JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويرد طريقة لإعادة تشكيل نموذج صفائف النووي nucleosomal من histones الأساسية المؤتلف والحمض النووي المتكررة tandemly النيوكليوسومات تحديد المواقع. نحن تصف أيضا كيفية استخدام التجارب الترسيب السرعة في نابذة فائقة السرعة التحليلية، والقوة الذرية المجهري (AFM) لمراقبة مدى النووي nucleosomal مجموعة التشبع بعد إعادة.

Abstract

وتسمى octamers هيستون الأساسية التي يتم متباعدة بشكل متكرر على طول جزيء الحمض النووي صفائف النووي nucleosomal. ويتم الحصول على صفائف النووي nucleosomal في واحدة من طريقتين: تنقية من مصادر في الجسم الحي، أو إعادة في المختبر من histones الأساسية المؤتلف والحمض النووي المتكررة tandemly النيوكليوسومات تحديد المواقع. الأسلوب الأخير له فائدة السماح لتجميع موحدة أكثر إنشائي ومجموعة النووي nucleosomal ضعه على وجه التحديد. تجارب الترسيب السرعة في المعلومات التحليلية العائد نابذة فائقة السرعة حول حجم وشكل الجزيئات من خلال تحليل المعدل الذي تهاجر من خلال حل تحت قوة الطرد المركزي. هذه التقنية، جنبا إلى جنب مع القوة الذرية المجهر، ويمكن استخدامها لمراقبة الجودة، وضمان أن غالبية قوالب الحمض النووي ومشبعة Nucleosomes للإعادة بعد. نحن هنا تصف البروتوكولات اللازمة لإعادة كميات مليغرام من طول ود إنشائيصفائف النووي nucleosomal efined مناسبة للدراسات الفيزيائية الحيوية والكيمياء الحيوية وهيكل لونين وظيفة.

Introduction

الجينوم حقيقية النواة لا وجود الحمض النووي عارية كما، بل يتم ضغط ونظمته البروتينات ملزمة. وتعرف هذه المجمعات من الحمض النووي والبروتينات من لونين. الوحدة الأساسية للمكرر لونين هو جسيم نووي. يتكون جسيم نووي من octamer هيستون و 146 أزواج قاعدة الحمض النووي ملفوفة حول octamer هيستون نحو 1.6 مرات 1. يتكون octamer هيستون من نسختين كل من H2A histones الأساسية، H2B، H3، H4 و. وتسمى octamers هيستون الأساسية التي يتم متباعدة بشكل متكرر على طول جزيء الحمض النووي صفائف النووي nucleosomal. وقد أشار هيكل ممتدة من صفائف النووي nucleosomal على أنها الألياف 10 نانومتر أو "الخرز على سلسلة" هيكل وموجود في المختبر تحت ظروف الملح منخفضة 2. الألياف 10 نانومتر قادر على التكثيف في هياكل النظام من خلال الضغط العالي داخل مجموعة و / أو بين مجموعة oligomerization 2. هذه الهياكل أعلى لكي يمكن أن يتسبب في وجود الأملاح،أو يمكن أن تتأثر من خلال الربط من البروتينات المعمارية لونين لمجموعة النووي nucleosomal 3،4. ترتبط مستويات ونين الضغط عكسيا مع معدل النسخ في الجسم الحي 5،6. يسلط الضوء على البحوث التي أجريت مؤخرا على أهمية التنظيم الهيكلي من الجينوم في عمليات مثل التمايز، تطور مرض السرطان، وغيرهم 7،8. أصبح استخدام صفائف النووي nucleosomal لدراسة بنية الكروماتين وظيفة على نطاق واسع. نحن هنا تصف طريقة لتجميع صفائف النووي nucleosomal من histones الأساسية المؤتلف الحمض النووي وتحديد المواقع جسيم نووي.

باستخدام الحمض النووي المؤتلف مع يكرر جنبا إلى جنب من تسلسل المواقع النيوكليوسومات يسمح لإعادة تشكيل المصفوفات التي تحتوي على Nucleosomes للمتباعدة بصورة منتظمة. اثنين من متواليات تحديد المواقع أكثر شعبية هي تسلسل الجين 5S الريباسي و "601" 9،10 التسلسل. تم اشتقاق تسلسل 601 من التجارب سيليكس وموره المواقف بقوة Nucleosomes للمن تسلسل 5S 11. وبالتالي فإن طول الحمض النووي رابط من صفائف 601 هو أكثر تجانسا. يتم الحصول على الحمض النووي المتكررة Tandemly المواقع النيوكليوسومات بواسطة هلام 4،12 الترشيح. يتم تنقيته الهستونات المؤتلف من E. القولونية في ظل ظروف تغيير طبيعة 13. استخدام الهستونات المؤتلف يسمح احد للسيطرة بعناية تكوين هيستون من صفائف النووي nucleosomal. على سبيل المثال، الأساسية الهستونات تحمل طفرات محددة 14 أو التعديلات بعد متعدية 15،16 يمكن أن تكون بديلا عن النوع البري histones الأساسية.

تجارب الترسيب سرعة رصد معدل الترسيب من الجزيئات في محلول تحت قوة الطرد المركزي التطبيقية 17. هذا يعطي معلومات حول حجم وشكل الجزيئات في عينة. تجارب الترسيب السرعة وبالتالي أداة مناسبة لدراسة التغيرات في حل الدولة ألياف الكروماتينهيكل بسبب التكثيف لونين 18. الأهم من ذلك، فمن الضروري أولا لاستخدام الترسيب التجارب سرعة كخطوة لمراقبة الجودة في مجموعة إعادة النووي nucleosomal. إذا لم يتم الجمع بين الحمض النووي وNucleosomes للفي نسبة المولي الصحيح، قد يكون صفائف أقل أو أكثر مشبعة histones الأساسية. وبالتالي، يتم استخدام المعلومات المكتسبة من التجارب سرعة الترسيب لضمان أن الحمض النووي غير المشبعة بشكل صحيح مع Nucleosomes لل. من المهم استخدام طرق بديلة لتقدير التشبع من الحمض النووي مع Nucleosomes لل، وخاصة إذا كان يعمل مع قالب الحمض النووي uncharacterized سابقا. لذلك، نحن أيضا تصف طريقة لتحليل المصفوفات النووي nucleosomal باستخدام القوة الذرية المجهري (AFM). فؤاد هو أسلوب القوية التي تسمح برؤية آثار عدد من المعلمات، مثل مستوى التشبع، تأثير وجود متغيرات هيستون أو آثار MgCl 2 19،20. وكان فؤاد أيضا تطبيق صحيفةإد لدراسة ديناميات النيوكليوسومات باستخدام الفاصل الزمني التصوير 21. تجميعها في المختبر النووي nucleosomal صفائف 12 مير قابلة خاص للدراسات فؤاد لأنها تنتمي في مجموعة الحجم المناسب للتصوير فؤاد 22. في هذه الدراسة وقد استخدمنا فؤاد صفائف النووي nucleosomal باعتباره مراقبة الجودة وكذلك وسيلة لتأكيد البيانات من الجامعة الأمريكية بالقاهرة ("المشاهدة خير برهان"). بالإضافة إلى التصور بسيطة، فؤاد يسمح قياس ملامح ارتفاع عينات بوصفها متري إضافية.

Protocol

1. جمعية المؤتلف الأساسية الهستونات في Octamers

الأساس المنطقي: إن الخطوة الأولى في إعادة النووي nucleosomal مجموعة هو إعداد الأم octamers هيستون الأساسية من مجفف بالتجميد histones الأساسية المؤتلف. يتم الجمع بين البروتينات هيستون بكميات متساوية المولي وتجميعها في octamers هيستون بواسطة dialyzing العينات من منطقة عازلة في تغيير طبيعة طوي ثانية العازلة.

