Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Bir yöntem olup, yeniden birleştirici çekirdek histon ikinci modeli nükleozomal dizilerin sulandırma ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA için sunulmuştur. Biz de analitik ultrasantrifüjdeki sedimantasyon hızı deneyleri, ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) hazırlandıktan sonra nucleosomal dizi doygunluk düzeyini izlemek için nasıl kullanıldığını açıklar.
Burada tekrar tekrar bir DNA molekülü boyunca aralıklı olan Çekirdek histon octamers nükleozomal dizileri olarak adlandırılır. Nükleozomal diziler iki yoldan birinde elde edilmiştir: in vivo kaynaklardan saflaştırılması, yeniden birleştirici ya da çekirdek histon in vitro olarak yeniden oluşum ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA. Bu ikinci yöntem daha bileşim bakımından düzenli montajı ve kesin bir konuma sahip nükleozomal dizisi için izin verme avantajına sahiptir. Bu santrifüj kuvveti altında çözelti içinden geçiş hızını analiz ederek makro moleküllerin büyüklüğü ve şekli ile ilgili analitik ultrasantrifüj verim bilgilerde sedimantasyon hızının deneyleri. Bu teknik, atomik kuvvet mikroskopisi ile birlikte, DNA şablonları çoğunluğu sulandırıldıktan sonra nükleozom doymuş olmasının sağlanması, kalite kontrol için kullanılabilir. Burada uzunluğu miligram miktarları yeniden yapılandırmak için gerekli ve bileşim açısından tarif d protokollerikromatin yapısı ve fonksiyonu biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için uygun efined nucleosomal diziler.
Ökaryotik genomları gibi çıplak DNA yoktur, ama yerine sıkıştırılmış ve bağlı proteinler tarafından organize edilir. DNA ve protein Bu kompleksler, kromatin olarak bilinir. Kromatinlerin temel tekrarlanan ünite nucleosome olduğunu. Bir nucleosome histon oktamer ve yaklaşık 1,6 kat 1 oktamer histona sarılı DNA 146 baz çiftinden oluşmuştur. Histon oktamer iki kopya çekirdek histon H2A, H2B, H3 ve H4 her oluşmaktadır. Burada tekrar tekrar bir DNA molekülü boyunca aralıklı olan Çekirdek histon octamers nükleozomal dizileri olarak adlandırılır. Nükleozomal dizilerinin yapısı, uzatılmış bir yapı "ipe dizili boncuklar" 10 nm ya da lif olarak adlandırılır ve düşük tuz koşulları altında 2, in vitro olarak mevcut olmuştur. 10 nm fiber içi dizi sıkıştırma ve / veya arası dizi oligomerizasyonu 2 vasıtasıyla daha yüksek düzeyde yapılar içine yoğunlaştırma yeteneğine sahip olduğunu. Bu yüksek sıralanmaları, tuzların mevcudiyetinde indüklenebilirveya nükleozomal dizi 3,4 kromatin mimari proteinlerin bağlanma yoluyla etkilenebilir. Kromatin sıkıştırma düzeyleri ters vivo 5,6 transkripsiyon oranı ile ilişkilidir. Son araştırmalar, farklılaşma, kanser gelişimi ve diğerleri 7,8 gibi süreçlerde Genomların yapısal kuruluşun önemini vurgulamaktadır. Kromatin yapısını ve işlevini incelemek için nucleosomal dizilerin kullanımı yaygın hale gelmiştir. Burada rekombinant çekirdek histon ve nucleosome konumlandırma DNA'dan nucleosomal dizilerin montajı için bir yöntem açıklanmaktadır.
Nükleozom konumlandırma dizilerin tandem tekrarı ile rekombinant DNA kullanarak düzenli olarak aralıklı nükleozom içeren dizilerin yeniden oluşturulması için izin verir. Daha popüler konumlandırma dizilerin iki 5S rRNA gen sekansı ve "601" sekans 9,10 bulunmaktadır. 601 dizisi SELEX deneyler ve mor elde edildie güçlü 5S dizisi 11 daha nükleozom konumlandırır. Sonuç olarak, 601 dizilerinin, bağlayıcı DNA uzunluğu daha homojendir. Tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA jel filtrasyonu 4,12 ile elde edilir. Rekombinant E. histonlar saflaştınlır denatüre edici koşullar altında 13 coli. Rekombinant histonların kullanımı bir dikkatle nucleosomal dizilerin histon kompozisyonunu kontrol etmenizi sağlar. Örneğin, çekirdek 15,16 yabani tip çekirdek histon ikame edilebilir spesifik mutasyonlar 14 ya da post-translasyonel modifikasyonlar taşıyan histonlar.
