رفع أو تغطي مرة أخرى للحفاظ على انتشار موحدة من عينة الحيوانات المنوية). تأكد لتجنب تشكيل فقاعة داخل غرفة لأن هذا من شأنه أن يؤدي على عدد خلايا غير دقيقة.
7. مراقبة تحت المجهر المركب (ينصح باستخدام الهدف 20X). غطاء زجاجي لغرفة العد Makler لديه ساحة كبيرة تتألف من 100 مربعات صغيرة (أي 10 بنسبة 10 شبكة). عد الخلايا في أي قطاع من 10 الساحات. هذا الرقم يمثل تركزها في الملايين من الخلايا / مل. تكرار العد في إضافية قطعتين 10 متر مربع، وحساب متوسط ​​بين الاتهامات الثلاثة ملاحظة: إذا كان لدى الدائرة العد Makler (الذي صمم خصيصا لحساب الخلايا المنوية) غير متوفر، أي غرفة عدادة الكريات يمكن استخدامها.
8. ضبط الاتحاد الدولي للسباحة العينةتركيز لتر إلى 1X10 ⁷ خلية / مل في استكمال هام F-10 متوسطة. عند الاقتضاء، واحتضان العينة على 37 درجة مئوية وCO ₂ 5٪ / الهواء 95٪ لمدة 5 الموارد البشرية لتعزيز وتمكين الطاقات.

2. الفلورسنت جار لصبغ كا ^{2 +} قياسات

وهناك العديد من الأصباغ الفلورية المتاحة لقياس الخلايا كا ^{2 +؛} يجب اختيار واحدة مناسبة وفقا لنظامه K _د، ويجب موجات الانبعاثات والإثارة والخمسين (لقياس الكمية والنوعية، وانبعاث موجات الإثارة مفردة ومزدوجة، على التوالي، تكون المستخدمة) مزيد من المعلومات). لتطبيق النوعي الحاضر كنا فلوو-3 صباحا، صبغة الخلية نفيذ مع K _د = 325 نانومتر، والانبعاثات واحد وإثارة موجات من 506/526 نانومتر، على التوالي ^12.

1. إعداد 50 ميكرولتر من مم 1-فلوو 03:00 محلول المخزون عن طريق إذابة محتوى واحد 50 ميكروغرام قنينة صبغ (MW = 1130 جم / مول) في 44 ميكرولتر من DMSO اللامائية.
2. باستخدام 1.5 مل microfuge أنبوب مزج حجم المطلوب من تعليق الحيوانات المنوية (انظر المبلغ المطلوب لكل تقنية محددة أدناه) مع ما يكفي من 1 ملم فلوو-03:00 محلول المخزون للحصول على تركيز النهائي من 2 ميكرومتر فلوو-03:00 (أي 1 ميكرولتر من يتم إضافة الأسهم فلوو-3:00 لكل 500 ميكرولتر من تعليق الحيوانات المنوية).
3. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
4. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب في 750 x ج لمدة 5 دقائق باستخدام microcentrifuge، ونضح وتجاهل طاف، و resuspend بيليه في حجم مناسب (انظر التركيز المطلوب لكل تقنية محددة أدناه) من الحيوانات المنوية البشرية المتوسطة (HSM؛ ملي: 120 كلوريد الصوديوم، 15 NaHCO ₃ (4)، بوكل، 1.8 و CaCl _2، 1 MgCl _2، 10 HEPES، 10 نا اللاكتات، 5 D-جلوكوز، 1 نا البيروفات، ودرجة الحموضة = 7.4) ملاحظة: تشكيل سحابة بدلا من بيليه يشير إلى أن الخلايا هي في حالة جيدة.
5. يتم تحميل خلايا الآن مع الصبغة، بل تبقى قابلة للحياة (يحتفظ بها في 37 درجة مئوية، ومحمية من الضوء) لحوالي اثنين الموارد البشرية، ويمكن استخدامها في أي من الأساليب التالية.