  1. تنقية ويجفد histones الأساسية المؤتلف (H2A، H2B، H3، H4) كما هو موضح 13.
  2. حل ما يقرب من 5 ملغ من كل هيستون الأساسية مجفف بالتجميد في 3 مل من العازلة تتكشف (6 M guanidinium حمض الهيدروكلوريك، 20 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 5 ملي DTT). تسمح لكل قسامة حل لساعة واحدة على الأقل. ضمان عدم وجود البروتين يبقى على جانبي الحاوية.
  3. قياس الامتصاصية من كل هيستون في 276 نانومتر باستخدام تتكشف العازلة كمرجع.
  4. حساب المولية كل هيستون باستخدام معاملات انقراضها (انظر الجدول 1 لالقيطم معاملات هيستون الانقراض). مقارنة تركيز الامتصاصية تحديد من هيستون إلى الوزن الجاف مجفف بالتجميد، والتقدير إذا تم حل غالبية البروتين.
  5. تحديد أي هيستون لديك أقل عدد مولات، لأن هذا سوف يكون عدد يحد من الشامات لجميع الهستونات.
  6. الجمع بين الهستونات بكميات متساوية المولي وتمييع مع تتكشف عازلة لتركيز النهائي من 1 ملغ / مل.
  7. وضع العينة إلى 6-8 كيلو دالتون MWCO أنابيب غسيل الكلى. ختم الأنابيب ومكان في 2 L من العازلة طوي ثانية الباردة (2 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA، 5 ملي β-المركابتويثانول).
  8. Dialyze العينة لمدة 18 ساعة في 4 درجات مئوية مع التحريك. ضمان أنابيب غسيل الكلى يمكن أن تدور بحرية وبقوة، وإلا فإن الهستونات قد يعجل.
  9. تغيير العازلة غسيل الكلى مرتين في فترة 18 ساعة (أي تغيير المخزن المؤقت طوي ثانية عن كل 6 ساعة حتى يتم). حتى لو تم تشكيل راسب لا تجاهلالعينة، يمكن استعادة بعض octamer على الرغم من سيتم انخفض العائد.

ملاحظة: راجع الخطوة 2،1-2،2 لإعداد موازنة عمود لليوم التالي.

2. تنقية هيستون Octamers حسب حجم الاستبعاد اللوني

الأساس المنطقي: بعد الختامية للقسم 1، وسوف تحتوي على عينات octamers هيستون وكذلك المجمعات هيستون أخرى مثل الركام، tetramers H3/H4، وdimers H2A/H2B. سيتم تنقيته octamers هيستون بعيدا عن هذه المجمعات الأخرى باستخدام اللوني استبعاد حجم (SEC).

  1. توصيل HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 (S200) العمود إلى نظام FPLC. التأكد من أن فقاعات الهواء لا تدخل في النظام.
  2. تنظيف العمود S200 مع 0.2 ميكرون تصفية المياه. استخدام معدل تدفق 0.3 مل / دقيقة ووضع حد الضغط الخلفي من 0.5 ميجا باسكال. ضمان أن يكون لديك ما يكفي من المياه وتسمح للعمود لتنظيف بين عشية وضحاها.
  3. يوازن S200 العمود وعينة حلقة من FPLC باستخدام طوي ثانية العازلة. استخدام 1 لتر من 0.2 ميكرون تصفية العازلة طوي ثانية. تدفق طوي ثانية العازلة من خلال العمود بمعدل 1 مل / دقيقة وضغط الحد الأقصى 0.5 ميجا باسكال لحوالي 2 ساعة.
  4. تتوازن مكثف الطرد المركزي Vivaspin (50 كيلو دالتون MWCO) مع 1 مل من العازلة طوي ثانية. إزالة عينة من أنابيب غسيل الكلى وأجهزة الطرد المركزي العينة عند 4 درجة مئوية لإزالة أي رواسب. ماصة العينة طاف في المكثف. تركيز العينة إلى وحدة تخزين ما يقرب من 500 ميكرولتر.
  5. إزالة عينة octamer المركزة إلى حاوية جديدة وشطف المكثف مع 1 مل طوي ثانية العازلة. التركيز على شطف وصولا الى 500 ميكرولتر، وإضافته إلى نموذج octamer. وهذا يساعد على إنقاذ أي octamer المتبقية في المكثف.
  6. تدور العينة في أنبوب microfuge 1.5 مل لمدة 5 دقائق عند 10،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. جمع طاف ونقل إلى أنبوب جديد. وهذا يساعد على إزالة أي راسب قبل تحميل العينة على قوات التحرير الشعبيةC.
  7. تحميل العينة على العمود S200. تحميل كحد أقصى 1.5 الحجم الكلي مل أو 15 ملغ octamer في تنقية واحد.
  8. أزل العينة باستخدام تقدم طازجة العازلة طوي ثانية. استخدام معدل التدفق من 1 مل / دقيقة وحد الضغط الخلفي من 0.5 ميجا باسكال. استخدام مجلدين العمود (400 مل) طوي ثانية العازلة وجمع 2 مل الكسور. رصد الامتصاصية في 280 نانومتر خلال شطف. فإن الأنواع المختلفة أزل في المرتبة الثانية من حيث الحجم. المجاميع هيستون عادة أزل في حوالي 45 مل، octamer في حوالي 65 مل، وديمر في حوالي 84 مل (الشكل 1).
  9. تحليل الكسور شطف من قمم الفائدة عن طريق تشغيل العينات على 18-20٪ SDS-PAGE. يجب أن تحتوي على كسور octamers تنقيته لديها كميات متساوية من المولي البروتينات هيستون الأساسية الأربع (الشكل 1).
  10. تجمع الكسور التي تحتوي على octamers تنقيته، والتركيز إلى ≤ 15 ملغ / مل مع فلتر الطرد المركزي Vivaspin. إذا تركت مخفف، قد octamers تنأى طdimers n لH2A/H2B وtetramers H3/H4.
  11. تحديد تركيز octamer عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر وباستخدام حساب معامل الانقراض من الجدول رقم 1.
  12. octamers هيستون يمكن أن تبقى على المدى القصير في طوي ثانية العازلة عند 4 درجات مئوية. إذا يجري تخزينها على المدى الطويل، فإن octamers يكون أكثر استقرارا في -20 درجة مئوية و في حل الجلسرين 50٪. وينبغي مدال Octamers المخزنة في الجلسرين إلى المخزن المؤقت طوي ثانية الطازجة قبل قياسات الامتصاصية واستخدامها في مجموعة reconstitutions النووي nucleosomal.

3. إعادة تشكيل النووي nucleosomal صالحة من الحمض النووي وتنقية Octamers

الأساس المنطقي: إعادة تشكيل المصفوفات النووي nucleosomal يتطلب أن octamers هيستون والحمض النووي القالب تكون مجتمعة في نسب المولي محددة. خليط من octamers الحمض النووي وهيستون في 2 M كلوريد الصوديوم هي خطوة مدال في مخازن من تناقص القوة الأيونية. والتغيير التدريجي لانخفاض الملح يضمن تشكيل النيوكليوسومات المناسبة. الحصول على نصفائف ucleosomal مع المستوى المطلوب من octamer هيستون التشبع من الحمض النووي القالب يتطلب الصغيرة reconstitutions اختبار على نطاق وتليها إعادة التحضيرية على نطاق واسع. وتستخدم الظروف الملائمة التي يحددها reconstitutions الصغيرة لتوجيه إعادة التحضيرية.

  1. تنقية المتكررة tandemly جسيم نووي DNA لتحديد المواقع كما هو موضح 4،12. لفترة وجيزة، عزل الحمض النووي البلازميد باستخدام عدة في Qiagen GigaPrep أو منتج مماثل. انشاء تقييد انزيم الهضم من أجل الإفراج عن الحمض النووي القالب وهضم الحمض النووي البلازميد إلى أحجام أصغر (≤ 700bp). ويمكن بعد ذلك أن الحمض النووي القالب تنقية بعيدا عن بقايا الحمض النووي البلازميد صغيرة باستخدام اللوني استبعاد حجم (SEC). A خطورة تغذية العمود، مع ارتفاع حوالي 115 سم معبأة مع Sephacryl حبات S-1000 غير كافية لتنقية من 601 207bp س الحمض النووي 12mer.

ملاحظات: لتنقية الحمض النووي البلازميد بتكلفة انخفضت ولكن زيادة ممثل المؤسسةأورط، يمكن للمرء استخدام قلوية تحلل مع تنقية الحمض النووي الفينول / الكلوروفورم من أجل عزل DNA البلازميد من E. القولونية 23،24. قد تختلف استراتيجيات لفصل القالب الحمض النووي DNA البلازميد من مع التغيرات في حجم القالب الحمض النووي. لSEC من المهم لإعداد تقييد انزيم الهضم بطريقة الأمر الذي سيزيد من الفرق في الحجم بين القالب والحمض النووي البلازميد.

  1. تحديد أي نسب المولي (ص) لاستخدامها لreconstitutions. ص يساوي نسبة مولات octamer إلى الشامات من تكرار الحمض النووي. للمحاكمات أولية على نطاق صغير، والقيم ص 0.9، 1، و 1.1 مناسبة إذا كان القصد من ذلك هو الحصول على صفائف النووي nucleosomal المشبعة.
  2. تحضير العينات الصغيرة عن طريق حساب كمية octamer إضافة إلى ما يقرب من 18 ميكروغرام من الحمض النووي لكل نسبة المولي لفحصها. خلط الحمض النووي وoctamers هيستون. تركيز النهائي من كلوريد الصوديوم في العينة ينبغي ≥ 2 M، وتركيز النهائي من DNA يجب أن يكون حول 0.3 ميكروغرام / ميكرولتر. وينبغي أن تتضمن الشروط النهائية عينة العازلة أيضا 10 ملي تريس درجة الحموضة 7.8، 1 ملم EDTA و.
  3. العينات هي الآن جاهزة للغسيل. تحميل العينات في 12K-14K MWCO أنابيب غسيل الكلى. Dialyze العينات ضد 2L من العازلة من تناقص القوة الأيونية على النحو التالي.

مكونات في جميع مخازن: 10 ملي تريس درجة الحموضة 7.8، 1 ملم EDTA. العازلة 1 (إضافة 1 M كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT) لمدة 5-6 ساعة. العازلة 2 (إضافة 0.75 M كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT) بين عشية وضحاها. العازلة 3 (إضافة 2.5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT) لمدة 5-6 ساعة. العازلة 4 (إضافة 2.5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي PMSF) بين عشية وضحاها.

  1. إزالة عينات من أنابيب غسيل الكلى، والشروع في أقسام 4-6. إذا كانت العينات صغيرة الحجم تسفر عن النتائج المرجوة، كرر الخطوات في المقاطع 3-6 على نطاق واسع.

ملاحظة: من أجل الحفاظ على الموارد، وينبغي أن يكون الحد الأدنى العينات الصغيرة الحجم اللازمة لتكفي لفحوصات الكشف المصب. من أجل أن يكون البريدnough عينة لسرعة الترسيب وفؤاد التجارب المذكورة هنا، 50 عينة ميكرولتر في 0.3 ملغ / مل DNA مناسبة. حجم نطاق واسع، وعينات التحضيرية تعتمد على استخدام المقصود منها. وينبغي إعداد العينة على نطاق واسع في نفس الطريقة كما العينات الصغيرة.

4. تحليل الترسيب السرعة من المعاد النووي nucleosomal صالحة

الأساس المنطقي: تجارب سرعة الترسيب في بيكمان XL-A / أنا عائد المعلومات التحليلية نابذة فائقة السرعة على حجم وشكل الجزيئات في الحل. وتستخدم التجارب الترسيب سرعة تنفيذ في ظل ظروف الملح منخفضة لتحديد مدى المشبعة صفائف المعاد مع Nucleosomes لل.

  1. تمييع العينة إلى نحو 0.5 الامتصاصية في 260 نانومتر باستخدام TEN العازلة (10 ملي تريس درجة الحموضة 7.8، 1 ملم EDTA، 2.5 ملي مول كلوريد الصوديوم). تحميل 400 ميكرولتر من العينة في خلية مع محور القطاع اثنين، مع عينة على جانب واحد في استفتاء وم (TEN العازلة) على 25 أخرى. الحفاظ على الغضروف المفصلي مرجعية أعلى من العينة الغضروف المفصلي (أي إضافة 420 ميكرولتر حل المرجعية).
  2. تحميل الخلايا في الدوار، ومحاذاة الخلايا باستخدام علامات التجزئة بشكل صحيح على الجزء السفلي من الخلايا والدوار 25. نفض الغبار بلطف العدسات من الخلايا باستخدام الهواء المضغوط.
  3. بدوره على جهاز الطرد المركزي XL-A/XL-I، إدراج الدوار، ونعلق وتأمين البصريات كما هو موضح في الدليل. افتح البرنامج بروتيوم مختبر وحدد ملف: جديد.
  4. إعداد مسح المدى واحد في 3،000 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة 25 درجة مئوية. ضمن خيارات، حدد توقف بعد مسح الماضي، وتشغيل شعاعي المعايرة (المعايرة شعاعي غير ضرورية إذا كان الدوار الدوار مشاركة المستخدمة في AUC).
  5. لكل خلية، اسم العينات، تحديد الطول الموجي (260 نانومتر)، حدد الامتصاصية، واختيار موقع حفظ الملف على جهاز الكمبيوتر الخاص بك. بدء تشغيل المسح الضوئي واحدة.
  6. استخدام المسح الضوئي واحدة لتحديد را المناسبةالاتصال الهاتفي طول المسح الضوئي (الشكل 2A). تناقص طول الخلية التي سيتم فحصها يقلل من وقت التشغيل. ومع ذلك، ومن المؤكد أن تشمل العينة الغضروف المفصلي وتمديد نهاية قريبة جدا، أو في الجزء السفلي من الخلية.

ملاحظة: بالاشعة واحدة تسمح للمنطقة القياس ليتم تقصير من قبل القياسات بدأت للتو قبل الغضروف المفصلي العينة (الشكل 2A). وينبغي أن يكون معظم بالاشعة ولدت خلال المدى AUC الكسور الحدود الماضية الغضروف المفصلي وكذلك الهضاب مستقرة (الشكل 2B). يمكن أن العدسات القذرة على الخلايا AUC توليد بالاشعة مع المسامير الكبيرة، وهذه قد تؤثر على تحليل البيانات. يتضمن البرنامج UltraScan دليل الذي هو كبير من الموارد للحصول على معلومات بشأن تحليل البيانات التحليلية تنبيذ فائق 26.

  1. باستخدام لوحة التحكم XL-A/XL-I، أدخل بسرعة 0 وبداية الصحافة. وهذا يدفع للغرفة الطرد المركزي لسحب فراغ وجميعآه درجة حرارة الغرفة لكي تتوازن. 1 ساعة الانتظار للسماح للموازنة درجة الحرارة قبل البدء في التشغيل.
  2. استخدام البرنامج لتعيين ما يصل المدى للسرعة المطلوبة وعدد من بالاشعة. سرعات أعلى زيادة القرار، ولكن ينبغي للمرء أن جمع ما لا يقل عن 20 بالاشعة (يفضل أكثر) قبل أن الرسوبية العينة إلى أسفل الخلية. أنها مريحة لتراكب مشاركة العديد من عمليات التفحص (أنجز في قائمة الخيارات) من أجل رصد التقدم المحرز في المدى والتحقق من المشاكل المحتملة مثل الخلايا تسرب. رصد أول زوجين من بالاشعة لضمان التشغيل السليم.

5. تحرير وتحليل البيانات سرعة الترسيب

الأساس المنطقي: ينبغي تحليل بيانات سرعة الترسيب الخام باستخدام برنامج التي تعطي توزيع معامل الترسيب لتصحيح نشرها. هذه المعلومات بدوره يدل على جزء من العينة المعاد الذي يحتوي مستوى التشبع معين، على سبيل المثال في حالة استخدام قالب الحمض النووي 12 مير سيكون من الممكن لتحديد جزء من صفائف المعاد الذي لديه 10 و 11 و 12 Nucleosomes لل/ الحمض النووي.

  1. استخدام AUC برامج تحليل البيانات مثل UltraScan لتحرير البيانات 26. يجب أن يتم تحرير بيانات مسح لكل خلية ويخلق مجموعة من البيانات لتحليلها لاحقا. تحرير السليم بالاشعة ينطوي على تحديد عينة الغضروف المفصلي، مما يقلل من البيانات إلى المنطقة من الفائدة، وتحديد خط الأساس وكذلك المناطق الهضبة (الشكل 2). يمكن أيضا إزالة بالاشعة غير المرغوب فيها من مجموعة البيانات في هذه المرحلة. ومع ذلك، لأنه من الممكن إزالة بالاشعة غير المرغوب فيها أثناء التحليل، فمن المستحسن أن جميع عمليات الفحص أن تبقى عند هذه النقطة.
  2. ونحن نوصي بشدة أن تعزيز فان طريقة Holde-Weischet استخدامها لتحليل البيانات 27. يصحح هذا الأسلوب تحليل لآثار الانتشار على مدى المدى وتعطي توزيع يتجزأ من معاملات الترسب. بخاصةوعزز فان طريقة Holde-Weischet (كما نفذت في UltraScan) سوف تسمح لإدراج بالاشعة التي تفتقر الهضاب مستقرة، أو التي تحتوي على كسور الحدود التي لم مسح الغضروف المفصلي في التحليل 28.
  3. تحديد توزيع معاملات الترسيب لصفائف تجميعها. وتظهر نتائج ممثلة ل601-12 (207bp، 12 مير) صفائف النووي nucleosomal في الشكل 3.
  4. إذا كان واحد من العينات على نطاق صغير يحتوي على صفائف مع مجموعة المرجوة من معاملات الترسب، ثم كرر العملية على نطاق زيادة بدءا من القسم 3. إذا كان أي من العينات الصغيرة لديها التوزيع السليم للمعاملات الترسيب ثم كرر الاختبارات على نطاق صغير مع مجموعة ص بدءا في القسم 3.

6. تصور النووي nucleosomal صالحة باستخدام القوة الذرية مجهرية (فؤاد)

الأساس المنطقي: فؤاد يسمح التصور من مستوى التشبع من nucleosomaصفائف لتر. هذه التقنية سرعة الترسيب يكمل من قبل مفوضية الاتحاد الأفريقي وتقييد انزيم الهضم كما مقايسة مراقبة الجودة.

  1. باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه، الحصول على مجموعة النيوكليوسومات المشبعة جيدا (الشكل 5A).
  2. إعداد APTES معاملة الشرائح الميكا عن طريق وضع ~ 30 ميكرولتر 1:1،000 التخفيف من التجارية (سيغما الدريخ (3 أمينو) triethoxysilane A3648-100ML) في 0.22 ميكرون تصفية المياه nanopure لمدة 30 دقيقة.
  3. بعد 30 دقيقة شطف APTES قبالة مع الماء المصفى وتجفيفها بلطف في تدفق النيتروجين.
  4. وضع المخفف بشكل مناسب عينة مجموعة النيوكليوسومات (~ 1.5 نانوغرام / ميكرولتر) على الشريحة، واحتضان مغطاة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  5. شطف قبالة مع أخذ عينات تصفيتها عينة العازلة، تجف كما كان من قبل، والشريحة مكان على مسرح فؤاد (في هذه الحالة اللجوء إلى البحوث MFP-3D مجهر القوة الذرية).
  6. تبدأ من خلال التصوير 2 × 2 ميكرومتر بمسح مع 512 خطوط المسح. حساب عدد Nucleosomes للللتأكد من مستوى ساturation (الشكل 5B).
  7. من الناحية المثالية يجب عليك مساحات الصورة على الشريحة مع صفائف النيوكليوسومات فصل جيدا.
  8. للصور دقة أعلى، وهو نانومتر مسح 500 X 500 ويمكن الحصول على (الشكل 5C).
  9. يمكن أن كان صور بالارض وتحليلها باستخدام برنامج 3D-MFP التي تقدمها اللجوء.
  10. ويمكن تقسيم كل صورة إلى أربعة أجزاء والتكبير رقميا للحصول على رؤية أكثر وضوحا من صفائف فصل جيدا ومتعددة خطوط اليد الحرة التي يمكن استخلاصها من خلال المصفوفات وملامح ارتفاع ويتم الحصول على لNucleosomes لل(الشكل 5C، والحق وحة التتبع ارتفاع و5D).
  11. وينبغي تحليل العديد من مثل هذه الصور لكل نوع من مجموعة تضم عدة مئات من Nucleosomes لل. تسجل ملامح الارتفاع، وتآمر تصنيفها في MS Excel.

النتائج

لتوضيح البروتوكول وأعيد صفائف النووي nucleosomal من المؤتلف histones الأساسية القيطم والحمض النووي يتكون من 12 جنبا إلى جنب 207 يكرر غليان من تسلسل 601 لتحديد المواقع (601 207 × 12). اجتمعنا أول octamers الأم من histones الأساسية مجفف بالتجميد ثم تنقيته من octamers بواسطة FPLC باستخدام عم...

Discussion

نموذج صفائف النووي nucleosomal هي أداة مفيدة جدا لدراسة في المختبر من هيكل لونين وظيفة. على سبيل المثال، فقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة آلية الألياف لونين التكثيف في حل 30-34، وجعلت من الممكن للحصول على هيكل الأشعة السينية من tetranucleosome 35. في الآونة الأخيرة ا...

Disclosures

والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM45916 وGM66834 إلى JCH وزمالة من المؤسسة الدولية ريت متلازمة لحزب العدالة والتنمية هذا العمل كان مدعوما أيضا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM088409 ومعهد هوارد هيوز الطبي المساهمات في كوالا لمبور

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)triethoxysilaneSigma-AldrichA3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis TubingFisher21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 ColumnGE17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal ConcentratorSartoriusVS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis TubingFisher08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 SuperfineGE17-0476-01
XL-A/I Analytical UltracentrifugeBeckman-Coulter

References

  1. Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 7, (1997).
  2. Hansen, J. C. Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).
  3. McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  4. Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1. Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).
  5. Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions. The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).
  6. Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).
  7. Nguyen, C., Gonzales, F. chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).
  8. Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure. Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).
  9. Simpson, R. T., Stafford, D. W. Structural features of a phased nucleosome core particle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).
  10. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  11. Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences. Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).
  12. Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *. The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).
  13. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).
  14. McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).
  15. Ma Shogren-Knaak, ., Fry, C. J., Peterson, C. L. A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications. The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).
  16. Lu, X., Simon, M. The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure. Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).
  17. Ausio, J. Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure. Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).
  18. Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution. Methods. 12 (1), 62-72 (1997).
  19. Montel, F., Menoni, H., et al. The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin. Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).
  20. Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays. The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).
  21. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  22. Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling. Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).
  23. Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  24. Sambrook, J., Russell, D. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).
  25. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).
  26. Demeler, B. UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments. Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).
  27. Holde, K. V., Weischet, W. Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes. Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).
  28. Demeler, B., van Holde, K. E. Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems. Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).
  29. Hansen, J., Lohr, D. Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays. Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).
  30. Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).
  31. Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).
  32. Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).
  33. Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding. The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).
  34. Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt. Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).
  35. Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).
  36. Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states. Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).
  37. Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding. Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).
  38. Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined "30 nm" Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone. Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).
  39. Dorigo, B., Schalch, T. Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail. J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).
  40. Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM. Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

79 Nucleosomes AFM nucleosomal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved