Isquemia Photothrombotic: Um Modelo de lesão cortical fotoquímica Minimamente Invasiva e reprodutível para mouse Estudos curso

Resumo

Fototrombose é uma técnica rápida, minimamente invasiva para induzir pequena e bem delimitada infarto em áreas de interesse de maneira altamente reprodutível. É particularmente adequado para o estudo de respostas celulares e moleculares subjacentes plasticidade cerebral em ratinhos transgénicos.

Resumo

O modelo de acidente vascular cerebral photothrombotic visa induzir um dano isquêmico dentro de uma determinada área cortical, por meio de foto-ativação de um corante sensível à luz anteriormente injetado. Após iluminação, o corante é activado e produz oxigénio singuleto que danifica os componentes das membranas das células endoteliais, com subsequente agregação de plaquetas e formação de trombos, a qual, eventualmente, determina a interrupção do fluxo sanguíneo local. Esta abordagem, inicialmente proposto por Rosenblum e El-Sabban em 1977, foi posteriormente melhorado por Watson em 1985, em cérebro de rato e definir a base do modelo atual. Além disso, o aumento da disponibilidade de linhas de camundongos transgênicos contribuiu ainda mais para aumentar o interesse no modelo fototrombose. Resumidamente, um corante fotossensível (Rosa de Bengala) é injectado intraperitonealmente e entra na corrente sanguínea. Quando iluminada por uma fonte de luz fria, o corante torna-se activada e induz lesão endotelial com a activação de plaquetas e trombose, resultando em locaisinterrupção do fluxo sanguíneo. A fonte de luz pode ser aplicada sobre o crânio intactos, sem necessidade de craniotomia, o que permite direccionamento de qualquer área cortical de interesse de uma forma reprodutível e não-invasiva. O rato é então suturada e permitiu acordar. A avaliação do dano isquémico pode ser rapidamente realizada por cloreto de trifenil-tetrazólio e de coloração com violeta cresil. Esta técnica produz enfarte de pequena dimensão e aos limites bem delimitadas, o que é altamente vantajosa para a caracterização de células precisas ou estudos funcionais. Além disso, é particularmente adequado para estudar as respostas celulares e moleculares subjacentes plasticidade cerebral em ratinhos transgénicos.

Introdução

No início do século 21, acidente vascular cerebral isquêmico é uma doença devastadora que representa a segunda causa de incapacidade a longo prazo e ^uma a segunda causa de mortalidade no mundo, no qual AVC foi responsável por aproximadamente 5,7 milhões de mortes em 2004 ^2. Apesar dos muitos esforços que foram colocadas em, ainda não existe um tratamento eficaz disponível para melhorar a recuperação funcional após o acidente vascular cerebral. Os modelos animais de acidente vascular cerebral são amplamente utilizados no campo da pesquisa do curso, pois permitem a modelagem da patofisiologia da lesão isquémica e testar a eficácia de diferentes estratégias neuroprotectoras in vivo. A maioria destes modelos visam induzir infartos extensos, interrompendo (temporariamente ou permanentemente) o fluxo de sangue dentro da artéria cerebral média, enquanto que outros modelos foram desenvolvidos para o estudo de lesões de pequeno porte em áreas específicas, normalmente o motor eo córtex somatossensorial. No entanto, vários fatores podem contribuir para gerar acertain grau de variabilidade no curso estudos experimentais, incluindo a estirpe de ratinhos utilizada, a idade e o sexo dos animais incluídos no estudo e, acima de tudo, a técnica utilizada para induzir o dano isquémico. No que diz respeito a este último ponto, a duração e invasividade da cirurgia (isto é, a necessidade de uma craniotomia), assim como a habilidade cirúrgica necessária para o operador para induzir lesão isquémica de forma confiável são determinantes críticos para o sucesso e imparcial em estudo in vivo AVC .

O conceito de fototrombose foi inicialmente proposto por Rosenblum e El-Sabban em 1977 ³ e tornou-se famoso pela sua aplicação em cérebro de rato por Watson et al, em 1985, ⁴ em que a técnica foi amplamente melhorado e definir a base do atual modelo ^{3. - 6.} A abordagem photothrombotic visa induzir um infarto cortical através da foto-ativação de um corante sensível à luz anteriormente entregue no sistema sanguíneo, which resulta em trombose de vasos local nas áreas expostas à luz. Quando o corante é iluminado circulando no comprimento de onda apropriado através de uma fonte de luz fria, liberta energia para as moléculas de oxigénio, o que, por sua vez, geram uma grande quantidade de produtos de oxigénio singlet altamente reactivos. Estes intermediários de oxigénio induzem a peroxidação da membrana de células endoteliais, que conduz à adesão e agregação plaquetária, e, eventualmente, para a formação de trombos, que determina a interrupção do fluxo local cerebral ^7.

