نقص التروية Photothrombotic: A الضوئية نموذج الآفات القشرية المناظير وقابلة للتكرار للدراسات السكتة الدماغية ماوس

Summary

Photothrombosis هو وسيلة سريعة وتقنية الحد الأدنى الغازية لإحداث احتشاء الصغيرة وكذلك بفواصل في المجالات ذات الاهتمام بطريقة استنساخه للغاية. انها مناسبة خاصة لدراسة الاستجابات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء اللدونة الدماغ في الفئران المعدلة وراثيا.

Abstract

ويهدف نموذج السكتة الدماغية photothrombotic للحث على الأضرار الدماغية داخل منطقة القشرية يعطى عن طريق الصور تفعيل صبغة حساسة للضوء حقن سابقا. بعد إضاءة، يتم تنشيط الصبغة وينتج الأكسجين القميص أن مكونات أضرار من أغشية الخلايا البطانية، مع تراكم الصفائح الدموية وتكوين الجلطات اللاحقة، والذي يحدد في نهاية المطاف انقطاع تدفق الدم المحلية. تم تحسين هذا النهج، اقترح في البداية من قبل روزنبلوم وش الصبان في عام 1977، في وقت لاحق من قبل واطسون في عام 1985 في دماغ الفئران وتعيين أساس النموذج الحالي. أيضا، ساهمت زيادة توافر خطوط الماوس المعدلة وراثيا أخرى لرفع الفائدة على نموذج photothrombosis. لفترة وجيزة، يتم حقن صبغة حساس (روز البنغال) الغشاء البريتونى ويدخل مجرى الدم. عندما تضاء بواسطة مصدر ضوء بارد، يصبح صبغ تنشيط ويدفع الضرر البطانية مع تنشيط الصفائح الدموية وتخثر الدم، مما أدى إلى المحليةتدفق انقطاع الدم. يمكن تطبيقها مصدر الضوء على الجمجمة سليمة مع عدم وجود الحاجة من حج القحف، والذي يسمح استهداف أي منطقة القشرية ذات الاهتمام بطريقة متكررة وغير الغازية. ثم يتم خياطة الماوس وسمح ليستيقظ. تقييم الأضرار الدماغية يمكن أن يتحقق بسرعة عن طريق كلوريد ثلاثي فينيل-تترازوليوم أو الكريزيل تلطيخ البنفسجي. هذه التقنية تنتج احتشاء من صغر حجمها وحدودها جيدا محدد، وهو أمر مفيد للغاية لتوصيف خلية دقيقة أو دراسات وظيفية. وعلاوة على ذلك، انها مناسبة خاصة لدراسة الاستجابات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء اللدونة الدماغ في الفئران المعدلة وراثيا.

Introduction

في بداية القرن 21th، السكتة الدماغية هو اضطراب المدمر الذي يمثل السبب الثاني للإعاقة على المدى الطويل ⁽¹⁾ والسبب الثاني للوفيات في جميع أنحاء العالم، والتي تمثل في السكتة الدماغية لحوالي 5،7 مليون حالة وفاة في عام 2004 ^2. على الرغم من الجهود العديدة التي وضعت في، لا يوجد حتى الآن علاج فعال المتاحة لتحسين الانتعاش وظيفية بعد السكتة الدماغية. وتستخدم النماذج الحيوانية من السكتة الدماغية على نطاق واسع في مجال البحث السكتة الدماغية لأنها تسمح النمذجة من الفيزيولوجيا المرضية لنقص تروية الضرر واختبار فعالية استراتيجيات اعصاب مختلفة في الجسم الحي. معظم هذه النماذج تهدف للحث على احتشاء اسعة النطاق عن طريق قطع (مؤقتا أو بشكل دائم) تدفق الدم داخل الشريان الدماغي الأوسط، في حين تم تطوير نماذج أخرى لدراسة آفات صغيرة الحجم في مجالات محددة، وعادة المحرك والقشور الحسية الجسدية. ومع ذلك، قد العديد من العوامل التي تساهم في توليد التيار المتردددرجة ertain من التباين في الدراسات التجريبية السكتة الدماغية، بما في ذلك السلالة الماوس المستخدمة، والعمر والجنس من الحيوانات التي شملتها الدراسة، وقبل كل شيء، اعتمدت تقنية للحث على الأضرار الدماغية. فيما يتعلق بهذه النقطة الأخيرة، ومدة والغازية من عملية جراحية (أي الحاجة إلى حج القحف) فضلا عن مهارة الجراحية اللازمة للمشغل للحث موثوق آفة الدماغية هي العوامل الحاسمة لنجاح وغير متحيزة في الدراسة المجراة السكتة الدماغية .

