Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטה מוצגת לכינון מחדש של מערכי nucleosomal מודל מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר tandemly. אנו גם מתארים כיצד ניסויי מהירות שקיעה בultracentrifuge האנליטיות, ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) משמשים לניטור לאחר הכינון מחדש את מידת הרוויה מערך nucleosomal.

Abstract

octamers היסטון ליבה שהם מרווחים שוב ושוב לאורך מולקולת הדנ"א נקרא מערכי nucleosomal. מערכי nucleosomal מתקבלים באחת משתי דרכים: טיהור מin vivo מקורות, או הכינון מחדש במבחנה מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר tandemly. השיטה השנייה יש את היתרון של המאפשר הרכבה של מדים compositionally יותר ומערך nucleosomal ממוקם בדיוק. ניסויי מהירות שקיעה במידע תשואת ultracentrifuge אנליטיים בערך בגודל ובצורה של מקרומולקולות על ידי ניתוח בקצב שבו הם נודדים דרך פתרון מתחת לכוח הצנטריפוגלי. טכניקה זו, יחד עם מיקרוסקופ כוח אטומי, יכולה לשמש לבקרת איכות, על מנת להבטיח כי הרוב המכריע של תבניות DNA רווי בnucleosomes לאחר הכינון מחדש. כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים הדרושים כדי לשקם את כמויות מיליגרם של אורך וcompositionally דמערכי nucleosomal efined מתאימים למחקרים ביוכימיים וbiophysical של מבנה הכרומטין ותפקוד.

Introduction

הגנום אוקריוטים לא קיים DNA עירום כ, אלא הם נדחסו ומאורגנים על ידי חלבונים מאוגדים. מתחמים אלה של ה-DNA וחלבונים ידועים כמו הכרומטין. היחידה החוזרת הבסיסית של הכרומטין היא הנוקלאוזום. הנוקלאוזום מורכב מoctamer היסטון ו146 זוגות בסיסים של DNA העטוף סביב octamer היסטון על פי 1.6 1. Octamer היסטון מורכב משני עותקים כל אחד מH2A ההיסטונים ליבה, H2B, H3 ו-H4. octamers היסטון ליבה שהם מרווחים שוב ושוב לאורך מולקולת הדנ"א נקרא מערכי nucleosomal. המבנה המורחב של מערכי nucleosomal כבר מכונה סיבי 10 ננומטר או "חרוזים על חוט" מבנה ונמצא במבחנה בתנאים דלי מלח 2. סיבי 10 ננומטר הוא מסוגלים עיבוי לתוך מבנים מסדר גבוה יותר באמצעות דחיסה תוך מערך ו / או בין המערך oligomerization 2. יכולים להיגרם מבנים מסדר גבוה יותר אלה בנוכחותם של מלחים,או יכול להיות מושפע באמצעות מחייב של חלבונים אדריכליים הכרומטין למערך nucleosomal 3,4. רמות של דחיסת הכרומטין מתואמות באופן הפוך לשיעור של שעתוק ב5,6 vivo. המחקרים אחרונים מדגיש את החשיבות של הארגון המבני של הגנום בתהליכים כגון בידול, התפתחות הסרטן, ואחרים 7,8. השימוש במערכי nucleosomal ללמוד מבנה הכרומטין ותפקוד הפך נפוצים. כאן אנו מתארים שיטה להרכבה של מערכי nucleosomal מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום.

באמצעות DNA רקומביננטי בחוזר טנדם של רצפי מיצוב הנוקלאוזום מאפשר לכינון מחדש של מערכים המכילים nucleosomes במרווח קבוע. שניים מהרצפים יותר הפופולריים המיצוב הם רצף גן 5S rRNA ו9,10 "601" הרצף. רצף 601 נגזר מהניסויים Selex ומורדואר בחריפות עמדות nucleosomes מאשר רצף 5S 11. כתוצאה מכך, אורך ה-DNA מקשר של 601 המערכים הוא הומוגנית יותר. ה-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר Tandemly מתקבלת על ידי סינון ג'ל 4,12. ההיסטונים רקומביננטי הם מטוהרים מE. coli בתנאי denaturing 13. השימוש של ההיסטונים רקומביננטי מאפשר לשלוט בזהירות את הרכב היסטון של מערכי nucleosomal. לדוגמא, ליבת ההיסטונים נושאות מוטציות ספציפיות 14 או לאחר translational שינויים 15,16 יכול להיות תחליף ההיסטונים ליבה מסוג בר.

ניסויי מהירות שקיעה לפקח על קצב השיקוע של מקרומולקולות בתמיסה תחת כוח הצנטריפוגלי הוחל 17. זה מניב מידע על הגודל וצורה של מקרומולקולות במדגם. ניסויי מהירות שקיעה הם אפוא כלי מתאים לחקר שינויי מדינת פתרון בסיבים הכרומטיןמבנה בשל עיבוי הכרומטין 18. חשוב מכך, יש צורך קודם כל להשתמש בניסויי מהירות שקיעה כצעד בקרת איכות בכינון מחדש מערך nucleosomal. אם ה-DNA וnucleosomes אינם משולבים ביחס טוחנת הראוי, המערכים עשויים להיות מתחת או עם ההיסטונים ליבה מעל הרווי. לפיכך, המידע שנצבר מניסויים מהירות שקיעה משמש כדי להבטיח כי ה-DNA הוא רווי כראוי עם nucleosomes. חשוב להשתמש בשיטות חלופיות כדי להעריך את הרוויה של DNA עם nucleosomes, במיוחד אם עובד עם תבנית ה-DNA uncharacterized בעבר. לכן, אנו גם מתארים שיטה לניתוח של מערכי nucleosomal באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). AFM הוא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הדמיה של ההשפעות של מספר הפרמטרים, כגון הרמה של רוויה, השפעה של הנוכחות של וריאנטים היסטון או את ההשפעות של MgCl 2 19,20. AFM כבר גם appliאד ללמוד דינמיקת הנוקלאוזום באמצעות זמן לשגות הדמיה 21. במבחנה התאסף מערכי 12-mer nucleosomal הם נוחים במיוחד למחקרי AFM בטווח הגודל הנכון עבור ההדמיה AFM 22 כי הם שייכים. במחקר הנוכחי השתמשנו AFM של מערכי nucleosomal כמו בקרת איכות, כמו גם כאמצעי המאשר את הנתונים מAUC ("לראות זה להאמין"). בנוסף להדמיה פשוטה, AFM מאפשר מדידה של פרופילי גובה של דגימות כמדד נוסף.

Protocol

1. הרכבה של רקומביננטי ההיסטונים ליבה לOctamers

רציונל: הצעד הראשון בכינון מחדש מערך nucleosomal הוא להכין octamers היסטון ליבת יליד מההיסטונים ליבת רקומביננטי lyophilized. חלבוני היסטון משולבים בסכומים טוחנות שווים והתאספו לתוך octamers היסטון ידי dialyzing הדגימות מתוך מאגר denaturing לקיפול מחדש של מאגר.

  1. לטהר וLyophilize ההיסטונים ליבת רקומביננטי (H2A, H2B, H3, H4) כפי שתואר 13.
  2. להמס כ 5 מ"ג של כל היסטון ליבת lyophilized ב 3 מיליליטר של חיץ התגלגלות (6 M guanidinium HCl, 20 מ"מ טריס pH 7.5, 5 מ"מ DTT). לאפשר לכל aliquot לפזר למשך שעה אחת לפחות. לוודא ששום חלבון נשאר בצידי המכל.
  3. מדוד את הספיגה של כל היסטון ב276 ננומטר באמצעות חיץ התגלגלות כנקודת התייחסות.
  4. לחשב את molarity של כל היסטון באמצעות מקדמי הכחדתם (ראה טבלת מס '1 למקדמי הכחדת היסטון Xenopus). להשוות את ריכוז הספיגה נקבעה של היסטון למשקל lyophilized היבש, וההערכה אם רוב החלבון הוא מומס.
  5. לקבוע אילו היסטון יש לך השומות הקטנות ביותר, כפי שזה יהיה מספר הגבלה של שומות לכל ההיסטונים.
  6. מערבבים את ההיסטונים בכמויות טוחנות שווים ולדלל עם התגלגלות חיץ לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר.
  7. מניחים את המדגם ל6-8 צינורות דיאליזה kDa MWCO. לאטום את צינורות ואת המקום לתוך 2 ליטר של חיץ refolding הקר (2 M NaCl, 10 מ"מ טריס pH 7.5, 1 mM EDTA, 5 מ"מ β-mercaptoethanol).
  8. Dialyze המדגם עבור 18 שעות ב 4 ° C עם ערבוב. להבטיח את צינורות הדיאליזה יכולים לסובב באופן חופשי ונמרץ, או אחר ההיסטונים עשויים לזרז.
  9. לשנות את חיץ הדיאליזה פעמיים בתקופה שעות 18 (כלומר לשנות את חיץ refolding על כל שעה 6 עד נעשה). גם אם משקע נוצר לא להשליךלדוגמא, כמה octamer עשויה להיות התאוששה אם כי התשואה תהיה ירידה.

הערה: ראה שלב 2.1-2.2 להכין איזון טור ליום המחרת.

2. טיהור Octamers היסטון ידי הרחקת כרומטוגרפיה גודל

רציונל: לאחר שסיים עם סעיף 1, דגימות תכיל octamers היסטון, כמו גם מתחמי היסטון אחרים כגון אגרגטים, tetramers H3/H4, והדימרים H2A/H2B. octamers היסטון יהיה מטוהר ממתחמים אחרים אלה באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל (SEC).

  1. חבר HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 עמודה (S200) למערכת FPLC. להבטיח כי בועות אוויר לא נכנסות למערכת.
  2. נקה את עמודת S200 עם 0.2 מיקרומטר מים מסוננים. השתמש בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר / דקה ולקבוע גבול לחץ אחורי של 0.5 מגפ"ס. ודא שיש לך מספיק מים ולאפשר לעמודה כדי לנקות בין לילה.
  3. לאזן את העמודה ומדגם לולאת S200 של ה-FPLC באמצעות קיפול מחדש של מאגר. השתמש 1 ליטר של 0.2 מיקרומטר חיץ refolding מסונן. לזרום refolding חיץ דרך העמודה בשיעור של 1 מיליליטר / דקה ולחץ מקסימאלי של 0.5 מגפ"ס במשך כ 2 שעות.
  4. לאזן רכז Vivaspin הצנטריפוגלי (50 kDa MWCO) עם 1 מיליליטר של refolding חיץ. הסר את המדגם מצינורות דיאליזה וצנטריפוגות המדגם ב 4 ° C כדי להסיר כל משקעים. פיפטה את supernatant המדגם אל הרכז. לרכז את המדגם להיקף של כ 500 μl.
  5. הסר את מדגם octamer המרוכז למכל חדש ולשטוף מרוכזים עם 1 מ"ל וקפל שוב את המאגר. לרכז את השטיפה עד 500 μl, ולהוסיף אותו למדגם octamer. זה עוזר להציל את כל octamer שנותר ברכז.
  6. ספין המדגם בצינור microfuge 1.5 מיליליטר במשך 5 דקות ב 10,000 סל"ד ב 4 ° C. לאסוף את supernatant ולהעביר לצינור חדש. זה עוזר להסיר כל משקע לפני טעינת המדגם בFPLג
  7. טען את המדגם על טור S200. טען מרבי של 1.5 נפח כולל מיליליטר או 15 octamer מ"ג בטיהור אחת.
  8. Elute המדגם באמצעות חיץ refolding טרי. השתמש בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה ומגבלת לחץ אחורית של 0.5 מגפ"ס. השתמש בשני כרכי עמודה (400 מיליליטר) refolding חיץ ולאסוף 2 מיליליטר שברים. לנטר את הספיגה ב 280 ננומטר במהלך elution. המינים השונים יהיו elute בצו של הפחתת גודל. אגרגטים היסטון בדרך כלל elute בכ 45 מיליליטר, octamer בשעה 65 מיליליטר, ודימר בסביבות 84 מיליליטר (איור 1).
  9. נתח את השברים elution מפסגות של עניין על ידי הפעלת דגימות על 18-20% SDS-PAGE. שברים המכילים octamers מטוהר צריכים כמויות טוחנות שווה של ארבעה חלבוני היסטון ליבה (איור 1).
  10. בריכת שברים המכילים octamers מטוהר, ולהתרכז ל≤ 15 מ"ג / מיליליטר עם מסנן צנטריפוגלי Vivaspin. אם נותר מהול, octamers עשויה לנתק את iהדימרים n כדי H2A/H2B וtetramers H3/H4.
  11. קבע את ריכוז octamer ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר ולחשב באמצעות מקדם הכחדה מטבלת 1.
  12. יכול להיות כל הזמן octamers היסטון לטווח קצר בחיץ refolding ב 4 ° C. אם יאוחסן לטווח ארוך, octamers יהיה יציב יותר ב -20 מעלות צלזיוס ובפתרון גליצרול 50%. Octamers מאוחסן בגליצרול יש dialyzed לחיץ refolding טרי לפני מדידות ספיגת ולהשתמש בreconstitutions מערך nucleosomal.

3. כינונה מחדש של מערכי nucleosomal מ-DNA וOctamers המטוהר

רציונל: כינונה מחדש של מערכי nucleosomal דורש כי octamers היסטון והתבנית ה-DNA להיות משולב ביחסים טוחנות ספציפיים. תערובות של octamers DNA והיסטון ב2 M NaCl הן צעד dialyzed למאגרים של צמצום כוח היוני. שינוי הדרגתי למלח נמוך מבטיח היווצרות הנוקלאוזום ראויה. קבלת nמערכי ucleosomal עם הרמה הרצויה של הרוויה octamer היסטון של ה-DNA התבנית דורש reconstitutions מבחן בקנה מידה קטנה ואחרי הכינון מחדש preparative קנה מידה גדולה. התנאים המתאימים שהוגדרו על ידי reconstitutions בקנה מידה הקטנה המשמשים כדי להנחות את הכינון מחדש preparative.

  1. לטהר DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר tandemly כמתואר 4,12. בקצרה, לבודד פלסמיד דנ"א באמצעות ערכת Qiagen GigaPrep או מוצר דומה. הגדרת הגבלת אנזים עיכול על מנת לשחרר את תבנית ה-DNA ולעכל את ה-DNA פלסמיד לגדלים קטנים יותר (700bp ≤). תבנית ה-DNA ואז יכולה להיות מטוהרת משרידי ה-DNA פלסמיד הקטנים באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל (SEC). כובד האכיל טור, בגובה של כ -115 סנטימטר ארוז עם חרוזים S-1000 Sephacryl מספיק לטיהור 601 207bp x-DNA 12mer.

הערות: לטיהור פלסמיד דנ"א במחיר ירד אבל EFF המוגבראורט, אפשר להשתמש תמוגה אלקליין עם טיהור DNA פנול / כלורופורם כדי לבודד את ה-DNA פלסמיד מE. coli 23,24. אסטרטגיות להפרדת תבנית ה-DNA מפלסמיד דנ"א עשויות להשתנות עם שינויים בגודל תבנית ה-DNA. לSEC חשוב להגדיר את הגבלת אנזים עיכול באופן שמגדיל את ההבדל בגודל בין התבנית ופלסמיד דנ"א.

  1. לקבוע אילו יחסים טוחנות (r) לשימוש עבור reconstitutions. R שווה ליחס של שומות של octamer לשומות של חוזר ה-DNA. לניסויים בקנה מידה קטנה ראשוניים, ערכי r של 0.9, 1, ו1.1 מתאימים אם הכוונה היא להשיג מערכי nucleosomal רוויים.
  2. הכן את דוגמאות בקנה מידה הקטנה על ידי חישוב כמות octamer להוסיף כ 18 מיקרוגרם של ה-DNA לכל יחס טוחנת להיבדק. מערבבים את ה-DNA וoctamers היסטון. הריכוז הסופי של NaCl במדגם צריך להיות ≥ 2 מ ', והריכוז הסופי של DNA צריך להיות סביב 0.3 מיקרוגרם / μl. תנאי חיץ המדגם הסופיים צריכים לכלול גם 10 מ"מ טריס pH 7.8, ו1 mM EDTA.
  3. הדגימות מוכנות לדיאליזה עכשיו. טען את הדגימות לתוך צינורות דיאליזה 12k-14k MWCO. Dialyze הדגימות נגד 2L של חיץ של צמצום כוח היוני כדלקמן.

רכיבים בכל המאגרים: 10 מ"מ טריס pH 7.8, 1 mM EDTA. חיץ 1 (להוסיף 1 M NaCl, 1 mM DTT) ל5-6 שעות. מאגר 2 (להוסיף 0.75 M NaCl, 1 mM DTT) למשך הלילה. חיץ 3 (להוסיף 2.5 mM NaCl, 1 mM DTT) ל5-6 שעות. חיץ 4 (להוסיף 2.5 mM NaCl, 0.1 מ"מ PMSF) למשך הלילה.

  1. הסר את הדגימות מצינורות הדיאליזה ולהמשיך לסעיפי 4-6. אם הדגימות בקנה מידה קטנה יניבו את התוצאות הרצויות, חזור על השלבים בסעיפים 3-6 בקנה המידה הגדולה.

שים לב: על מנת לחסוך במשאבים, דוגמאות בקנה מידה קטנה צריכים את הנפח המינימאלי הדרוש כדי להספיק למבחני מיון במורד הזרם. על מנת לקבל דוארהיא מוכנה לדוגמה עבור מהירות שקיעה וAFM הניסויים מופיעים כאן, 50 דגימות μl ב0.3 DNA מ"ג / מיליליטר מתאים. הגודל של בקנה מידה גדולה, דגימות preparative תלויות בשימוש המיועד שלהם. מדגם בקנה מידה גדולה צריך להיות מוכן באופן זהה לדגימות בקנה מידה הקטנה.

4. ניתוח מהירות שקיעה של מערכי nucleosomal מחדש

רציונל: שקיעה ניסויי מהירות במידע תשואת ultracentrifuge אנליטיים בקמן XL-/ אני בגודל ובצורה של מולקולות בתמיסה. ניסויי מהירות שקיעה מבוצעים בתנאים דלי מלח משמשים כדי לקבוע שלמערכים מחדש רוויים בnucleosomes המידה.

  1. לדלל את הדגימה לספיגה סביב 0.5 ב 260 ננומטר באמצעות עשרה חיץ (10 מ"מ טריס pH 7.8, 1 mM EDTA, 2.5 מ"מ NaCl). טען 400 μl של דגימה לתוך תא עם שני מרכזי במגזר, עם המדגם בצד אחד וreferenלסה"נ (TEN חיץ) ב25 האחרים. שמור את המניסקוס ההתייחסות גבוה יותר מאשר המניסקוס המדגם (כלומר להוסיף 420 פתרון התייחסות μl).
  2. טען את התאים לתוך הרוטור, וליישר את התאים באמצעות כראוי סימני חשיש על החלק התחתון של התאים והרוטור 25. בעדינות אבק העדשות של התאים באמצעות אוויר דחוס.
  3. הפעל צנטריפוגות XL-A/XL-I, הכנס את הרוטור, ולצרף ולאבטח את אופטיקה כפי שמתואר במדריך. פתח את תוכנת מעבדת Proteome ובחר קובץ: חדש.
  4. הגדרה אחת סריקה לרוץ ב3,000 סל"ד וטמפרטורה של 25 ° C. תחת אפשרויות, בחר עצירה לאחר הסריקה האחרונה, וכיול רדיאלי ריצה (כיול רדיאלי אינו נחוץ אם הרוטור היה הרוטור שעבר השתמש בAUC).
  5. עבור כל תא, שם הדגימות, בחר אורך גל (260 ננומטר), בחר הספיגה, ולבחור מיקום לשמור את הקובץ במחשב שלך. בגין אחת הסריקה ארוך.
  6. השתמש בסריקה בודדת כדי לקבוע את ra המתאיםחיוג אורך סריקה (איור 2 א). הקטנת האורך של התא שיסרק מקטינה את זמן הריצה. עם זאת, הקפד לכלול את המניסקוס המדגם ולהאריך את הסוף קרוב מאוד, או בחלק התחתון של התא.

הערה: סריקות יחידה לאפשר את אזור המדידה ללהתקצר על ידי מדידות החלו רק לפני המניסקוס המדגם (איור 2 א). רוב הסריקות שנוצרו במהלך AUC הריצה צריך להיות שברי גבול האחרונים מניסקוס, כמו גם מישורים יציבים (איור 2). עדשות מלוכלכות בתאי AUC יכולות ליצור סריקות עם קוצים גדולים, אלה עשויים להשפיע על ניתוח של הנתונים. תוכנת UltraScan כוללת מדריך לאשר הוא משאב נהדר לקבלת מידע בנוגע לניתוח של נתונים אנליטיים ultracentrifugation 26.

  1. שימוש בלוח בקרת XL-A/XL-I, להיכנס במהירות של 0 ולחצו להתחיל. פעולה זו תנחה את תא צנטריפוגות כדי למשוך ואקום וכלow את הטמפרטורה של החדר כדי לאזן. חכה 1 שעות, כדי לאפשר איזון טמפרטורה לפני תחילת ריצה.
  2. השתמש בתוכנה כדי להגדיר את הריצה עד למהירות ומספר הסריקות הרצויות. במהירויות גבוהות יותר תגדלנה את הרזולוציה, אבל צריך לאסוף לפחות 20 סריקות (רצוי יותר) לפני המדגם משקע לתחתית התא. זה נוח לכיסוי כמה הסריקות האחרונות (להשיג בתפריט האפשרויות) על מנת לעקוב אחר ההתקדמות של הריצה ולבדוק אם קיימים בעיות פוטנציאליות כגון תאים דולפים. לפקח כמה סריקות הראשונות כדי להבטיח פעולה תקינה.

5. עריכה וניתוח שקיעה מהירות נתונים

רציונל: יש לנתח את נתוני מהירות שקיעת גלם על ידי תכנית שמניבה חלוקת מקדם שקיעה המתוקנת דיפוזיה. מידע בתורו זה מציין את החלק היחסי של מדגם מחדש המכיל רמת הרוויה נתון, למשל אם משתמש בתבנית ה-DNA של 12 mer ניתן יהיה לקבוע את החלק היחסי של מערכים מחדש שיש 10, 11 ו12 nucleosomes / ה-DNA.

  1. השתמש בתוכנת ניתוח נתונים AUC כגון UltraScan כדי לערוך את הנתונים 26. עריכה של נתוני סריקה חייבת להיעשות עבור כל תא ויוצרת ערכת נתונים לניתוח שלאחר מכן. עריכה נכונה של סריקות כרוכה מגדיר את המניסקוס המדגם, הפחתת נתונים לאזור של עניין, והגדרה בסיסית, כמו גם אזורי מישור (איור 2). סריקות לא רצויות ניתן גם להסיר מהנתונים שנקבעו בשלב זה. עם זאת, מאחר שזה אפשרי כדי להסיר סריקות לא רצויות במהלך ניתוח, מומלץ כי כל הסריקות להישמר בשלב זה.
  2. אנו ממליצים בחום כי שיטת holde-Weischet אן המשופרת לשמש כדי לנתח את הנתונים 27. שיטת ניתוח זה מתקנת את ההשפעות של דיפוזיה במהלך הריצה ותשואות ההפצה נפרד ממקדמי שקיעה. בפרט, שיטת holde-Weischet אן המשופרת (כפי שמיושם בUltraScan) תאפשר להכללתה של סריקות אשר חסרים מישורים יציבים, או שיש בם שברי גבול שלא פינו את המניסקוס בניתוח 28.
  3. לקבוע את חלוקת מקדמי שקיעה למערכים המורכבים. תוצאות עבור נציג 601-12 מערכים (207bp, 12-mer) nucleosomal מוצגות באיור 3.
  4. אם אחד מהדוגמות בקנה מידה הקטנה מכיל מערכים עם הטווח הרצוי של מקדמי שקיעה, ואז לחזור על התהליך בקנה מידה מוגברת החלה בסעיף 3. אם אף אחת מהדוגמות בקנה מידה הקטנה יש חלוקה נכונה של מקדמי שקיעה לאחר מכן לחזור על הבדיקות בקנה מידה הקטנה עם מגוון r חדש המתחיל בסעיף 3.

6. חזותי nucleosomal מערכים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)

רציונל: AFM מאפשר הדמיה של רמת הרוויה של nucleosomaמערכי ליטר. טכניקה זו משלימה שקיעה מהירות על ידי AUC ועיכול אנזים הגבלה כassay בקרת איכות.

  1. שימוש בשיטות שתוארו לעיל, יש לקבל מערך רווי גם הנוקלאוזום (איור 5 א).
  2. APTES להכין טופל שקופיות נציץ על ידי הצבת ~ 30 μl 1:1,000 דילול (סיגמא אולדריץ (3-Aminopropyl) A3648-100 מ"ל triethoxysilane) מסחרי ב0.22 מיקרומטר מים nanopure מסוננים ל30 דקות.
  3. לאחר 30 דקות לשטוף APTES במים מסוננים ובעדינות לייבש אותם בזרימת חנקן.
  4. הנח מדגם מדולל כראוי הנוקלאוזום מערך (~ 1.5 ng / μl) בשקופית, דגירה מכוסה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
  5. יש לשטוף לדגום את עם חיץ מדגם מסונן, לייבש כמו בעבר, והחלק מקום על הבמה של AFM (במקרה זה מקלט מחקר MFP-3D מיקרוסקופ כוח אטומי).
  6. התחל על ידי הדמיה 2 x 2 מיקרומטר סריקות עם 512 קווי סריקה. לספור את מספר nucleosomes לברר רמת saturation (איור 5).
  7. באופן אידיאלי אתה צריך תחומים תמונה בשקופית עם מערכי הנוקלאוזום מופרדים היטב.
  8. לתמונות ברזולוציה גבוהות יותר, ניתן לקבל סריקת ננומטר 500 x 500 (איור 5 ג).
  9. יכולות להיות שטוחות תמונות ונותחו באמצעות תוכנת MFP-3D הניתנת על ידי מקלט.
  10. כל תמונה יכולה להיות מחולקת לארבעה רבעים ודהרה באופן דיגיטלי כדי לקבל תצוגה ברורה יותר של מערכים מופרדים היטב ומספר שורות יד החופשית ניתן להסיק באמצעות המערכים ופרופילי גובה מתקבלים לnucleosomes (איור 5 ג, סימן פנל גובה נכון ו5D).
  11. כמה תמונות כאלה צריכים להיות מנותחים לכל סוג של מערך המקיף של כמה מאות nucleosomes. פרופילי גובה נרשמים, מסווג וזממו ב-MS Excel.

תוצאות

כדי להמחיש את הפרוטוקול אנחנו מחדש מערכי nucleosomal מההיסטונים רקומביננטי Xenopus הליבה וה-DNA המורכב מבד בבד 12 207 חוזרים נ"ב של רצף 601 מיצוב (601 207 x 12). אנחנו התאספנו ראשון octamers יליד מההיסטונים ליבת lyophilized ולאחר מכן מטוהרים octamers ידי FPLC באמצעות עמודת S200 (איור 1 א).<...

Discussion

מערכי nucleosomal מודל הם כלי מאוד שימושי עבור המחקר במבחנה של מבנה הכרומטין ותפקוד. לדוגמא, הם היו בשימוש נרחב כדי ללמוד את המנגנון של עיבוי הכרומטין סיבים בפתרון 30-34, ועשו את זה ניתן להשיג מבנה צילום רנטגן של tetranucleosome 35. לאחרונה הם הוכיחו שימושיים בפענוח ה...

Disclosures

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי GM45916 וGM66834 לJCH ומלגה מהקרן הבינלאומית תסמונת רט לAK עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק NIH GM088409 והמכון רפואי הווארד יוז תרומות לKL

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent/MaterialCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)triethoxysilaneSigma-Aldrich A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis TubingFisher21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 ColumnGE17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal ConcentratorSartoriusVS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis TubingFisher08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 SuperfineGE17-0476-01
XL-A/I Analytical UltracentrifugeBeckman-Coulter

References

  1. Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 7, (1997).
  2. Hansen, J. C. Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).
  3. McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  4. Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1. Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).
  5. Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions. The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).
  6. Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).
  7. Nguyen, C., Gonzales, F. chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).
  8. Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure. Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).
  9. Simpson, R. T., Stafford, D. W. Structural features of a phased nucleosome core particle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).
  10. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  11. Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences. Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).
  12. Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *. The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).
  13. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).
  14. McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).
  15. Ma Shogren-Knaak, ., Fry, C. J., Peterson, C. L. A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications. The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).
  16. Lu, X., Simon, M. The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure. Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).
  17. Ausio, J. Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure. Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).
  18. Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution. Methods. 12 (1), 62-72 (1997).
  19. Montel, F., Menoni, H., et al. The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin. Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).
  20. Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays. The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).
  21. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  22. Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling. Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).
  23. Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  24. Sambrook, J., Russell, D. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).
  25. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).
  26. Demeler, B. UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments. Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).
  27. Holde, K. V., Weischet, W. Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes. Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).
  28. Demeler, B., van Holde, K. E. Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems. Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).
  29. Hansen, J., Lohr, D. Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays. Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).
  30. Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).
  31. Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).
  32. Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).
  33. Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding. The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).
  34. Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt. Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).
  35. Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).
  36. Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states. Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).
  37. Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding. Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).
  38. Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined "30 nm" Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone. Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).
  39. Dorigo, B., Schalch, T. Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail. J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).
  40. Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM. Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

79NucleosomesAFMnucleosomalultracentrifugation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved