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Method Article
Se presenta un método para la reconstitución del modelo nucleosomal arrays de histonas y el ADN recombinante posicionamiento de nucleosomas en tándem repetido. También describe cómo se utilizan los experimentos de velocidad de sedimentación en la ultracentrífuga analítica y microscopía de fuerza atómica (AFM) para supervisar el grado de saturación de gama nucleosomal después de la reconstitución.
Octamers histonas centrales que son repetidamente espaciados a lo largo de una molécula de ADN se denominan matrices nucleosomal. Nucleosomal arrays se obtienen en una de dos maneras: la purificación a partir de fuentes in vivo, o la reconstitución in vitro de histonas del núcleo recombinantes y de ADN posicionamiento nucleosoma repetidas en tándem. El último método tiene la ventaja de permitir para el montaje de un uniforme más de composición y matriz nucleosomal posicionado con precisión. Experimentos de velocidad de sedimentación en la información de rendimiento ultracentrífuga analítica sobre el tamaño y la forma de las macromoléculas mediante el análisis de la tasa a la que migran a través de la solución bajo la fuerza centrífuga. Esta técnica, junto con microscopía de fuerza atómica, se puede utilizar para el control de calidad, garantizando que la mayoría de las plantillas de ADN están saturados con nucleosomas después de la reconstitución. Aquí se describen los protocolos necesarios para reconstituir cantidades de miligramos de longitud y compositivamente dnucleosomal arrays efined adecuados para los estudios bioquímicos y biofísicos de la estructura y función de la cromatina.
Genomas eucariotas no existen como ADN desnudo, sino que más bien se compactan y organizados por proteínas unidas. Estos complejos de ADN y de proteínas se conocen como cromatina. La unidad de repetición básica de la cromatina es el nucleosoma. Un nucleosoma consta de octámero de histonas y 146 pares de bases de ADN enrollado alrededor del octámero de histonas alrededor de 1,6 veces 1. El octámero de histona se compone de dos copias de cada uno de la H2A histonas del núcleo, H2B, H3, y H4. Octamers histonas centrales que son repetidamente espaciados a lo largo de una molécula de ADN se denominan matrices nucleosomal. La estructura extendida de matrices nucleosomal se ha referido como la fibra de 10 nm o las "cuentas en una cadena" estructura y está presente in vitro bajo condiciones de poca sal 2. La fibra de 10 nm es capaz de condensar en estructuras de orden superior a través de la compactación dentro de la matriz y / o inter-array oligomerización 2. Estas estructuras de orden superior pueden ser inducidas en presencia de sales,o puede ser influenciada a través de la unión de las proteínas de arquitectura de la cromatina a la matriz nucleosomal 3,4. Los niveles de compactación de la cromatina se correlacionan inversamente con la tasa de transcripción en 5,6 vivo. La investigación reciente pone de relieve la importancia de la organización estructural de los genomas en procesos tales como la diferenciación, el desarrollo del cáncer, y otros 7,8. El uso de matrices nucleosomal para estudiar la estructura y función de la cromatina se ha generalizado. Aquí se describe un método para el montaje de matrices nucleosomal de histonas y el ADN recombinante posicionamiento de nucleosomas.
El uso de ADN recombinante con repeticiones en tándem de secuencias de posicionamiento de nucleosomas permite la reconstitución de matrices que contienen nucleosomas regularmente espaciados. Dos de las secuencias de posicionamiento más populares son la secuencia del gen 5S rRNA y el "601" secuencia de 9,10. La secuencia 601 se deriva a partir de experimentos de SELEX y More posiciona fuertemente nucleosomas que la secuencia 5S 11. En consecuencia, la longitud del ADN enlazador de las matrices 601 es más homogénea. El posicionamiento de nucleosomas ADN repetidas en tándem se obtiene por filtración en gel 4,12. Histonas recombinantes se purificaron a partir de E. coli en condiciones de desnaturalización 13. El uso de las histonas recombinantes permite controlar cuidadosamente la composición de la histona de las matrices nucleosomal. Por ejemplo, el núcleo de histonas teniendo mutaciones específicas 14 o las modificaciones posteriores a la traducción 15,16 puede ser sustituido por histonas de tipo salvaje.
Experimentos de velocidad de sedimentación supervisar la tasa de sedimentación de las macromoléculas en solución bajo una fuerza centrífuga aplicada 17. Esto produce información sobre el tamaño y la forma de las macromoléculas en una muestra. Experimentos de velocidad de sedimentación son, pues, un instrumento adecuado para el estudio de los cambios de estado de soluciones en fibra de cromatinaestructura debido a la condensación de la cromatina 18. Es importante destacar que, en primer lugar es necesario el uso de experimentos de velocidad de sedimentación como un paso de control de calidad en la reconstitución matriz nucleosomal. Si el ADN y nucleosomas no se combinan en la proporción molar adecuado, las formaciones pueden ser sub o sobre-saturado de histonas. Por lo tanto, la información obtenida a partir de experimentos de velocidad de sedimentación se utiliza para asegurar que el ADN está saturado correctamente con nucleosomas. Es importante utilizar métodos alternativos para estimar la saturación de ADN con nucleosomas, especialmente si se trabaja con una plantilla de ADN no caracterizado previamente. Por lo tanto, también se describe un método para el análisis de matrices nucleosomal utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). AFM es una técnica poderosa que permite la visualización de los efectos de una serie de parámetros, tales como el nivel de saturación, efecto de la presencia de variantes de histonas o los efectos de MgCl 2 19,20. AFM también ha sido aplied para estudiar la dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de lapso de tiempo 21. In vitro reunidos nucleosomal arrays 12-mer son particularmente susceptibles a los estudios de AFM porque pertenecen en el rango de tamaño adecuado para imágenes de AFM 22. En el presente estudio hemos utilizado AFM de matrices nucleosomal como control de calidad, así como un medio de afirmación de los datos de AUC ("ver para creer"). Además de la visualización sencilla, AFM permite la medición de perfiles de altura de muestras como una métrica adicional.
1. Asamblea de recombinantes Core histonas en octamers
Justificación: El primer paso para la reconstitución array nucleosomal es preparar octamers histonas nativas de histonas recombinantes liofilizadas. Las proteínas histonas se combinan en cantidades molares iguales y se montan en octámeros histonas dializando las muestras de un tampón desnaturalizante en tampón de replegamiento.
Nota: Consulte el paso 2.1-2.2 para preparar equilibrado de la columna para el día siguiente.
2. Purificación de histonas octamers por tamaño Cromatografía de exclusión
Justificación: Después de concluir con la sección 1, las muestras contendrán octamers histonas, así como otros complejos de histonas como agregados, tetrámeros H3/H4 y dímeros H2A/H2B. Octámeros histonas se pueden purificar lejos de estos otros complejos usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC).
3. Reconstitución de nucleosomal matrices de ADN y se purificó octamers
Justificación: La reconstitución de nucleosomal arrays requiere que octamers histonas y ADN molde se combinan en proporciones molares específicos. Las mezclas de ADN y las histonas octámeros en NaCl 2 M son paso dializaron en tampones de fuerza iónica decreciente. Un cambio gradual a la sal inferior asegura la formación de nucleosomas adecuada. La obtención de nmatrices ucleosomal con el nivel deseado de saturación de octámero de histona del ADN molde requiere pequeñas reconstituciones de prueba a escala seguido de una reconstitución preparativa a gran escala. Las condiciones apropiadas definidas por las reconstituciones pequeña escala se utilizan para guiar la reconstitución preparativa.
Notas: Para la purificación de ADN plásmido a un costo disminuyó, pero aumentó efORT, uno puede utilizar lisis alcalina con la purificación de ADN con fenol / cloroformo con el fin de aislar el ADN plásmido a partir de E. coli 23,24. Estrategias para la separación de la plantilla de ADN de plásmido de ADN puede variar con cambios en la plantilla de tamaño de ADN. Para la SEC, es importante establecer la enzima de restricción digerir de una manera que maximiza la diferencia de tamaño entre la plantilla y el ADN plásmido.
Componentes en todos los búferes: 10 mM de Tris pH 7,8, EDTA 1 mM. Buffer 1 (añadir NaCl 1 M, DTT 1 mM) durante 5-6 horas. Buffer 2 (añadir NaCl 0,75 M, DTT 1 mM) durante la noche. Buffer 3 (añadir NaCl 2,5 mM, DTT 1 mM) durante 5-6 horas. Buffer 4 (añadir NaCl 2,5 mM, 0,1 mM PMSF) durante la noche.
Nota: Con el fin de conservar los recursos, las muestras a pequeña escala deben tener el volumen mínimo necesario para ser suficiente para ensayos de selección de aguas abajo. Con el fin de tener correonough muestra para los experimentos de velocidad de sedimentación y AFM enumerados aquí, 50 l de muestras de ADN en 0.3 mg / ml son apropiados. El tamaño de gran escala, muestras preparativas dependen de su uso previsto. Una muestra a gran escala se debe preparar de la misma manera que las muestras a pequeña escala.
4. Análisis de la velocidad de sedimentación de reconstituido nucleosomal arrays
Justificación: Sedimentación experimentos de velocidad en la información de rendimiento ultracentrífuga analítica Beckman XL-A / I sobre el tamaño y la forma de las moléculas en solución. Experimentos de velocidad de sedimentación realizados en condiciones de baja sal se utilizan para determinar el grado en que las matrices reconstituidas se saturan con nucleosomas.
Nota: los análisis individuales permiten que el área de medición para ser acortado por mediciones comenzando justo antes de que el menisco de la muestra (Figura 2A). La mayoría de las exploraciones generadas durante la ejecución de la AUC debe tener fracciones de límites últimos del menisco, así como mesetas estable (Figura 2B). Lentes sucias en las células de las AUC pueden generar imágenes escaneadas con grandes picos, estos pueden afectar el análisis de los datos. El software UltraScan incluye un manual que es un gran recurso para obtener información sobre el análisis de los datos de ultracentrifugación analítica 26.
5. Edición y análisis de datos de la velocidad de sedimentación
Justificación: datos de la velocidad de sedimentación Raw deben ser analizados por un programa que produce una distribución coeficiente de sedimentación de difusión corregido. Esta información, a su vez indica la fracción de una muestra reconstituida que contiene un nivel de saturación dada, por ejemplo, si el uso de una plantilla de ADN de 12-mer que será posible determinar la fracción de matrices reconstituidas que tiene 10, 11 y 12 nucleosomas / ADN.
6. Visualizar Nucleosomal matrices mediante Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)
Justificación: AFM permite la visualización del nivel de saturación del nucleosomal matrices. Esta técnica complementa la velocidad de sedimentación por el AUC y la digestión con enzimas de restricción como un ensayo de control de calidad.
Para ilustrar el protocolo que reconstituido nucleosomal arrays de histonas del núcleo de Xenopus recombinantes y ADN que consiste en 12 repeticiones tándem de 207 pb de la secuencia 601 de posicionamiento (601 207 x 12). En primer lugar, reunido octámeros nativos de histonas del núcleo liofilizadas y después se purificó los octámeros mediante FPLC utilizando una columna S200 (Figura 1A). Complejos más grandes eluyen antes de la columna de la S200. Las histonas se eluyen gene...
Nucleosomal arrays modelo son una herramienta muy útil para el estudio in vitro de la estructura y función de la cromatina. Por ejemplo, han sido ampliamente usado para estudiar el mecanismo de la fibra de cromatina de condensación en solución 30-34, y hecho posible la obtención de una estructura de rayos x de un Tetranucleosome 35. Más recientemente han demostrado ser útiles en el desciframiento de los efectos estructurales de las variantes de las histonas núcleo específico, muta...
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones GM45916 y GM66834 a JCH, y una beca de la Fundación Internacional del Síndrome de Rett a AK Este trabajo también fue apoyado por el NIH subvención GM088409 y el Instituto Médico Howard Hughes contribuciones a KL
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
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