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Method Article
この方法は、組換えコアヒストンからモデルクレオソームアレイの再構成および縦列反復ヌクレオソームのポジショニングのDNAのために提示されている。また、分析用超遠心で沈降速度実験、および原子間力顕微鏡(AFM)は、再構成後のヌクレオソームアレイ飽和の程度をモニターするために使用される方法を記載している。
繰り返しDNA分子に沿って配置されているコアヒストン八量はヌクレオソームアレイに呼ばれています。ヌクレオソームアレイは2つの方法のいずれかで得られる:in vivoでの情報源からの精製、または組換えコアヒストンからのin vitroで再構成および縦列反復ヌクレオソームのポジショニングのDNA。後者の方法は、以上の組成が均一のアセンブリーと正確に配置ヌクレオソームの配列を可能にするという利点があります。分析用超遠心で沈降速度実験は、それらが、遠心力下で溶液を通って移動する速度を解析することにより高分子のサイズおよび形状に関する情報を得た。この技術は、原子間力顕微鏡とともに、DNAテンプレートの大部分は再構成後にヌクレオソームで飽和されることを保証する品質管理のために使用することができる。ここでは、長さのミリグラム量を再構成するために必要と組成的にDのプロトコルを記述クロマチン構造および機能の生化学的および生物物理学的研究に適しefinedクレオソームアレイ。
真核生物のゲノムは、裸のDNAとして存在していないのではなく、圧縮し、結合したタンパク質で編成されています。 DNAおよびタンパク質のこれらの複合体は、クロマチンとして知られている。クロマチンの基本繰り返し単位はヌクレオソームである。ヌクレオソームは、ヒストンオクタマーと約1.6倍の1オクタマーヒストンに巻きDNAの146塩基対で構成されています。ヒストン八量体は、2つのコピーのコアヒストンH2A、H2B、H3、およびH4の各々から構成されている。繰り返しDNA分子に沿って配置されているコアヒストン八量はヌクレオソームアレイに呼ばれています。ヌクレオソームアレイの拡張構造は、10nm繊維又は「ストリング上のビーズ」構造と呼ばれ、低塩条件2の下で、インビトロで存在されている。 10 nmの繊維は、アレイ内の圧縮および/ またはアレイ間オリゴマー2を介してより高次の構造へと凝縮することができる。これらの高次構造は、塩の存在下で誘導することができるまたはヌクレオソーム配列3,4にクロマチン建築のタンパク質の結合を介して影響を与えることができる。クロマチン圧縮のレベルは反比例ビボ 5,6 内の転写速度と相関している。最近の研究では、このような分化、癌の発生、その他7,8のようなプロセスにおけるゲノムの構造組織の重要性を強調しています。クロマチン構造及び機能を研究するためのヌクレオソームアレイの使用が普及している。ここでは、組換えコアヒストンとヌクレオソーム位置決めDNAからのヌクレオソームの配列の組立のための方法を説明します。
ヌクレオソーム位置決めシーケンスのタンデムリピートで組換えDNAを使用すると、規則的な間隔のヌクレオソームを含む配列の再構成を可能にします。より一般位置決め配列の二つは、5S rRNA遺伝子配列と「601」配列である9,10。 601配列を、SELEX実験やMORから派生したE強く5Sシーケンス11よりヌクレオソームを配置します。従って、アレイ601のリンカーDNAの長さはより均質である。縦列反復ヌクレオソーム位置決めDNAをゲル濾過4,12によって得られる。組換えヒストンは、E.から精製される変性条件13歳未満の大腸菌 。組換えヒストンの使用は1注意深くヌクレオソームアレイのヒストン組成を制御することができます。例えば、特定の変異14または翻訳後修飾を有するコアヒストン15,16は、野生型コアヒストンの代わりに用いることができる。
沈降速度実験は、遠心力17の下で、溶液中の高分子の沈降速度を監視します。これは、試料中の巨大分子の大きさや形状に関する情報が得られる。沈降速度実験従って、クロマチン繊維中の溶液の状態の変化を研究するための適切なツールであるクロマチン凝縮18による構造。重要なことは、ヌクレオソーム再構成アレイにおける品質管理工程として沈降速度実験を使用することがまず必要である。 DNAおよびヌクレオソームが適切なモル比で結合されない場合、アレイは過小または過剰飽和コアヒストンとすることができる。このように、沈降速度実験から得られた情報は、ヌクレオソームDNAが適切で飽和されていることを確認するために使用される。これは、以前に特徴づけられていないDNAテンプレートを扱う場合は特に、ヌクレオソームでDNAの飽和を推定するための代替方法を使用することが重要である。したがって、我々はまた、原子間力顕微鏡(AFM)を用いてヌクレオソームアレイの分析のための方法を記載している。 AFMは、例えば、飽和レベル、ヒストン変異体又は19,20のMgCl 2の影響の存在の効果などのパラメータの数の効果の可視化を可能にする強力な技術である。 AFMはまた、アプリをされているタイムラプスイメージング21を使用してヌクレオソームのダイナミクスを研究するエド。 インビトロでは 、彼らはAFMイメージング22に適した大きさの範囲内に属しているため、ヌクレオソーム12-merの配列は原子間力顕微鏡の研究に特に適している組み立て。本研究では、品質管理だけでなく、(「百聞は一見にしかず」)のAUCからデータを肯定する手段として、ヌクレオソームアレイのAFMを使用している。単純な可視化に加えて、AFMは、追加のメトリックとしての試料の高さプロファイルの測定を可能にする。
1。八量への組換えコアヒストンの組立
理由:ヌクレオソームのアレイ再構築の最初のステップは、凍結乾燥した組換えコアヒストンからネイティブコアヒストン八量を準備することです。ヒストンタンパク質は等モル量で混合し、リフォールディング緩衝液中に変性バッファからサンプルを透析することによってヒストン八量体に組み立てられる。
注:次の日のためにカラム平衡を準備するためにステップ2.1から2.2を参照してください。
2。サイズ排除クロマトグラフィーによるヒストン八量の精製
理由:セクション1で締結した後、サンプルはヒストン八量だけでなく、このような凝集、H3/H4四量体、およびH2A/H2B二量体などの他のヒストン複合体が含まれています。ヒストン八量体は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて、これらの他の複合体から離れて精製される。
3。 DNAからのヌクレオソーム配列と精製八量の再構成
理由:ヌクレオソームアレイの再構成は、ヒストン八量と鋳型DNAを特定のモル比で結合されている必要があります。 2MのNaCl中のDNAとヒストン八量体の混合物は、イオン強度を低下させるバッファに透析ステップである。低塩への段階的な変化は、適切なヌクレオソームの形成を確実にします。 Nの取得鋳型DNAのヒストンオクタマー飽和所望のレベルにucleosomalアレイは、大規模な取再構成に続いて小規模なテスト再構成の必要になります。小規模の再構成の適切な条件によって定義を分取再構成を誘導するために使用される。
(注)減少したコストでプラスミドDNA精製のためではなく、EFFの増加ORT、一方はE.からプラスミドDNAを単離するためにフェノール/クロロホルムDNAの精製をアルカリ溶解を使用することができ大腸菌 23,24。プラスミドDNA鋳型からDNAを分離するための戦略は、鋳型DNAのサイズの変化によって変化し得る。 SECにとっては、制限酵素テンプレートプラスミドDNAの大きさの違いを最大化する方法でダイジェストを設定することが重要です。
10 mMトリスpHは7.8、1 mMのEDTA:すべてのバッファでコンポーネント。バッファ1 5-6時間(1MのNaCl、1mMのDTTを加える)。バッファ2(0.75 M NaCl、1mMのDTTを追加)で一晩。バッファ3 5-6時間(2.5のNaCl、1mMのDTTを加える)。バッファ4晩(2.5のNaCl、0.1 mMのPMSFを加える)。
注:リソースを節約するために、小規模なサンプルが下流のスクリーニングアッセイのために十分であるのに必要な最小体積を有するべきである。電子を有するためにここに記載されている沈降速度およびAFM実験のためのnoughサンプル、0.3 mg / mlのDNAを、50μlのサンプルが適切である。大規模の大きさは、調製用のサンプルは、その使用目的に依存している。大規模なサンプルは、小規模の試料と同様にして調製されるべきである。
4。再構成ヌクレオソーム配列の沈降速度解析
理由:溶液中の分子の大きさや形状にベックマンXL-A / I分析用超遠心利回り情報内沈降速度実験。低塩条件下で行わ沈降速度実験は、再構成されたアレイはヌクレオソームで飽和されている程度を決定するために使用される。
注:単一のスキャンは、測定領域がちょうど試料のメニスカス( 図2A)の前に測定を開始することによって短縮することを可能にする。 AUCは、実行中に発生するスキャンの大半は、半月板だけでなく、安定した台地( 図2B)過去の境界画分を持っている必要があります。 AUCは、細胞上の汚れたレンズが大きなスパイクでスキャンを生成することができ、これらは、データの分析に影響を与えることがある。ウルトラスキャンソフトウェアは、分析超遠心データ26の分析に関する情報のための素晴らしいリソースですマニュアルが含まれています。
5。編集と沈降速度データの分析
論理的根拠:プレーン沈降速度データは、補正された拡散沈降係数の分布が得られるプログラムによって解析されるべきである。今度はこの情報は、所与の飽和レベルを含有する再構成された試料の割合を示し、 例えば、 12-merのDNAテンプレートを使用する場合、それは10、11および12ヌクレオソーム/ DNAを有する再構成された配列の割合を決定することが可能となる。
6。原子間力顕微鏡(AFM)を用いてヌクレオソーム配列を可視化する
理由:原子間力顕微鏡はnucleosomaの飽和レベルの可視化を可能にするL·アレイ。この技術は、品質管理アッセイとしてAUCおよび制限酵素消化による沈降速度を補完する。
プロトコルを説明するために、我々は601の位置決めシーケンス(601 207×12)の12タンデム207 bpの反復からなる組換えアフリカツメガエルコアヒストンとDNAからヌクレオソームの配列を再構成した。まず、凍結乾燥されたコアヒストンからネイティブ八量を組み立てた後、S200カラム( 図1A)を使用してFPLCによって八量を精製した。より大きな複合体は、S200カラムか?...
モデルヌクレオソームアレイは、クロマチン構造及び機能のin vitro研究のための非常に有用なツールである。例えば、それらは広く溶液30-34におけるクロマチン繊維縮合のメカニズムを研究するために使用され、tetranucleosome 35のX線構造を得ることが可能となされている。さらに最近では、それらは特定のコアヒストン変異体、突然変異体および翻訳後修飾14-16,36...
著者らは、利害の衝突を持っていません。
この作品は、NIHの助成金GM45916およびGM66834 JCHし、この作品をAKための国際レット症候群財団のフェローシップでサポートされていたにもNIHがGM088409とハワードヒューズ医学研究所のKLへの貢献を助成金によって支えられて
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
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