組換えコアヒストンおよびヌクレオソームポジショニングDNAからのヌクレオソーム配列の組み立て

要約

この方法は、組換えコアヒストンからモデルクレオソームアレイの再構成および縦列反復ヌクレオソームのポジショニングのDNAのために提示されている。また、分析用超遠心で沈降速度実験、および原子間力顕微鏡（AFM）は、再構成後のヌクレオソームアレイ飽和の程度をモニターするために使用される方法を記載している。

要約

繰り返しDNA分子に沿って配置されているコアヒストン八量はヌクレオソームアレイに呼ばれています。ヌクレオソームアレイは2つの方法のいずれかで得られる：in vivoでの情報源からの精製、または組換えコアヒストンからのin vitroで再構成および縦列反復ヌクレオソームのポジショニングのDNA。後者の方法は、以上の組成が均一のアセンブリーと正確に配置ヌクレオソームの配列を可能にするという利点があります。分析用超遠心で沈降速度実験は、それらが、遠心力下で溶液を通って移動する速度を解析することにより高分子のサイズおよび形状に関する情報を得た。この技術は、原子間力顕微鏡とともに、DNAテンプレートの大部分は再構成後にヌクレオソームで飽和されることを保証する品質管理のために使用することができる。ここでは、長さのミリグラム量を再構成するために必要と組成的にDのプロトコルを記述クロマチン構造および機能の生化学的および生物物理学的研究に適しefinedクレオソームアレイ。

概要

真核生物のゲノムは、裸のDNAとして存在していないのではなく、圧縮し、結合したタンパク質で編成されています。 DNAおよびタンパク質のこれらの複合体は、クロマチンとして知られている。クロマチンの基本繰り返し単位はヌクレオソームである。ヌクレオソームは、ヒストンオクタマーと約1.6倍の¹オクタマーヒストンに巻きDNAの146塩基対で構成されています。ヒストン八量体は、2つのコピーのコアヒストンH2A、H2B、H3、およびH4の各々から構成されている。繰り返しDNA分子に沿って配置されているコアヒストン八量はヌクレオソームアレイに呼ばれています。ヌクレオソームアレイの拡張構造は、10nm繊維又は「ストリング上のビーズ」構造と呼ばれ、低塩条件²の下で、インビトロで存在されている。 10 nmの繊維は、アレイ内の圧縮および/ ​​またはアレイ間オリゴマー²を介してより高次の構造へと凝縮することができる。これらの高次構造は、塩の存在下で誘導することができるまたはヌクレオソーム配列^3,4にクロマチン建築のタンパク質の結合を介して影響を与えることができる。クロマチン圧縮のレベルは反比例ビボ ^5,6 内の転写速度と相関している。最近の研究では、このような分化、癌の発生、その他^7,8のようなプロセスにおけるゲノムの構造組織の重要性を強調しています。クロマチン構造及び機能を研究するためのヌクレオソームアレイの使用が普及している。ここでは、組換えコアヒストンとヌクレオソーム位置決めDNAからのヌクレオソームの配列の組立のための方法を説明します。

ヌクレオソーム位置決めシーケンスのタンデムリピートで組換えDNAを使用すると、規則的な間隔のヌクレオソームを含む配列の再構成を可能にします。より一般位置決め配列の二つは、5S rRNA遺伝子配列と「601」配列である^9,10。 601配列を、SELEX実験やMORから派生したE強く5Sシーケンス¹¹よりヌクレオソームを配置します。従って、アレイ601のリンカーDNAの長さはより均質である。縦列反復ヌクレオソーム位置決めDNAをゲル濾過^4,12によって得られる。組換えヒストンは、E.から精製される変性条件^13歳未満の大腸菌 。組換えヒストンの使用は1注意深くヌクレオソームアレイのヒストン組成を制御することができます。例えば、特定の変異¹⁴または翻訳後修飾を有するコアヒストン^15,16は、野生型コアヒストンの代わりに用いることができる。

沈降速度実験は、遠心力¹⁷の下で、溶液中の高分子の沈降速度を監視します。これは、試料中の巨大分子の大きさや形状に関する情報が得られる。沈降速度実験従って、クロマチン繊維中の溶液の状態の変化を研究するための適切なツールであるクロマチン凝縮¹⁸による構造。重要なことは、ヌクレオソーム再構成アレイにおける品質管理工程として沈降速度実験を使用することがまず必要である。 DNAおよびヌクレオソームが適切なモル比で結合されない場合、アレイは過小または過剰飽和コアヒストンとすることができる。このように、沈降速度実験から得られた情報は、ヌクレオソームDNAが適切で飽和されていることを確認するために使用される。これは、以前に特徴づけられていないDNAテンプレートを扱う場合は特に、ヌクレオソームでDNAの飽和を推定するための代替方法を使用することが重要である。したがって、我々はまた、原子間力顕微鏡（AFM）を用いてヌクレオソームアレイの分析のための方法を記載している。 AFMは、例えば、飽和レベル、ヒストン変異体又は^19,20のMgCl ₂の影響の存在の効果などのパラメータの数の効果の可視化を可能にする強力な技術である。 AFMはまた、アプリをされているタイムラプスイメージング^21を使用してヌクレオソームのダイナミクスを研究するエド。 インビトロでは 、彼らはAFMイメージング²²に適した大きさの範囲内に属しているため、ヌクレオソーム12-merの配列は原子間力顕微鏡の研究に特に適している組み立て。本研究では、品質管理だけでなく、（「百聞は一見にしかず」）のAUCからデータを肯定する手段として、ヌクレオソームアレイのAFMを使用している。単純な可視化に加えて、AFMは、追加のメトリックとしての試料の高さプロファイルの測定を可能にする。

プロトコル

1。八量への組換えコアヒストンの組立

理由：ヌクレオソームのアレイ再構築の最初のステップは、凍結乾燥した組換えコアヒストンからネイティブコアヒストン八量を準備することです。ヒストンタンパク質は等モル量で混合し、リフォールディング緩衝液中に変性バッファからサンプルを透析することによってヒストン八量体に組み立てられる。

1. ¹³に記載の組換えコアヒストン（H2A、H2B、H3、H4）を精製し、凍結乾燥する。
2. アンフォールディングバッファー（6Mグアニジニウム塩酸、20mMのトリスpH7.5、5mMのDTT）3mlにそれぞれ凍結乾燥されたコアヒストンの約5ミリグラムを溶解する。各アリコートは、1時間以上溶解させる。全くタンパク質が容器の側面に残っていないことを確認してください。
3. 参照として展開緩衝液を用いて、276 nmでの各ヒストンの吸光度を測定します。
4. それらの吸光係数を用いて、各ヒストンのモル濃度を計算した（ 表1を参照 アフリカツメガエルヒストン吸光係数のため）。タンパク質の大部分が溶解している場合は、凍結乾燥し、乾燥重量、および推定値にヒストンの吸光度決定された濃度を比較してください。
5. これはすべてのヒストンのためのモル制限数であるように、あなたが最も少ないモル数を持っているヒストンを決定します。
6. 等モル量のヒストンを結合および1 mg / mlの最終濃度になるようにバッファーを展開で希釈する。
7. 6-8 kDaのMWCO透析チューブにサンプルを置きます。チューブを密封し、コールドリフォールディング緩衝液（2M N​​aCl、10mMのトリスpH7.5、1mMのEDTA、5mMのβ-メルカプトエタノール）2Lに配置します。
8. 攪拌しながら4℃で18時間のためのサンプルを透析。透析チューブが自由に、激しく回転させることができ、そうでなければ、ヒストンが沈殿することを確認してください。
9. 18時間の期間に2回透析緩衝液を変更（完了するまで、 すなわち 、すべての6時間約リフォールディング緩衝液に変更）。沈殿物が形成されていても破棄しない収率が低下するが、サンプルは、いくつかの八量体を回収することができる。

注：次の日のためにカラム平衡を準備するためにステップ2.1から2.2を参照してください。

2。サイズ排除クロマトグラフィーによるヒストン八量の精製

理由：セクション1で締結した後、サンプルはヒストン八量だけでなく、このような凝集、H3/H4四量体、およびH2A/H2B二量体などの他のヒストン複合体が含まれています。ヒストン八量体は、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて、これらの他の複合体から離れて精製される。

1. FPLCシステムにハイロード16/60をSuperdex200 16/60（S200）のカラムを接続します。気泡がシステムに入っていないことを確認してください。
2. 0.2μmのろ過された水で、S200列をきれいにしてください。 0.3ml /分の流速を使用し、0.5MPaでの背圧の上限を設定する。あなたは十分な水を持っていることを確認し、列は一晩をきれいにすることができます。
3. FのS200カラムとサンプルループを平衡リフォールディング緩衝液を使用して、PLC。 0.2μmのフィルター再生バッファー1リットルを使用しています。 1ミリリットル/分と約2時間0.5メガパスカルの圧力の速度でカラムを介してバッファをリフォールディング流れ。
4. リフォールディング緩衝液1mlでビバスピン遠心濃縮（50 kDaのMWCO）を平衡化させます。透析チューブからサンプルを取り出して、任意の沈殿物を除去するために4℃でサンプルを遠心分離する。コンセントレータへのサンプルの上清をピペットで。約500μlの容量にサンプルを濃縮。
5. 新しいコンテナに集中八量サンプルを削除し、リフォールディング緩衝液1ミリリットルに濃縮装置をすすぐ。 500μlにリンスを下に集中し、八量サンプルに追加します。これは、コンセントレータに残っオクタマーをサルベージするのに役立ちます。
6. 4℃にて10,000 rpmで5分間、1.5mlマイクロチューブ内の試料をスピン上清を回収し、新しいチューブに移す。これは、FPL上のサンプルをロードする前に任意の沈殿物を除去するのに役立ちますC.
7. S200カラムにサンプルをロードします。シングル精製における最大1.5ミリリットルの全容量または15 mgの八量をロードします。
8. 作りたてのリフォールディング緩衝液を使用してサンプルを溶出させる。 1ml /分の流速および0.5MPaでの背圧の上限を使用する。リフォールディング緩衝液2カラム容量（400ミリリットル）を使用し、2ミリリットルの分画を収集します。溶出中に280 nmの吸光度をモニターする。異なる種は、サイズが大きい順に溶出する。ヒストン凝集体は通常、約84ミリリットル（ 図1）には、約45ミリリットル、オクタマー約65ミリリットルであり、二量体を溶出させる。
9. 18から20まで%SDS-PAGEでサンプルを実行することで、関心のあるピークからの溶出画分を分析します。精製された八量を含む画分を4コアヒストンタンパク質の等モル量（ 図1）を有するべきである。
10. 精製された八量が含まれている画分をプールし、ビバスピン遠心濾過して15 mg / mlのを≤濃縮。希薄を放置すれば、八量私の関連付けを解除可能NTO H2A/H2B二量体およびH3/H4四量体。
11. 280nmでの吸光度を測定することによって八量濃度を測定し、表1からの吸光係数を用いて計算する。
12. ヒストン八量体を4℃でリフォールディングバッファー中で短期的に保つことができる長期間記憶されている場合、オクタマーを-20℃で50％グリセロール溶液中でより安定である。グリセロールに格納八量は吸光度測定の前に新鮮なリフォールディング緩衝液に透析し、ヌクレオソームのアレイ再構成の中で使用されるべきである。

3。 DNAからのヌクレオソーム配列と精製八量の再構成

理由：ヌクレオソームアレイの再構成は、ヒストン八量と鋳型DNAを特定のモル比で結合されている必要があります。 2MのNaCl中のDNAとヒストン八量体の混合物は、イオン強度を低下させるバッファに透析ステップである。低塩への段階的な変化は、適切なヌクレオソームの形成を確実にします。 Nの取得鋳型DNAのヒストンオクタマー飽和所望のレベルにucleosomalアレイは、大規模な取再構成に続いて小規模なテスト再構成の必要になります。小規模の再構成の適切な条件によって定義を分取再構成を誘導するために使用される。

1. ^4,12記載のように縦列反復ヌクレオソーム位置決めDNAを精製する。簡単に言うと、キアゲンGigaPrepキットや類似の製品を使用してプラスミドDNAを分離します。セットアップの制限酵素の鋳型DNAを解放し、小さいサイズ（≤の700bpの）へのプラスミドDNAを消化するためにダイジェストを。鋳型DNAは、次いでサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いてプラスミドDNA小さな残存物から精製することができる。セファクリルS-1000のビーズを充填した約115センチの高さで、列を与え重力は601 ^207bp X 12量体DNAの精製の ​​ために十分である。

（注）減少したコストでプラスミドDNA精製のためではなく、EFFの増加ORT、一方はE.からプラスミドDNAを単離するためにフェノール/クロロホルムDNAの精製をアルカリ溶解を使用することができ大腸菌 ^23,24。プラスミドDNA鋳型からDNAを分離するための戦略は、鋳型DNAのサイズの変化によって変化し得る。 SECにとっては、制限酵素テンプレートプラスミドDNAの大きさの違いを最大化する方法でダイジェストを設定することが重要です。

2. モル比（R）が再構成のために使用するかを決定します。Rは DNA反復のモル数に対する量体のモル比に等しい。意図は、飽和ヌクレオソームアレイを得ることである場合は、初期小規模試験のために、0.9、1および1.1のr値が適切である。
3. テスト対象の各モル比で約18μgのDNAのに追加する八量の量を計算することにより、小規模なサンプルを準備します。 DNAやヒストン八量を混ぜる。試料中のNaClの最終濃度≥2 Mであるべきであり、Dの最終濃度NAは周り0.3μgの/μLである必要があります。最終サンプル緩衝液条件はまた、10mMのトリス、pH7.8、および1mM EDTAを含むべきである。
4. サンプルは現在、透析のための準備が整いました。 12K-14K MWCO透析チューブにサンプルをロードします。次のようにイオン強度を低下させるバッファの2Lに対してサンプルを透析。

10 mMトリスpHは7.8、1 mMのEDTA：すべてのバッファでコンポーネント。バッファ1 5-6時間（1MのNaCl、1mMのDTTを加える）。バッファ2（0.75 M NaCl、1mMのDTTを追加）で一晩。バッファ3 5-6時間（2.5のNaCl、1mMのDTTを加える）。バッファ4晩（2.5のNaCl、0.1 mMのPMSFを加える）。

5. 透析チューブからサンプルを取り出して、各項4-6に進んでください。小規模なサンプルが目的の結果が得られた場合は、大規模でのセクション3-6の手順を繰り返します。

注：リソースを節約するために、小規模なサンプルが下流のスクリーニングアッセイのために十分であるのに必要な最小体積を有するべきである。電子を有するためにここに記載されている沈降速度およびAFM実験のためのnoughサンプル、0.3 mg / mlのDNAを、50μlのサンプルが適切である。大規模の大きさは、調製用のサンプルは、その使用目的に依存している。大規模なサンプルは、小規模の試料と同様にして調製されるべきである。

4。再構成ヌクレオソーム配列の沈降速度解析

理由：溶液中の分子の大きさや形状にベックマンXL-A / I分析用超遠心利回り情報内沈降速度実験。低塩条件下で行わ沈降速度実験は、再構成されたアレイはヌクレオソームで飽和されている程度を決定するために使用される。

1. TEN緩衝液（10mMトリス、pH7.8、1mMのEDTA、2.5mMのNaCl）を用いて260nmでの吸光度0.5の周りにサンプルを希釈する。片側のサンプルやreferenで、2部門の目玉で細胞内への試料400μLを読み込む他の²⁵のCE（TENバッファー）。サンプル半月板よりも高い参照メニスカスを維持する（ すなわち 420μL標準溶液を加える）。
2. ローターに細胞をロードし、適切に細胞とロータ²⁵の底にハッシュマークを用いて細胞を揃える。穏やかに圧縮空気を用いた細胞のレンズをほこり。
3. 、XL-A/XL-I遠心機の電源を入れ、ローターを挿入し、添付して、マニュアルに記載されているように光学系を固定します。新しい：プロテオーム研究室ソフトウェアを選択し、ファイルを開きます。
4. 3,000 rpmで、単一のスキャンを実行し、25℃の温度を設定しますオプション]で、[前回のスキャン後に停止し、実行ラジアル校正（ローターがAUCの最後に使用されたロータだった場合、ラジアルリブレーションは必要ありません）。
5. 各セルに対して、サンプルに名前を付け、波長（260 nm）を選択し、吸光度を選択して、コンピュータ上のファイルを保存する場所を選択します。シングルスキャンの実行を開始します。
6. 適切なRAを決定するために単一のスキャンを使用走査長（ 図2A）をダイヤルします。スキャンされるセルの長さを小さくすると、実行時間が短縮されます。しかし、サンプルのメニスカスが含まれており、非常に近い、またはセルの下部に端を拡張するようにしてください。

注：単一のスキャンは、測定領域がちょうど試料のメニスカス（ 図2A）の前に測定を開始することによって短縮することを可能にする。 AUCは、実行中に発生するスキャンの大半は、半月板だけでなく、安定した台地（ 図2B）過去の境界画分を持っている必要があります。 AUCは、細胞上の汚れたレンズが大きなスパイクでスキャンを生成することができ、これらは、データの分析に影響を与えることがある。ウルトラスキャンソフトウェアは、分析超遠心データ²⁶の分析に関する情報のための素晴らしいリソースですマニュアルが含まれています。

7. XL-A/XL-Iコントロールパネルを使用して、0の速度と、プレスの開始を入力してください。これは真空とすべてをプルする遠心室プロンプトが表示されますわーチャンバーの温度が平衡する。ファイル名を指定して実行を開始する前に、温度平衡を可能にするために、1時間待ってください。
8. 所望の速度とスキャン回数の実行を上に設定するためのソフトウェアを使用しています。より高速で、解像度を向上させるが、サンプルがセルの底に沈殿している前に、1は、少なくとも20のスキャン（好ましく）を収集する必要があります。これは、実行の進捗状況を監視し、漏れた細胞のような潜在的な問題をチェックするために、（オプションメニューで達成）の最後のいくつかのスキャンをオーバーレイすると便利です。正常な動作を保証するために、スキャンの最初のカップルを監視します。

5。編集と沈降速度データの分析

論理的根拠：プレーン沈降速度データは、補正された拡散沈降係数の分布が得られるプログラムによって解析されるべきである。今度はこの情報は、所与の飽和レベルを含有する再構成された試料の割合を示し、 例えば、 12-merのDNAテンプレートを使用する場合、それは10、11および12ヌクレオソーム/ DNAを有する再構成された配列の割合を決定することが可能となる。

1. データ^26を編集するようなウルトラスキャンなどのAUCデータ解析ソフトウェアを使用してください。スキャンデータの編集は、セルごとに行われ、その後の分析のためのデータセットを作成する必要があります。スキャンの適切な編集は、試料のメニスカスを画定する関心領域にデータを縮小し、ベースラインならびにプラトー領域（ 図2）を規定することを含む。不要なスキャンも、この時点で、データセットから除去することができる。それは分析中に不要なスキャンを除去することが可能であるので、それはすべてのスキャンがこの時点で維持することが推奨される。
2. 私たちは強く強化されたファン·ホルデ-Weischetメソッドは、データ^27を分析するために使用されることをお勧めします。この分析方法は実験の過程にわたって拡散の影響を補正し、沈降係数の積分分布が得られる。特に、強化されたファン·ホルデ-Weischet法は、（ウルトラスキャンで実装されている）、安定した高原を欠いている、または分析²⁸でメニスカスをクリアしていない境界画分を含んでいるのスキャンを含めることができるようになります。
3. 組み立てアレイ用の沈降係数の分布を決定する。 601から12（207bp、12マー）ヌクレオソームアレイのための代表的な結果を図3に示す。
4. 小規模のサンプルの1は沈降係数の所望の範囲を持つ配列が含まれている場合は、セクション3で始まる増加規模でプロセスを繰り返します。小規模サンプルのいずれも沈降係数の適切な分布を持っていない場合は、セクション3で始まる新しいRレンジで小規模なテストを繰り返します。

6。原子間力顕微鏡（AFM）を用いてヌクレオソーム配列を可視化する

理由：原子間力顕微鏡はnucleosomaの飽和レベルの可視化を可能にするL·アレイ。この技術は、品質管理アッセイとしてAUCおよび制限酵素消化による沈降速度を補完する。

1. 上記の方法を用いて、ウェルを飽和ヌクレオソームアレイ（ 図5A）を得た。
2. 30分間、0.22μmのフィルターナノ純水に、商業の〜30μlの1:1,000希釈（シグマアルドリッチ（3 - アミノプロピル）トリエトキシシランA3648-100ML）を配置することにより、マイカスライドをあしらったAPTESを準備します。
3. 30分後にろ過し、水でAPTESを洗い流し、ゆっくりと窒素フローでそれらを乾燥させます。
4. スライド上で適切に希釈したヌクレオソーム配列のサンプル（〜1.5 ngの/μl）を配置し、15分間室温でカバーさインキュベートする。
5. 、濾過された試料緩衝液でオフサンプルとして前に乾燥し、原子間力顕微鏡（この場合はアサイラムMFPの3次元原子間力顕微鏡）の舞台の上に置いてスライドすすいでください。
6. 512本の走査線で2×2μmのスキャンを撮像して起動します。のSAのレベルを確認するためにヌクレオソームの数を数えるturation（ 図5B）。
7. 理想的にはよく分離ヌクレオソームアレイスライド上の画像領域をすべき。
8. 高解像度画像は、500×500 nmのスキャンは、（ 図5C）を得ることができる。
9. 画像は平らにし、アサイラムが提供するMFPの3次元ソフトウエアを用いて分析することができる。
10. 各画像は、4つの象限に分割され、ヌクレオソーム（ 図5C、右のパネルの高さのトレースのために取得される配列や高度プロファイルを通して描くことができます十分に分離し、配列や複数のフリーハンドの線を明確に視野を得るために、デジタル的に拡大することができますおよび5D）。
11. いくつかのこのような画像は、ヌクレオソームの数百を包含する配列の種類ごとに分析すべきである。高さプロファイルは、記録され分類され、MS Excelでプロットされている。

結果

プロトコルを説明するために、我々は601の位置決めシーケンス（601 ^207×12）の12タンデム207 bpの反復からなる組換えアフリカツメガエルコアヒストンとDNAからヌクレオソームの配列を再構成した。まず、凍結乾燥されたコアヒストンからネイティブ八量を組み立てた後、S200カラム（ 図1A）を使用してFPLCによって八量を精製した。より大きな複合体は、S200カラムか?...

ディスカッション

モデルヌクレオソームアレイは、クロマチン構造及び機能のin vitro研究のための非常に有用なツールである。例えば、それらは広く溶液^30-34におけるクロマチン繊維縮合のメカニズムを研究するために使用され、tetranucleosome ³⁵のX線構造を得ることが可能となされている。さらに最近では、それらは特定のコアヒストン変異体、突然変異体および翻訳後修飾^14-16,36...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge	Beckman-Coulter