3. تقنية # 1. قياس التألق التقليدية (متوسط ​​معلومات من السكان زنزانة كبيرة)

المعدات: للسكان الحيوانات المنوية لدينا [كا ^{2 +]} _ط القياسات نستخدم Aminco الطيفي حركة تحرير السودان التي تشغلها البرامج OLIS (بوجارت، GA، الولايات المتحدة الأمريكية) مع مراقبة النمام المغناطيسي (SIM Aminco)، وبالإضافة إلى LED الأزرق (كسيون ستار LXHL- LB3C، من وميليدس) و465-505 نانومتر الفرقة تمرير مرشح (شركة تكنولوجيا كروما) لفلوو-03:00 الإثارة. يتم التحكم في LED من قبل امدادات الطاقة مبنية خصيصا (700 مللي أمبير). يتم قياس ضوء الانبعاثات عن طريق تعيين الطول الموجي الانبعاثات (λ _إم) إلى 525 نانومتر على مستوحد اللون على مقياس التألق الطيفي لل.

1. مكان 570 ميكرولتر من HSM ​​و 30 ميكرولتر من تعليق خلية الحيوانات المنوية (محملة مسبقا مع فلوو-3:00 ومعلق في HSM للحصول على 1X10 ⁸ خلية / مل) في أنبوب زجاجي مسطحة القاع (ID 8 × 50 مم). وضع شريط مغناطيسي داخل الأنبوب ويتم ادخال الانبوب في غرفة القراءة للالطيفي (مسخن إلى 37 ° C)، وإثارة العينة أثناء كل وقت عملية الاستحواذ.
2. بدء التجربة باستخدام البرمجيات والمعدات ل(البرمجيات OLIS في هذه الحالة)، والشروع في اكتساب القيم مضان على تردد 0.5 هرتز خلال 300 ثانية. تطبيق اختبار المركبات المطلوبة عن طريق الحقن من حجم مناسب من محلول المخزون (100X عموما أكثر تركيزا من تركيز النهائي المطلوب) باستخدام حقنة هاميلتون الصغرى كما يلي:
   1. اكتساب مضان القاعدية لمدة 30 ثانية.
   2. إضافة 4 البروجسترون ميكرومتر (PG).
   3. في 100 ثانية إضافة 20 ionomycin ميكرومتر (كعنصر تحكم إيجابية، للحصول على القيمة القصوى مضان).
3. تشغيل مراقبة سلبية بتكرار الخطوات 3.1 إلى 3.2.3 أعلاه، ولكن بدلا من إضافة خريج المذيب فقط تستخدم لحله (HSM مع 0.01٪ DMSO اللامائية).
4. تصدير الخام القيم كثافة مضان إلى Microsoft Excel وتطبيع لهم باستخدام المعادلة التالية: (F/F0) - 1. حيث F هو كثافة مضان تقاس في أي وقت من الأوقات (ر)، وF0 هو يعني مضان القاعدية التي اتخذت خلال 30 ثانية الأولي. رسم سلسلة مجموعه (F/F0) - 1 القيم مقابل الوقت (الشكل 2A). قياس الفرق بين قيم كثافة مضان قبل وبعد إضافة من المركبات اختبار (ΔF)، رسم لهم على الرسم البياني بار ومعالجة البيانات تطبيق أساليب التحليل الإحصائية المناسبة (الشكل 2B).

4. تقنية # 2. فلو توقفتW قياس التألق (معلومات مع ارتفاع الزمانية القرار من السكان زنزانة كبيرة)

المعدات: بين الخلايا [كا ^{2 +]} ويتم قياس التغيرات مع القرار الزماني عالية باستخدام SFM-20-توقف تدفق خلاط بالإضافة إلى نظام MOS-200 حركية السريع البصرية، وكلا من الصكوك العلوم البيولوجية (غرونوبل، فرنسا). ويتم تحليل جميع البيانات مع برنامج بيو Kine32 من نفس الشركة.

1. تهيئة الظروف المناسبة في المعدات، وينبغي أن تحول مصدر إضاءة على الأقل 15 دقيقة قبل البدء في التجربة؛ ضبط الإثارة وانبعاث المرشحات، وضبط مضخم إلى قيمة الجهد داخل نطاق المنشأة من قبل الشركة المصنعة توقف تدفق، وتعيين درجة حرارة الحمام عند 37 درجة مئوية.
2. ملء واحدة من الحقن الصك مع 1 مل من فلوو-3 خلايا الحيوانات المنوية AM محملة (1X10 ⁷ خلية / مل)، والحقنة الثانية مع 1 مل من مجمع لفحصها، إما HSM (المراقبة السلبية)،10 ionomycin ميكرومتر (مراقبة إيجابية) أو 10 خريج ميكرومتر الذائبة في HSM ملاحظة: في هذه الخطوة من الأهمية بمكان لتجنب تشكيل فقاعة في حين رسم السوائل في المحاقن.
3. رفع كل من المكابس الصك حتى تلمس غيض من الغطاسون حقنة.
4. ضبط معدل تدفق إلى قيمة الحد الأدنى من شأنها أن توفر استجابة قابلة للقياس من أجل تقليل تلف الخلايا. معدل تدفق نستخدمها في نظام SFM-20 هو 1 مل / ثانية ^13.
5. ضبط التردد (في هذه الحالة 10 ميللي ثانية) ومجموع وقت أخذ العينات (في هذه الحالة 50 ثانية).
6. يؤدي الخلط من الكواشف لملاحظة: بينما مشغل واحد في وقت واحد قد يتم يدويا، ومجموعة من مشغلات التلقائي متتالية قد تكون مبرمجة مسبقا أيضا.
7. يتم عرض التتبع من مضان الخام (وحدات التعسفي) مقابل الوقت على شاشة الكمبيوتر.
8. سوف اختلاط الكواشف في حد ذاتها تولد التتبع التي ليس خط مستقيم. وبالتالي، من أجل الحصول على الفعلية [كا2 +] تغير مستمدة من التحفيز، يجب أن تطرح تتبع مراقبة تم الحصول عليها من خلايا خلط مع المتوسطة (المراقبة السلبية) من كل واحد من آثار التجريبية. تحليل البيانات على النحو المطلوب؛ كما يمكن الحصول على بعض المعلمات حركية مع برنامج اكتساب الحيوية Kine32. وتظهر آثار الخام دون الطرح في الشكل 1 التكميلية للمقارنة.
9. لتغيير كاشف في المحقنة مركب اختبار، وتنظيفه على أكمل وجه مع الماء المقطر. ثم ملء المحقنة إلى أقصى حجمه مع الماء المقطر، وضعه في مكبس المقابلة من التألق توقف تدفق ودفع المياه من خلال آلية داخلية (شطف يجب توجيه المياه إلى حاوية النفايات). كرر هذه الخطوة مرتين أكثر من ذلك.
10. كرر الخطوات من 4،2-4،9، وملء الحقنة الثانية مع القادم المجمع الاختبار المطلوب.
11. في نهاية التجربة، وشطف المعدات كامل مع الماء المقطر، واستنزاف تماما المياه منخراطيم الداخلية.

5. تقنية # 3. التدفق الخلوي (معلومات خلية واحدة تم الحصول عليها من عدد كبير من الخلايا)

المعدات: هذه التقنية تسمح للقياس في وقت واحد من العديد من المعلمات في لحظة واحدة في الوقت المناسب، ولكن على عكس التقنيات السابقة، فإنه لا قياس التغيرات على مر الزمن، بل لأنها توفر القيم المعلمة في وقت القياس. لذلك، بدلا من إضافة خريج لتحريك ردا على ذلك، في هذه الحالة قمنا بقياس داخل الخلايا كا ^{2 +} المستويات في الخلايا المنوية قبل وبعد حمل وتمكين الطاقات. كنا عداد الكريات FACSCanto (بيكتون ديكنسون) وحللت البيانات مع FlowJo البرمجيات (شجرة ستار 9.3.3).

1. تحضير العينات التجريبية في أنابيب عداد الكريات عن طريق وضع 500 ميكرولتر من تعليق خلية (4x10 ⁶ خلية / مل) في أنبوب تحت كل حالة لفحصها (في هذه الحالة، عشرة شروط؛ انظر الجدول 1). جمع البيانات مضان جيئة وذهابام 10،000 الأحداث لكل عينة.
2. لإعداد تجربة استخدام البرنامج على أجهزة:
   1. إنشاء جديدة: المجلد، التجربة، عينة وعدد من الأنابيب.
   2. اختر إعدادات عداد الكريات المناسبة لفلوو-3 AM (استخدام FITC-فلوريسئين ثيوسيانات فلتر) وPI (استخدام PI-يوديد propidium فلتر).
3. تشغيل أنابيب التحكم غير ملوثين 1 و 2 في عداد الكريات. جمع FSC وSSC البيانات للتحقق من أن إعدادات عتبة مناسبة وتهيئة البوابة المقابلة من أجل تميز الحطام من الخلايا.
4. لخلق ضوابط التعويض، تشغيل عينات التحكم التالية، جمع السيارات وبيانات مضان القصوى (PI وقنوات FITC) (ملاحظة: عادة ما يتم تنفيذ هذه المهمة من قبل فني المعدات و):
   - خلايا غير ملوثين (أنابيب 1 و 2).
   - خلايا محملة فلوو-3 AM (2 ميكرومتر) (أنابيب 3 و 4).
   - الخلايا الميتة (الحيوانات المنوية علقت في 0.1٪ تريتون X-100 في HSM لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة)ملطخة PI (1.2 ميكرومتر PI، أي 0.25 ميكرولتر من 2.4 ملي PI يضاف إلى 500 ميكرولتر من تعليق الحيوانات المنوية) خلال 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، محمية من الضوء (أنابيب 5 و 6).
   • عرض البيانات المسجلة واختر بوابة للسكان المطلوب.
   • ضبط البوابة واختر "تطبيق" لجميع الضوابط التعويض.
   • حدد تجربة> إعداد تعويض> حساب التعويض.
   • إعادة تسمية الإعداد التعويض وصلة وحفظه.
5. تشغيل جميع أنابيب التجريبية (في هذه الحالة، وأنابيب 7-10). في النهاية، تصدير جميع البيانات إلى البرامج المتاحة للتحليل (انظر الخطوة 5.6).
6. تحليل نتائج كل تجربة باستخدام البرمجيات والمعدات، فإن FlowJo البرمجيات المتاحة تجاريا أو البرمجيات الحرة Cytobank ( http://www.cytobank.org/ ).

6. تقنية # 4. التصوير خلية واحدة (واحدة معلومات الخليوي مع ارتفاع القرار المكانية)

المعدات:. المنحوتة التصوير مجموعة المتابعة وتتكون لدينا التصوير مجموعة المتابعة لمقلوب نيكون Diaphot 300 المجهر مجهزة مع وحدة تحكم في درجة الحرارة (شركة نظام الطبية، Greenvale، NY)، نيكون PlanApo 60X (1.4 NA الغمر النفط) الهدف. يتم توفير الإضاءة مضان من قبل كسيون V ستار Lambertian سماوي LED جزء # LXHL-LE5C (وميليدس إضاءة LLC، سان خوسيه، كاليفورنيا) تعلق على مربع التحكم اصطرابي مبنية خصيصا. شنت LED في الجمعية FlashCube40 مع مرآة مزدوج اللون M40-DC400 (راب علم البصريات الالكترونية، هامبورغ، ألمانيا) (عرض الموجات: الإثارة 450-490 نانومتر، مزدوج اللون مرآة 505 نانومتر، وانبعاث 520-560 نانومتر). وقد تزامن خرج الصمام إلى التعرض خارج إشارة من كاميرا CCD التقط كول عن طريق السيطرة على المربع لإنتاج ومضة واحدة من 2 ميللي ثانية في مدة التعرض الفردية. تم ضبط الوقت التعرض كاميرا معادلة لمدة فلاش (2 ميللي ثانية). يتم جمع الصور في كل 250 ميللي ثانية (أو قد يتم تعديلها وفقا للالقرار الزماني المطلوب) باستخدام برنامج IQ (أندور Bioimaging، ويلمنجتون، NC).

1. إعداد زلات تغطية الجولة (القطر = 25 ملم) من خلال تطبيق قطرة 5 ميكرولتر من محلول بولي-L-يسين (0.01٪ W / V) على المركز. السماح لها الوقوف لمدة 1 ساعة على الأقل (قد تجف). باستخدام زجاجة بخ شطف المنطقة المعالجة بالماء قبل الاستخدام. وهذا الإجراء يسمح للخلايا الحيوانات المنوية على الانضمام إلى زلة تغطية من رؤوسهم، بينما السوط، يستطيع أن لا تزال تتحرك.
2. إعداد المركبات لفحصها عن طريق تذويب لهم في HSM وفقا للجدول 2. تضاف المركبات بالتتابع في نفس غرفة تسجيل، والتأكد من أن تضيف دائما نفس وحدة التخزين، وضبط تركيز محلول المخزون مع الأخذ بعين الاعتبار التخفيف سيكون لها عند مزجه مع حجم موجودة بالفعل في الدائرة (كما هو مبين في الجدول 2). إبقاء جميع الحلول اختبار في حمام عند 37 درجة مئوية حتى يتم استخدامها.
3. تجميع زلة تغطية داخل RECORDING غرفة ومكان 10 ميكرولتر من فلوو-3 خلايا AM محملة (1 X10 ⁷ خلية / مل) في المركز. تغطية الخلايا مع 200 ميكرولتر من HSM قبل تحسنت.
4. ضع دائرة على مسرح المجهر قبل ساخنة إلى 37 درجة مئوية، وعرض الخلايا (باستخدام تباين الطور) وتحديد منطقة للتصوير. فمن المهم لتحديد منطقة حيث كثافة الخلية المناسب (انظر الشكل 5A)، وكثير جدا من الخلايا جعل التحليل صعبة بسبب تداخل الاشارات ملاحظة: خلايا ينبغي أن ترتبط بقوة مع انزلاق الغطاء من قبل رؤوسهم ولكن العارضة حركة سوطي، وهو ما يؤكد. جدوى.
5. الحصول على صور مضان في وضع الحية لضبط التركيز والسطوع.
6. تبدأ التجربة من خلال تفعيل صورة سلاسل زمنية برنامج الحصول على (IQ في هذه الحالة). وعادة ما يتم الحصول على أربع صور في الثانية الواحدة مع إضاءة من 2 ميللي ثانية لكل صورة.
7. استخدام micropipette لإضافة بعناية (قطرة من الحكمة) مجمع اختبار (PG في هذه الحالة)، لا تزال ايماجاكتساب ه على النحو المطلوب وتنفيذ اثنين من الإضافات مراقبة متتابعة في نفس الدائرة: (1) 20 ميكرومتر ionomycin للحصول على أقصى قدر من مضان و (2) 5 ملم MnCl ₂ للحصول على الحد الأدنى مضان. بدلا من ذلك، يمكن إضافة مركبات باستخدام غرفة التروية الذي يقدم مزايا تمكين إزالة الحوافز، والقدرة على يستحم بشكل موحد الخلايا مع المجمع. وفي الوقت نفسه، فإنه لا يكون مساوئ التي تتطلب كميات أكبر من الحل، وجعل التحكم في درجة الحرارة أكثر إشكالية.
8. كرر الاستحواذ في غرفة جديدة مع كل مركب الاختبار المطلوب.
9. إجراء تحليل على الانترنت صورة باستخدام البرمجيات والمعدات، أو حاليا إما باستخدام برامج الذكاء أو صورة J مجانية. رسم المناطق ذات الاهتمام (رويس) حول كل خلية (أو جزء من الخلية)، وكذلك تحديد منطقة خالية من الخلايا (على سبيل التلقائي خلفية الطرح من قبل البرنامج). ثم يتم الحصول على سلسلة زمنية كثافة مضان لكل عائد الاستثمار وهذه أماه البياناتY يتم تصديرها إلى Microsoft Excel لمزيد من التحليل. نحن تطبيع قيم كثافة مضان باستخدام المعادلة التالية: (F/F0) - 1. حيث F هو كثافة مضان تقاس في أي وقت من الأوقات (ر) وF0 هو مضان يعني اتخذت خلال 30 ثانية الأولي. رسم سلسلة مجموعه (F/F0) - 1 مقابل الوقت (الشكل 5B). ويمكن أيضا أن تطبيع القيم باستخدام قيمة مضان الحصول عليها بعد إضافة ionomycin إلى 100٪.
10. تحليل الصورة قد وبدلا من أن يقوم باستخدام صورة J البرمجيات الحرة.

تقنية # 1. قياس التألق التقليدية

البروجسترون هو واحد من المحرضات المعروفة AR و، كما هو متوقع، فإنه لا يثير عابر [كا ^{2 +]} _ط زيادة في الحيوانات المنوية البشرية (كما هو موضح في الشكل 2). إضافة حامل الأيون الكالسيوم (ionomycin) يتسبب في أقصى [كا ^{2 +]} _ط الزيادة، والتي لا تعود إلى مستويات القاعدية.

تقنية # 2. Sقياس التألق تدفق تصدرت

البروجسترون التي يسببها [كا ^{2 +]} وقد تم قياس الزيادة _أنا كما كان من قبل (قياس التألق التقليدية)، ولكن هذه المرة مع أكبر القرار الزماني، وكان تردد من الحيازة في هذه الحالة 0.1 هرتز. كما هو مبين في الشكل (3)، وتسبب كلا البروجسترون (عابر، خط أحمر) وionomycin (، الخط الأزرق مستمر) سريع جدا [كا ^{2 +]} _ط زيادة. لعدم وجود تأخير في هرمون البروجسترون التي يسببها [كا ^{2 +]} ط زيادة يتسق مع التقارير السابقة تشير إلى أن هرمون البروجسترون ينشط بشكل مباشر على كا ^{2 +} قناة CatSper، دون وسيط إشارات ^10،14.

تقنية # 3. التدفق الخلوي

[كا ^{2 +]} _ط وقد تم قياس في الحيوانات المنوية البشرية باكتسابها وغير باكتسابها. كما ذكرت سابقا في الماوس ^15، الحيوانات المنوية بقري ¹⁶ و ¹⁷ المنوية البشرية، لاحظنا أيضا زيادة [C(أ) ^{2 +]} _ط في باكتسابها مقارنة مع الحيوانات المنوية البشرية من غير باكتسابها. ذكرت بالدي، وآخرون (1991) ¹⁷ أعلى القاعدية [كا ^{2 +]} ط في باكتسابها من الحيوانات المنوية في الإنسان غير باكتسابها باستخدام قياس التألق التقليدية. في هذا العمل استخدمنا التدفق الخلوي لقياس [كا ^{2 +]} _ط قبل وبعد تمكين الطاقات في المختبر. التدفق الخلوي تمكننا أن نرى أن توزيع القيم مضان عن الحيوانات المنوية باكتسابها (الشكل 4D، تتبع الأزرق) هو تحولت إلى قيم أعلى مقارنة مع الحيوانات المنوية غير باكتسابها (الشكل 4D، التتبع الحمراء). ويمكن ملاحظة القيم مضان لكل خلية فردية في المؤامرات دوت ثنائي الأبعاد هو مبين في الشكل 4G؛ الأهم من ذلك أن إشارة الناشئة من الخلايا الميتة (15٪ تقريبا) يمكن القضاء عليها (4G الشكل، الأرباع العليا).

تقنية # 4. التصوير خلية واحدة

البروجسترون-لحثد [كا ^{2 +]} _ط وقد تم قياس التغير في خلايا الحيوانات المنوية واحد. بالإضافة إلى ذلك البروجسترون يسبب زيادة في [كا ^{2 +]} _ط على حد سواء في الرأس الحيوانات المنوية وفي السوط. كما لوحظ في التجارب السكان، وكشف تحليل خلية واحدة عابرة وزيادة مطردة لهرمون البروجسترون، وionomycin، على التوالي.

النتائج

الشكل 1. ويوضح الرسم التخطيطي للبروتوكول تجريبي لعينة الحيوانات المنوية من خلال طريقة إعداد حمام السباحة. الخطوات الرئيسية لفصل الحيوانات الم?...

Discussion

إشارات بين الخلايا هو أمر حيوي لمعظم الأنشطة الخلوية؛ كا ^{2 +} هو رسول في كل مكان التي ترافق خلايا الثدييات في جميع أنحاء كامل حياتها، من أصلهم في التسميد، إلى نهاية دورة حياتها. في استجابة للمؤثرات مختلفة، [كا ^{2 +]} ط الزيادات، يتذبذب والنقصان مع تدوين المكاني?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5x5 ml