Fototrombose é um modelo de isquemia não-canônico que não obstruir ou quebrar apenas uma artéria como normalmente acontece em acidente vascular cerebral humano, mas provoca lesões nos vasos mais superficiais, o que resulta em interrupção seletiva do fluxo de sangue nas áreas expostas à luz. Por esta razão, esta abordagem pode ser adequada para estudos celulares e moleculares da plasticidade cortical. A principal vantagem desta técnica reside na sua simplicidade de execução.Além disso, fototrombose pode ser facilmente realizado em cerca de 40 minutos por animal, incluindo a vinte minutos de espera (3 min para a anestesia, 1 min para raspar o couro cabeludo; 3 a 5 min a colocar o animal no aparelho estereotáxico, 2 min para esfregar a couro cabeludo com solução anti-séptica, fazer uma incisão e limpar o crânio; 2 a 4 min para colocar a fibra de luz fria, 1 min para injetar a solução de rosa de bengala, 5 min-espera para a difusão intraperitoneal, 15 min de iluminação, e 5 min para limpar a ferida e sutura do animal). Além disso, nenhum perícia cirúrgica é necessário para realizar esta técnica quanto à lesão é induzida através de simples iluminação do crânio intactos. Ao contrário de oclusão arterial clássica, este método determina oclusões seletivos de microvasos pial e intraparenquimatosa dentro da zona irradiada e reduz a variabilidade entre as lesões que nenhum navio garantia é deixada para fornecer oxigênio na área alvo.

Apesar de sua natureza particular, oações danos photothrombotic mecanismos essenciais que ocorrem em acidente vascular cerebral. Similarmente à oclusão da artéria, em acidente vascular cerebral humano, a agregação de plaquetas e formação de coágulos de determinar a interrupção do fluxo de sangue na área irradiada ^7. Do mesmo modo, este modelo também partes essenciais de respostas inflamatórias em oclusão da artéria cerebral média ^8. No entanto, por causa dos limites bem delimitada, a zona de penumbra, o que corresponde a uma área de metabolismo parcialmente preservada, é muito reduzida ou inexistente após uma lesão photothrombotic. Esta fronteira clara pode facilitar o estudo de respostas celulares dentro isquêmico ou intacto área cortical. Modelo do rato Indocianina é particularmente adequada para estudos de acidente vascular cerebral em uma variedade de animais transgénicos. Na verdade os modelos clássicos não pode caber para todas as cepas e estudos de longo período na linhagem C57BL / 6 rato relataram uma alta taxa de mortalidade que pode causar viés ^9.

Protocolo

1. Pré-cirurgia

1. Pesar Rose Bengal em um tubo de 1,5 ml e dissolvem-se em solução salina estéril até atingir uma concentração final de 15 mg / ml. Filtrar através de um filtro de esterilização de 0,2 um e armazenar no escuro à temperatura ambiente até dois meses.
2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave. A área cirúrgica deve ser higienizado menos de uma hora antes do início da cirurgia.
3. Anote o peso do corpo do mouse para ajustar a dose de Rosa Bengala para ser injetado. Nós injetado 10 ml / g de peso de animais em mulheres camundongos CD1 12 semanas de idade, no presente protocolo. A quantidade de Rosa de Bengala necessária para produzir o tamanho de lesões corticais desejada pode ser facilmente determinada de um conjunto separado de experiências preliminares, testando diferentes doses (tipicamente de 2 ul / g, 5 ul / g ou 10 ml / g de peso corporal). Note-se que a quantidade de Rosa de Bengala a ser injectado é altamente dependente das condições da experiência, em particular do tipo de fonte de luzutilizado e da duração da exposição à luz. No presente estudo, 10 ul / g (150 ug / g), a dose foi considerado necessário para induzir fototrombose após exposição à luz durante 15 minutos, ao passo que outros grupos relataram que, ou 50 ug / g de ^6,8 e 100 mg / g ^{10 de} injecção intraperitoneal era suficiente para induzir uma lesão photothrombotic.

2. Procedimento anestésico

1. Anestesiar ratos com isoflurano numa câmara de indução transparente (3,5-4% para indução, 1,5-2% para manutenção) em 50% (v / v) oxygen/50% (v / v) de mistura de gás de monóxido de diazoto. Anestesia gasosa permite uma rápida wake up dos animais eo nível de gás anestésico pode ser ajustado facilmente. Alternativamente, os ratinhos podem também ser anestesiados com uma mistura de cetamina-xilazina.
2. Quando é atingida anestesia profunda, remover o animal anestesiado e a partir da câmara de indução, coloque-o na moldura estereotáxica e manter a anestesia utilizando uma máscara facial. Ajuste o isoflurane dose para atingir um nível de anestesia adequada. Monitorar a taxa de respiração durante todo o procedimento e verifique se ele é constante (40 - 60 respirações por minuto).
3. Use pitadas toe, a fim de assegurar que o animal é anestesiado profundamente.
4. Aplicar pomada ocular, a fim de evitar que os olhos sequem.
5. Suavemente inserir a sonda rectal para monitorizar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos. Definir a almofada de aquecimento controlada por realimentação associado para manter a temperatura do corpo do rato, a 37 ± 0,5 ° C.

3. Cirurgia para iluminação da área de destino

1. Raspar o couro cabeludo do rato com um barbeador elétrico.
2. Fixe de forma segura a cabeça e coloque as barras de ouvido em meato externo. Tenha cuidado para não danificar os tímpanos.
3. Desinfectar a pele sobre a superfície com furtos de etanol a 70% e betadine usando cotonetes alternada.
4. É um bisturi para fazer uma incisão na linha média do olho level até o pescoço. Aplicar afastadores para manter a pele do crânio exposta.
5. Suavemente retrair o periósteo às bordas do crânio com um bisturi e deixar secar a superfície do crânio com cotonetes de algodão estéril. Identificar o bregma e lambda. Coloque uma micropipeta de vidro no bregma como ponto de referência, em seguida, movê-lo para as coordenadas da sua região de interesse. A região de interesse escolhido para este artigo é aproximadamente em forma redonda, centrada aproximadamente 2 mm lateral ao bregma, e que cobre uma área de cerca de 30 mm ^2, que inclui uma grande parte do córtex sensorimotor de acordo com o atlas do cérebro do rato e por Franklin Paxinos ^11.
6. Marque a posição de interesses com pontos de referência e colocar uma fibra óptica em estreito contacto com a superfície do crânio para evitar o espalhamento de luz, mas preste atenção para não exercer pressão sobre ele. A área de iluminação pode ser limitada pela aplicação sobre o crânio de uma máscara com uma pequena abertura ou uma tampa na extremidade da fibra óptica guide.

4. Rosa Bengala Injection e Ativação

1. Carregar a solução Rosa Bengala, numa seringa de 1 ml e calcular a quantidade a ser injectado de acordo com uma dose de 10 ml / g de peso corporal.
2. Proceder a uma injeção intraperitoneal lento.
3. Deixe o difuso corante e entrar na corrente sanguínea. Após 5 min, ligar o iluminador luz fria. Evitar a iluminação do animal por qualquer outra fonte de luz. Usamos iluminador de fibra óptica de 150 W intensidade.
4. Após 15 min de iluminação, parar a exposição à luz e suturar a ferida. Cinco minutos de iluminação já produzem infarto e 10 min é provável que suficiente para obter um efeito máximo ^12. A fim de minimizar a variabilidade, que escolhemos para iluminar por 15 min.

5. Sutura

1. Remova os afastadores de pele e aplicar solução salina estéril para evitar a desidratação.
2. Fechar a ferida usando needl corte reversoe de seda ou fio de sutura nylon.
3. Interromper a entrega de anestesia, retire cuidadosamente o mouse do aparelho estereotáxico e colocá-lo em uma almofada de aquecimento pré-aquecido até que esteja totalmente desperto, em seguida, devolvê-lo à sua jaula. A temperatura do corpo devem ser cuidadosamente monitorizados durante os procedimentos para limitar a variabilidade da extensão do infarto. De acordo com a concentração e a via de administração, Rosa Bengala pode ainda ser detectado na corrente sanguínea, durante várias horas após a injecção ^13. Prefere o cobertor de aquecimento para lâmpada de aquecimento para evitar possíveis danos secundários (Rosa Bengala absorção de comprimento de onda está no espectro verde).

Resultados

Este protocolo irá produzir uma lesão cortical que já é visível após dissecação do córtex para o olho nu (Figuras 1A-1C). A lesão photothrombotic desenvolve em superficiais e profundas camadas corticais em que o tecido é suficientemente transparente para permitir a foto-ativação da Rosa Bengala. Medição do grau de enfarte cerebral pode ser realizada rapidamente através de coloração histológica com cloreto de trifenil-tetrazólio (TTC) em tecido fresco ou de violeta cresil, após fixa?...

Discussão

As modificações e substituições

Por causa de seu pico de absorção em 562 nm, um laser de luz verde de uma lâmpada de arco de xenônio filtrada foi originalmente escolhido para irradiar o fotossensível Rosa Bengala. Apesar da excitação do laser ainda mediada recently5 foi utilizado, pode ser substituída pela lâmpada de luz fria também assegurar excitação corante ^10,15. Fibras ópticas de luz fria são mais fáceis de manipular e menos dispendiosa do que as fontes de las...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made