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Method Article
Um método é apresentado para a reconstituição do modelo matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e de DNA em tandem repetido posicionamento nucleosome. Nós também descrevem como experimentos de velocidade de sedimentação na ultracentrífuga analítica, e microscopia de força atômica (AFM) são usados para monitorar o grau de saturação disposição nucleosomal após a reconstituição.
Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. Matrizes nucleossomais são obtidos de uma de duas maneiras: a purificação de fontes in vivo, ou a reconstituição in vitro a partir de histonas de núcleo e de ADN recombinante em tandem repetido posicionamento nucleossoma. O último método tem a vantagem de permitir a montagem de uma mais uniforme em termos de composição e matriz nucleossomal precisamente posicionado. Experiências de velocidade de sedimentação em a informação analítica rendimento ultracentrífuga sobre o tamanho ea forma das macromoléculas através da análise da velocidade à qual elas migram através de uma solução sob a força centrífuga. Esta técnica, juntamente com a microscopia de força atómica, podem ser usadas para controlo de qualidade, garantir que a maior parte dos moldes de ADN são saturados com nucleossomas após reconstituição. Aqui nós descrevemos os protocolos necessários para reconstituir quantidades de miligramas de comprimento e de composição dmatrizes nucleossomais efined adequados para estudos bioquímicos e biofísicos da estrutura e função da cromatina.
Genomas eucarióticos não existir como DNA nu, mas sim são compactadas e organizada por proteínas ligadas. Estes complexos de ADN e de proteínas são conhecidos como cromatina. A unidade de repetição básica de cromatina é o nucleossoma. Um nucleossoma é constituído por octâmero histona e 146 pares de bases de ADN envolvida em torno da histona octâmero cerca de 1,6 vezes uma. O octâmero histona é composto por duas cópias de cada um dos H2A histonas centrais, H2B, H3, e H4. Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. A estrutura estendida de matrizes nucleossomais tem sido referido como a fibra de 10 nm ou as "pérolas num fio" estrutura e está presente in vitro sob condições de baixo teor de sal 2. A fibra de 10 nm é capaz de condensar em estruturas de ordem superior através de compactação intra-array e / ou inter-array oligomerization 2. Estas estruturas de ordem superior pode ser induzida na presença de sais,ou pode ser influenciada por meio da ligação de proteínas de arquitectura da cromatina para a matriz nucleossomal 3,4. Os níveis de compactação da cromatina são inversamente correlacionada com a taxa de transcrição in vivo 5,6. Uma pesquisa recente destaca a importância da organização estrutural de genomas em processos como a diferenciação, o desenvolvimento de câncer, e outros 7,8. O uso de matrizes nucleossomais para estudar a estrutura e função da cromatina tornou-se generalizada. Aqui nós descrevemos um método para a montagem de matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e DNA posicionamento nucleosome.
Usando DNA recombinante com repetições em série de sequências de posicionamento nucleossomas permite a reconstituição de matrizes que contêm nucleossomas regularmente espaçados. Duas das seqüências de posicionamento mais populares são a seqüência do gene 5S rRNA eo "601" seqüência 9,10. A sequência de 601 foi derivado de experiências de SELEX e more posiciona fortemente nucleossomos do que a seqüência 5S 11. Por conseguinte, o comprimento do DNA adaptador das matrizes 601 é mais homogénea. DNA posicionamento nucleosome tandem repetido é obtido por filtração em gel 4,12. Histonas recombinantes são purificados a partir de E. Coli sob condições de desnaturação 13. O uso de histonas recombinantes permite controlar cuidadosamente a composição das histonas nucleossomais matrizes. Por exemplo, o núcleo histonas com mutações específicas 14 ou modificações pós-traducionais 15,16 pode ser substituído por histonas centrais de tipo selvagem.
Experimentos de velocidade de sedimentação monitorar a taxa de sedimentação de macromoléculas em solução sob uma força centrífuga aplicada 17. Este fornece informação sobre o tamanho e forma de macromoléculas numa amostra. Experimentos de velocidade de sedimentação são, portanto, uma ferramenta adequada para o estudo de soluções mudanças de estado em fibras de cromatinaestrutura devido à condensação da cromatina 18. Importante, é primeiro necessário utilizar experiências de velocidade de sedimentação, como um passo de controlo de qualidade em nucleossomal reconstituição matriz. Se o DNA e nucleossomos não são combinados na proporção molar apropriado, os conjuntos podem ser sub-ou sobre-saturado com histonas do núcleo. Assim, a informação obtida a partir de experiências de velocidade de sedimentação é usado para garantir que o ADN está adequadamente saturada com nucleossomas. É importante a utilização de métodos alternativos para estimar a saturação de ADN com os nucleossomas, especialmente se a trabalhar com um molde de ADN anteriormente não caracterizada. Portanto, nós também descrevem um método para análise de matrizes nucleossomais usando microscopia de força atômica (AFM). AFM é uma técnica poderosa que permite a visualização dos efeitos de uma série de parâmetros, tais como o nível de saturação, o efeito da presença de variantes de histona ou os efeitos de MgCl2 19,20. AFM também tem sido aplied para estudar a dinâmica nucleossomos usando tempo de imagem lapso 21. In vitro montado nucleossomais matrizes 12-meros são particularmente passíveis de estudos de AFM, porque eles pertencem à faixa de tamanho certo para AFM 22. No presente estudo, utilizamos AFM de matrizes nucleossomais como um controle de qualidade, bem como um meio de afirmar os dados da AUC ("ver para crer"). Além de simples visualização, AFM permite a medição de perfis de altura de amostras como uma métrica adicional.
1. Assembléia dos recombinantes Núcleo Histones em octâmeros
Justificativa: O primeiro passo para nucleosomal reconstituição matriz é preparar octâmeros histonas centrais nativas da liofilizados histonas centrais recombinantes. Proteínas histona são combinados em quantidades equimolares e montadas em octâmeros histonas por diálise das amostras de um tampão de desnaturação em tampão de redobragem.
Nota: Veja o passo 2,1-2,2 para preparar a coluna de equilíbrio para o dia seguinte.
2. Purificação de histona octâmeros por cromatografia de exclusão de tamanho
Justificativa: Depois de concluir com a secção 1, amostras conterá octâmeros histonas, bem como outros complexos de histona tais como agregados, tetrâmeros H3/H4 e dímeros H2A/H2B. Octâmeros histona vai ser purificado a partir destes outros complexos utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).
3. Reconstituição de nucleosomal matrizes de DNA e purificada octâmeros
Justificativa: Reconstituição de matrizes nucleossomais exige que octâmeros histonas e DNA template ser combinados em proporções molares específicas. Misturas de DNA e histonas octâmeros em 2 M NaCl são dialisados passo em buffers de diminuir a força iônica. Uma mudança gradual para reduzir sal garante formação nucleosome adequada. Obtenção de nmatrizes ucleosomal com o nível desejado de saturação histona octâmero do ADN molde requer reconstituições de teste em pequena escala, seguida por uma reconstituição em larga escala preparativa. As condições adequadas definidas pelos reconstituições de pequena escala são utilizados para orientar a reconstituição preparativa.
Notas: Para a purificação de DNA plasmídeo em redução de custos, mas aumentou effort, pode-se utilizar a lise alcalina com fenol / clorofórmio, a purificação do DNA a fim de isolar o ADN de plasmídeo a partir de E. coli 23,24. Estratégias para a separação do molde de DNA a partir de DNA de plasmídeo pode variar com mudanças no tamanho do ADN molde. Por SEC é importante estabelecer a enzima de restrição digerir de uma forma que maximiza a diferença no tamanho entre o molde e o DNA de plasmídeo.
Componentes em todos os tampões: 10 mM Tris pH 7,8, EDTA 1 mM. Tampão 1 (adicionar 1 M de NaCl, 1 mM de DTT) por 5-6 horas. Tampão 2 (adicionar NaCl 0,75 M, DTT a 1 mM) durante a noite. Tampão 3 (adicionar NaCl 2,5 mM, DTT 1 mM) durante 5-6 horas. Tampão 4 (adicionar NaCl 2,5 mM, PMSF 0,1 mM) durante a noite.
Nota: A fim de preservar os recursos, as amostras de pequeno porte devem ter o volume mínimo necessário para bastar para testes de rastreio a jusante. Para ter enough amostra para as experiências de velocidade de sedimentação e AFM listados aqui, amostras de 50 ul a 0,3 mg / ml de DNA são apropriados. O tamanho de grande escala, amostras de preparação são dependentes do seu uso pretendido. Uma amostra de grande escala, devem ser preparados da mesma maneira que as amostras de pequena dimensão.
4. Sedimentação Velocity Análise de reconstituídos nucleosomal matrizes
Razão: experiências de velocidade de sedimentação das informações rendimento ultracentrífuga analítica Beckman Xl-A / I do tamanho e forma das moléculas em solução. Experiências de velocidade de sedimentação realizadas sob condições de baixa de sal são usados para determinar o grau em que as matrizes são reconstituídos saturado com nucleossomas.
Nota: scans Solteiro permitir área de medição para ser reduzido por medidas a partir pouco antes do menisco da amostra (Figura 2A). A maioria das verificações gerados durante a execução AUC deve ter fracções de limite últimos menisco, bem como planaltos estável (Figura 2B). As lentes sujas sobre as células da AUC podem gerar scans com grandes picos, que podem afectar a análise dos dados. O software UltraScan inclui um manual, que é um grande recurso para obter informações sobre a análise de dados ultracentrifugação analítica 26.
5. Editar e analisar dados de sedimentação Velocity
Justificativa: dados de velocidade de sedimentação Raw deve ser analisada por um programa que produz uma distribuição coeficiente de sedimentação com correção de difusão. Esta informação, por sua vez indica que a fracção de uma amostra reconstituída que contém um determinado nível de saturação, por exemplo, se estiver usando um modelo de DNA 12-mer, será possível determinar a fração de matrizes reconstituídos, que tem 10, 11 e 12 nucleossomos / DNA.
6. Visualizando nucleosomal matrizes com Microscopia de Força Atômica (AFM)
Razão: AFM permite a visualização do nível de saturação de nucleosomal matrizes. Esta técnica complementa velocidade de sedimentação com a AUC e a digestão com enzimas de restrição, como um ensaio de controlo de qualidade.
Para ilustrar o protocolo que reconstituído matrizes nucleossomais recombinantes de histonas de núcleo de Xenopus e de ADN consistindo em 12 conjunto 207 repete pb da sequência de posicionamento 601 (601 207 x 12). O primeiro montado octâmeros nativas de histonas de núcleo liofilizados e, em seguida, purificado os octâmeros por FPLC usando uma coluna S200 (Figura 1A). Complexos maiores eluir mais cedo a partir da coluna S200. As histonas geralmente eluir nesta ordem: agregados ...
Matrizes nucleossomais modelo são uma ferramenta muito útil para o estudo in vitro da estrutura e função da cromatina. Por exemplo, eles têm sido amplamente utilizado para estudar o mecanismo da condensação de cromatina na fibra solução 30-34, e tornou possível a obtenção de uma estrutura de raios-x de um tetranucleosome 35. Mais recentemente, eles têm se mostrado útil para decifrar os efeitos estruturais de variantes de histonas núcleo específico, mutantes e modificações...
Os autores não têm conflitos de interesse.
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede GM45916 e GM66834 para JCH e uma bolsa da Fundação Internacional de Síndrome de Rett para AK Este trabalho também foi financiado pelo NIH conceder GM088409 e do Instituto Médico Howard Hughes contribuições para KL
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
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