Çökeltme hız deneyleri uygulanan santrifüj kuvveti altında 17 çözeltisi içinde makromoleküllerin sedimantasyon hızını izler. Bu, bir numunede makromoleküllerin büyüklüğü ve şekli hakkında bilgi verir. Sedimantasyon hızı deneyleri böylece kromatin lif çözüm durum değişiklikleri incelemek için uygun bir araçtırkromatin yoğunlaşması 18 yapısı nedeniyle. Önemlisi, nucleosomal dizi sulandırma bir kalite kontrol adım olarak sedimantasyon hızı deneyleri kullanmak için ilk gerekli olan. DNA ve nükleozom uygun mol oranında birleştirilir değilseniz, diziler altında veya aşırı doymuş bir çekirdek histon sahip olabilir. Böylece, sedimantasyon hızının deneylerden elde edilen bilgiler, DNA uygun bir şekilde nükleozom ile doymuş olduğunu sağlamak için kullanılır. Bu, daha önce karakterize edilmemiş DNA şablonu ile çalışan, özellikle nükleozom ile DNA'nın doygunluk tahmin etmek için alternatif yöntemler kullanmak önemlidir. Bu nedenle, daha da atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile nükleozomal dizilerin analizi için bir yöntem tarif eder. AFM sağlayan güçlü bir tekniktir bu doyma seviyesi, histon varyantlarının varlığı etkisi ya da MgCI2 19,20 etkileri gibi parametreler, bir dizi etkilerinin görselleştirilmesi. AFM da başvurunun olmuştured zaman atlamalı görüntüleme 21 kullanılarak nucleosome dinamiklerini incelemek için. In vitro onlar AFM görüntüleme 22 için doğru boyut aralığındaki ait çünkü nucleosomal 12-mer diziler AFM çalışmalara özellikle yatkındır toplandı. Bu çalışmada, bir kalite kontrol gibi ("Görmek inanmaktır") AUC verileri onaylayan bir aracı olarak nucleosomal dizilerin AFM kullandık. Basit bir görselleştirme ek olarak, AFM ek bir ölçüt olarak numune yüksekliği profilleri ölçülmesini sağlar.
1.. Octamers içine Rekombinant çekirdek histon Meclisi
Gerekçe: nucleosomal dizi sulandırma içinde ilk adım Liyofilize rekombinant çekirdek histon adlı doğal çekirdek histon octamers hazırlamaktır. Histon proteinler eşit molar miktarlarda bir araya getirilmiş ve tekrar katlama tampon maddesi içine bir denatüre edici tampon üzerinden örnekleri diyaliz ile histon octamers içine monte edilir.
Not: Bir sonraki gün için sütun dengeye hazırlamak için adım 2.1-2.2 bakın.
2. Boyut Dışlama Kromatografisi ile Histone Octamers saflaştırılması
Gerekçe: Bölüm 1 ile tamamladıktan sonra, numuneler histon octamers yanı sıra, agrega, H3/H4 tetramerleri ve H2A/H2B dimerler gibi histon kompleksleri içerir. Histon octamers uzak boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile bu komplekslerden arıtıldı olacaktır.
3. DNA dizileri ve nükleozomal Saflaştırılmış Octamers Sulandırılması
Gerekçe: nükleozomal dizilerin Sulandırma histon octamers ve şablon DNA spesifik mol oranlarında bir araya gerektirir. 2 M NaCI içinde DNA ve histon octamers karışımları iyonik mukavemeti azalan tampon içine dialize adımdır. Düşük tuz kademeli değişim Uygun nucleosome oluşumunu sağlar. N eldeşablon DNA histon oktamer doygunluk istenen düzeyde ucleosomal diziler büyük ölçekli bir hazırlayıcı yeniden oluşturulması, ardından küçük ölçekli bir test reconstitutions gerektirir. Küçük ölçekli reconstitutions tarafından tanımlanan uygun koşullar hazırlayıcı yeniden oluşturma yönlendirmek için kullanılır.
Notlar: plazmid DNA azalma pahasına arınma ancak artan eff içinort, bir E. plasmid DNA izole etmek için fenol / kloroform DNA saflaştırma ile alkalin liziz kullanabilir coli 23,24. Plazmid DNA şablon DNA'nın ayrılması için Stratejiler şablon DNA boyut değişiklikleri ile farklılık gösterebilir. SEC için bu kısıtlama enzimi şablonu ve plasmid DNA arasındaki büyüklüğü farkı maksimuma bir şekilde, sindirimi kurmak için önemlidir.