مفهوم photothrombosis واقترح في البداية من قبل روزنبلوم وش الصبان في عام 1977 ³ وأصبحت مشهورة من خلال تطبيقه في دماغ الفئران من قبل واتسون وآخرون في عام 1985 في ⁴ والتي تم تحسين تقنية إلى حد كبير وتعيين أساس النموذج الحالي ^{3 - 6.} ويهدف النهج photothrombotic للحث على احتشاء القشرية من خلال الصورة تفعيل صبغة حساسة للضوء تسليمها مسبقا في نظام الدم، WHالتراث الثقافي غير المادي يؤدي إلى تخثر الأوعية المحلية في المناطق المعرضة للضوء. عندما يضيء الصبغة المنتشرة في الطول الموجي المناسب من مصدر ضوء بارد، فإنه يطلق الطاقة إلى جزيئات الأكسجين، والتي بدورها تولد كمية كبيرة من الأكسجين شديدة التفاعل منتجات القميص. هذه وسيطة الأكسجين لحث الخلية البطانية بيروكسيد الغشاء، مما يؤدي إلى التصاق الصفائح الدموية وتجميعها، وفي نهاية المطاف إلى تشكيل الجلطة الدموية التي تحدد محلية انقطاع تدفق الدماغي ^7.

Photothrombosis هو نموذج الدماغية غير المقبول أن لا تسد الشريان أو كسر واحد فقط كما يحدث عادة في السكتة الدماغية الإنسان، ولكن يحرض الآفات في الأوعية أكثر سطحية، والذي ينتج في انقطاع الانتقائي لتدفق الدم في المناطق المعرضة للضوء. لهذا السبب، قد تكون مناسبة هذا النهج للدراسات الخلوية والجزيئية من اللدونة القشرية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية تكمن في بساطته التنفيذ.وعلاوة على ذلك، photothrombosis لا يمكن أن يؤديها بسهولة في ما يقرب من أربعين دقيقة لكل حيوان، بما في ذلك الانتظار عشرين دقيقة (3 دقائق للتخدير؛ 1 دقيقة حلق فروة الرأس؛ 3-5 دقيقة إلى وضع الحيوان على جهاز التجسيمي؛ 2 دقيقة لتنظيف فروة الرأس بمحلول مطهر، وجعل شق وتنظيف الجمجمة؛ 2-4 دقيقة لوضع الألياف الباردة الخفيفة؛ 1 دقيقة لحقن محلول البنغال روز؛ 5 مين الانتظار لنشرها داخل الصفاق؛ 15 دقيقة من الإضاءة؛ و 5 دقائق لل تنظيف الجرح وخياطة الحيوان). وعلاوة على ذلك، ليس هناك حاجة إلى الخبرة الجراحية لأداء هذه التقنية كما هو فعل الآفة من خلال إضاءة بسيطة من الجمجمة سليمة. على عكس انسداد الشرايين الكلاسيكية، ويحدد هذا الأسلوب الانتقائي للانسداد microvessels حنوني وintraparenchymal داخل المنطقة المعرضة للإشعاع ويقلل من التباين بين الآفات كما هو ترك أي سفينة ضمانات لتوريد الأكسجين في المنطقة المستهدفة.

على الرغم من طبيعته وجه الخصوص،أسهم الضرر photothrombotic الآليات الأساسية التي تحدث في الدماغ السكتة الدماغية. وبالمثل لانسداد شريان في المخ البشري، تراكم الصفائح الدموية وتكوين جلطة تحديد انقطاع تدفق الدم في المنطقة المعرضة للإشعاع ^7. وبالمثل، وأسهم هذا النموذج أيضا الاستجابات الالتهابية الأساسية كما هو الحال في وسط انسداد الشريان الدماغي ^8. ومع ذلك، ونظرا للحدود جيدا ترسيم الرف القاري، والمنطقة الناقص، والتي تتطابق مع مساحة التمثيل الغذائي الحفاظ جزئيا، يتم تخفيض جدا أو منعدمة بعد الآفة photothrombotic. وهذا يمكن أن الحدود واضحة تيسير دراسة الاستجابات الخلوية داخل الدماغية أو سليمة المنطقة القشرية. نموذج الفأر Photothrombosis هو مناسبة خاصة للدراسات السكتة الدماغية في مجموعة متنوعة من الحيوانات المعدلة وراثيا. في الواقع النماذج الكلاسيكية لا يمكن أن يصلح لجميع السلالات والدراسات فترة طويلة في C57BL / 6 اشتكوا من ضغوط الماوس نسبة الوفيات العالية التي يمكن أن تسبب التحيز ^9.

Protocol

1. بعد الجراحة قبل

1. زن روز البنغال في أنبوب 1.5 مل وتذوب في محلول ملحي معقم حتى التوصل إلى تركيز النهائي من 15 ملغ / مل. فلتر تعقيم من خلال مرشح ميكرون 0.2 وتخزينه في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة أقصاها شهران.
2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية بواسطة التعقيم. يجب تعقيم منطقة العمليات الجراحية أقل من ساعة واحدة قبل الشروع في عملية جراحية.
3. تسجيل وزن الجسم الماوس لضبط جرعة من روز البنغال ليتم حقنه. نحن حقن 10 ميكرولتر / غرام من وزن الحيوان في الإناث CD1 الفئران 12 أسابيع من العمر في هذا البروتوكول. كمية روز البنغال اللازمة لإنتاج المطلوب القشرية حجم الآفة يمكن تحديد بسهولة في مجموعة منفصلة من التجارب الأولية عن طريق اختبار جرعات مختلفة (عادة 2 ميكرولتر / ز، 5 ميكرولتر / ز أو 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم). لاحظ أن كمية روز البنغال ليتم حقنه تعتمد بشكل كبير على ظروف التجربة، ولا سيما نوع من مصدر الضوءالمستخدمة ومدة التعرض للضوء. في هذه الدراسة، و 10 ميكرولتر / ز (150 ميكروغرام / غرام) تم العثور على جرعة ضروريا للحث على photothrombosis عند التعرض للضوء لمدة 15 دقيقة، في حين أفادت جماعات آخرون أن إما 50 ميكروغرام / غرام ^6،8 و 100 ميكروغرام / غرام وكان ¹⁰ حقن داخل الصفاق كافية لإحداث آفة photothrombotic.

2. إجراء التخدير

1. تخدير الفئران مع isoflurane وفي غرفة تحريض شفافة (3.5-4٪ لتحريض، 1.5-2٪ للحفاظ على) في 50٪ (V / V) oxygen/50٪ (V / V) ثنائي النتروجين أول أكسيد خليط الغاز. التخدير الغازية يسمح أعقاب سريعة حتى من الحيوانات ومستوى غاز مخدر يمكن تعديلها بسهولة. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن يكون تخدير الفئران بواسطة خليط الكيتامين-زيلازين.
2. عندما يتم التوصل إلى عمق التخدير، وإزالة تخدير الحيوان من غرفة الاستقراء، وضعه في الإطار التجسيمي والحفاظ على التخدير باستخدام قناع الوجه. ضبط isofluraشمال شرق الجرعة إلى تحقيق مستوى التخدير الكافي. رصد معدل التنفس في جميع أنحاء الداخلي والتأكد من أنها ثابت (40 - 60 نفسا في الدقيقة).
3. استخدام القرصات اصبع القدم من أجل ضمان هذا الحيوان هو مخدرة بعمق.
4. تطبيق مرهم العين، من أجل منع العينين من الجفاف.
5. إدراج بلطف التحقيق المستقيم لرصد درجات الحرارة في جميع أنحاء العمليات الجراحية. تعيين يرتبط بها من لوحة التدفئة التي تسيطر عليها ردود فعل للحفاظ على درجة حرارة الجسم الماوس عند 37 ± 0.5 درجة مئوية.

3. عملية جراحية لإضاءة المنطقة المستهدفة

1. حلق فروة الرأس الفأر مع الحلاقة الكهربائية.
2. تأمين بحزم الرأس وإدراج أشرطة الأذن في الصماخ الخارجي. يجب الحرص على عدم تلف طبلة الأذن.
3. تطهير الجلد على سطح بالتناوب مع الضربات الشديدة من الايثانول 70٪ وبتدين باستخدام قطعة قطن.
4. استخدام مشرط لجعل شق على طول خط الوسط من جنيه العينفيل وصولا الى الرقبة. تطبيق الكامشات الجلد للحفاظ على الجمجمة عرضة للخطر.
5. سحب بلطف periostium إلى حواف الجمجمة مع مشرط، والسماح للسطح الجمجمة الجافة باستخدام قطعة قطن معقمة. تحديد و bregma امدا. وضع micropipette الزجاج على bregma كنقطة مرجعية، ثم نقله إلى إحداثيات المنطقة اهتمامك. منطقة الفائدة الذي تم اختياره لهذا المقال هو تقريبا على شكل بشدة، تركزت حوالي 2 مم الوحشي على bregma، وتغطي مساحة قدرها حوالي 30 مم ^2، والذي يتضمن جزءا كبيرا من القشرة الحسية وفقا لمخ الفأر أطلس من قبل فرانكلين و Paxinos ^11.
6. جعل الموقف في المصالح مع النقاط المرجعية ووضع الألياف البصرية في اتصال وثيق مع سطح الجمجمة لتجنب تشتت الضوء ولكن الاهتمام لا لممارسة الضغوط عليها. المنطقة المضاءة يمكن تقييد من خلال تطبيق على الجمجمة قناع مع فتحة صغيرة أو قبعة في غيض من الألياف البصرية واجهة المستخدم الرسوميةدي.

4. روز البنغال وحقن التنشيط

1. تحميل حل البنغال روز في 1 مل حقنة وحساب المبلغ ليتم حقنه وفقا لجرعة من 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم.
2. انتقل إلى حقنة داخل الصفاق بطيئة.
3. دع منتشر صبغ وتدخل مجرى الدم. بعد 5 دقائق، والتبديل على إضاءة الضوء البارد. تجنب الإضاءة من الحيوان من قبل أي مصدر آخر للضوء. استخدمنا إضاءة الألياف البصرية من 150 W كثافة.
4. بعد 15 دقيقة من إضاءة، والتوقف عن التعرض للضوء وخياطة الجرح. خمس دقائق من الإضاءة تنتج بالفعل احتشاء و 10 دقيقة ومن المرجح كاف للحصول على تأثير القصوى ^12. من أجل تقليل التباين، ونختار لإلقاء الضوء لمدة 15 دقيقة.

5. خياطة

1. إزالة الكامشات الجلد وتطبيق محلول ملحي معقم لتجنب الجفاف.
2. قرب الجرح باستخدام عكس القطع needl له والحرير أو النايلون خيوط الجروح.
3. يقطع تسليم التخدير، وإزالة بعناية الماوس من جهاز التجسيمي ووضعها على وسادة التدفئة قبل تحسنت حتى يكون مستيقظا تماما، ثم إعادته إلى قفصه. وينبغي رصد درجة حرارة الجسم بعناية في جميع أنحاء إجراءات للحد من التقلبات في تمديد احتشاء. وفقا لتركيز وطريقة التعاطي، وردة لا يزال من الممكن الكشف عن البنغال في مجرى الدم لعدة ساعات بعد الحقن ^13. يفضل بطانية التدفئة إلى مصباح الاحترار لتجنب الأضرار المحتملة الثانوي (روز البنغال امتصاص الطول الموجي هو في الطيف الأخضر).

النتائج

سوف يشكل هذا البروتوكول تنتج الآفة القشرية التي هي بالفعل واضحة على تشريح من القشرة للعين المجردة (أرقام 1A-1C). الآفة photothrombotic يتطور في الطبقات القشرية سطحي وعميق في الأنسجة التي هي شفافة بما فيه الكفاية للسماح الصور تفعيل روز البنغال. قياس مدى احتشاء دماغي لا...

Discussion

التعديلات والتبديلات

بسبب ذروة امتصاصه في 562 نانومتر، ليزر الضوء الأخضر من مصباح قوس الزينون تصفيتها تم اختياره أصلا لأشرق على حساس روز البنغال. على الرغم من الإثارة ليزر بوساطة كانت لا تزال تستخدم recently5، ويمكن أن تحل محلها مصباح ض...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made