10 mM Tris pH 7.8, 1 mM EDTA: Bütün tamponlar içerisinde Bileşenleri. Tampon 1 5-6 saat boyunca (1 M NaCl, 1 mM DTT ekleyin). Tampon 2, gece boyunca (0.75 M NaCl, 1 mM DTT ekleyin). Tampon 3 saat boyunca, 5-6 (2.5 mM NaCI, 1 mM DTT ekleyin). Tampon 4 gece boyunca (2.5 mM NaCI, 0.1 mM PMSF ekleniyor).
Not: bilgi muhafaza etmek için, küçük ölçekli örnekler alt tarama deneyleri için yeterli için gerekli olan minimum hacme sahip olmalıdır. E sahip amacıylanough 0.3 mg / ml DNA da burada listelenen çökelme hızı ve AFM deneyler, 50 ul örnekler için örnek uygundur. Büyük ölçekli büyüklüğü, hazırlayıcı örnekler amaçlanan kullanıma bağlıdır. Büyük ölçekli bir numunesi, küçük ölçekli örneklerle aynı şekilde hazırlanmalıdır.
4. Sulandırılmış nucleosomal Dizilerin sedimantasyon hızı analizi
Gerekçe: çözelti içinde moleküllerin büyüklüğü ve şekli ile ilgili en Beckman XL-A / I Analitik ultrasantrifüj verim bilgilerde sedimantasyon hızının deneyleri. Düşük tuz koşulları altında, sedimantasyon hızının deneyler yeniden dizileri nükleozom doymuş hangi ölçüde belirlemek için kullanılır.
Not: Tek taramalar ölçüm alanı sadece örnek menisküs (Şekil 2A) önce başlayarak ölçümler kısaltılmış izin verir. AUC çalışması sırasında üretilen taramasından en menisküs gibi istikrarlı platolar (Şekil 2B) geçen sınır fraksiyonlar olmalıdır. EAA hücreleri üzerinde kirli lensler büyük sivri taramalar üretebilir, bu verilerin analizini etkileyebilir. UltraScan yazılım analitik ultrasantrifügasyon verilerin 26 analizi ile ilgili bilgi için büyük bir kaynaktır bir kılavuzu içerir.
5. Sedimentasyon Hızı Veri düzenleme ve Analizi
Gerekçe: Ham sedimantasyon hızı verileri, difüzyon-düzeltilmiş sedimantasyon katsayısı dağılımını veren bir program tarafından analiz edilmelidir. Sırayla Bu bilgi, belirli bir doygunluk düzeyini içeren bir yeniden numunenin kısmını gösterir, örn 12-mer DNA şablonu kullanarak eğer 10, 11, 12 ve nükleozom / DNA yeniden sahip dizilerin fraksiyonunu belirlemek mümkün olacaktır.
6. Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak nucleosomal Dizileri görselleştirme (AFM)
Gerekçe: AFM sağlar: nucleosoma doyma seviyesinin görselleştirmel diziler. Bu teknik, bir kalite kontrol deneyi olarak AUC ve sınır enzimi sindirimi ile sedimantasyon hızını tamamlar.
Protokolünü göstermek için biz 12 tandem 601 konumlandırma dizisine (601 207 x 12) 207 bp tekrarlarını kapsayan yeniden birleştirici Xenopus çekirdek histon ve DNA dizileri, nükleozomal yeniden. İlk liyofilize çekirdek histon ikinci yerel octamers monte edilmiş ve daha sonra bir S200 sütunu (Şekil 1A) kullanılarak FPLC ile octamers arıtıldı. Daha büyük kompleksler S200 kolonundan önce elüte. Histonlar genellikle bu sırayla Zehir: non-spesifik histon agrega, hi...
Model nucleosomal diziler kromatin yapısı ve fonksiyonu in vitro çalışma için çok yararlı bir araçtır. Örneğin, yaygın olarak çözelti 30-34 kromatin fiber yoğuşma mekanizmasını incelemek için kullanılan ve mümkün bir tetranucleosome 35 bir x-ışını yapı elde etmek için yapılmıştır. Daha yakın zamanlarda bu, belirli çekirdek histon varyantları, mutantlan ve posttranslasyonel modifikasyonlar 14-16,36 yapısal etkileri çözmekte yararlı olduğu ...
Yazarlar çıkar çatışmaları var.
Bu çalışma NIH hibe GM45916 ve GM66834 Hi'de ve bu işi Ak Uluslararası Rett Sendromu Vakfı bir burs ile desteklenmiştir da NIH GM088409 ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü KL katkıları hibe tarafından desteklenen
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır