איסכמיה Photothrombotic: דגם נגע פולשנית לשעתק פוטו קליפתיים לעכבר מחקרי שבץ

Summary

Photothrombosis היא טכניקה מהירה, מינימאלי פולשנית לגרימת אוטם קטן ומופרד היטב בתחומי העניין באופן מאוד לשחזור. זה מתאים במיוחד ללימוד תגובות תאיות ומולקולריים שבבסיס פלסטיות מוח בעכברים מהונדסים.

Abstract

מודל שבץ photothrombotic מטרתו לגרום נזק איסכמי באזור בקליפת המוח שניתן על ידי אמצעי צילום ההפעלה של צבע רגיש לאור הזריק בעבר. בעקבות תאורה, הצבע מופעל ומייצר חמצן גופייה שרכיבי נזקים של קרומי תאי אנדותל, עם הצטברות טסיות דם ולאחר מכן היווצרות thrombi, שסופו של דבר קובע את ההפרעה של זרימת דם מקומית. גישה זו, בתחילה הוצעה על ידי רוזנבלום ואל Sabban בשנת 1977, מאוחר יותר השתפר ובוטסון בשנת 1985 במוח חולדה ולהגדיר את הבסיס של המודל הנוכחי. כמו כן, הזמינות המוגברת של קווי עכבר מהונדסים עוד תרמה להעלאת ריבית על מודל photothrombosis. בקצרה, צבע רגיש (רוז בנגל) מוזרק intraperitoneally ונכנס לזרם הדם. כאשר מוארים על ידי מקור אור קר, הצבע הופך להיות פעיל וגורם לניזק אנדותל עם הפעלה ופקק טסיות דם, וכתוצאה מכך מקומיתהפרעה לזרימת דם. מקור האור יכול להיות מיושם על הגולגולת השלמה ללא צורך בפתיחת הגולגולת, המאפשר מיקוד של כל אזור בקליפת המוח של עניין בדרך לשחזור ולא פולשנית. העכבר לאחר מכן נתפר ואפשרו להתעורר. ההערכה של נזק איסכמי יכולה להתבצע במהירות על ידי כלוריד triphenyl-tetrazolium או כתמים סגול cresyl. טכניקה זו מייצרת אוטם בגודל קטן וגבולות מופרדים היטב, וזה יתרון מאוד לאפיון מדויק של תאים או מחקרים תפקודיים. יתר על כן, הוא מתאים במיוחד ללימוד תגובות תאיות ומולקולריים שבבסיס פלסטיות מוח בעכברים מהונדסים.

Introduction

בתחילת המאה ה -21, שבץ איסכמי הוא הפרעה הרסנית, המייצגת את הגורם השני של נכות לטווח ארוכים ¹ והגורם השני לתמותה בעולם, שבו השבץ היווה כ 5,7 מיליון מקרי מוות בשנת 2004 ^2. למרות המאמצים הרבים שהשקיעו, אין עדיין טיפול יעיל זמין כדי לשפר את ההתאוששות תפקודית לאחר שבץ. מודלים של בעלי חיים של שבץ נמצאים בשימוש נרחב בתחום מחקר שבץ מאחר שהם מאפשרים מידול של הפתופיזיולוגיה של נזק איסכמי ולבדוק את היעילות של אסטרטגיות neuroprotective שונות in vivo. רוב המודלים האלה שואפים לגרום לאוטם נרחב על ידי הפרעה (זמני או קבוע) זרימת הדם בתוך עורק המוח האמצעי, ואילו דגמים אחרים פותחו ללמוד נגעים בגודל קטן באזורים ספציפיים, בדרך כלל רכב וקליפת המוח חושי. עם זאת, מספר גורמים עשויים לתרום ליצירת ACתואר ertain של השתנות במחקרים ניסיוניים שבץ, כוללים זן העכבר בשימוש, גיל והמין של בעלי חיים שנכללו במחקר, ומעל לכל, את הטכניקה אימצה כדי לגרום את נזק איסכמי. בהתייחס לנקודה האחרונה, משך הזמן והפולשנות של הניתוח (כלומר את הצורך בפתיחת גולגולת), כמו גם את המיומנות כירורגית נדרשת למפעיל כדי לגרום לנגע איסכמי מהימן הם גורמים קריטיים להצלחה ובלתי משוחד במחקר שבץ vivo .

הרעיון של photothrombosis בתחילה הוצע על ידי רוזנבלום ואל Sabban בשנת 1977 והפך ³ נודע על ידי היישום שלה במוח חולדה על ידי ווטסון ואח' בשנת 1985 ⁴ שבטכניקה השתפרה במידה רבה, ולהגדיר את הבסיס של המודל הנוכחי ^{3. - 6.} גישת photothrombotic מטרתו לגרום לאוטם קליפת המוח דרך צילום ההפעלה של צבע רגיש לאור נמסרה בעבר למערכת דם, WHIch התוצאה פקקת כלי מקומי באזורים החשופים לאור. כאשר הצבע במחזור מואר באורך הגל המתאים על ידי מקור אור קר, הוא משחרר אנרגיה למולקולות חמצן, אשר בתורו לייצר כמות גדולה של מוצרי חמצן גופייה תגובתי. ביניים חמצן אלו לגרום לחמצון ממברנת תא האנדותל, שהובילו להידבקות ואגרגציה של טסיות דם, וסופו של דבר להיווצרות של thrombi אשר קובעת הפרעה זרימת מוחין מקומית ^7.

Photothrombosis הוא מודל איסכמי שאינם קנוני שלא לחסום או לשבור את עורק אחד בלבד כפי שקורה בדרך כלל בשבץ מוחי אנושי, אבל גורם לנגעים בכלי שטחיים יותר, וכתוצאה מההפרעה סלקטיבית של זרימת דם באזורים החשופים לאור. מסיבה זו, גישה זו עשויה להיות מתאימה ללימודים תאיים ומולקולריים של פלסטיות בקליפת המוח. היתרון העיקרי של שיטה זו נמצא בפשטות הפעלה שלו.יתר על כן, ניתן לבצע בקלות בphotothrombosis כארבעים דקות לכל בעל חיים, כולל המתנה בת עשרים דקות (3 דקות להרדמה; 1 דקות לגלח את הקרקפת; 3 עד 5 דקות למקום את החיה על מנגנון stereotaxic; 2 דקות לקרצף קרקפת עם תמיסת חיטוי, עושה חתך ולנקות את הגולגולת; 2 עד 4 דקות למקום הקרים סיבי האור; 1 דקות להזריק את פתרון נגל הוורד; 5 דקות-ההמתנה לדיפוזיה intraperitoneal; 15 דקות של תאורה, ו5 דקות כדי לנקות את הפצע ותפר את בעלי החיים). יתר על כן, אין צורך במומחיות כירורגית לבצע טכניקה זו כנגע מושרה באמצעות תאורה פשוטה של ​​הגולגולת השלמה. בניגוד לחסימת עורקים קלסית, בשיטה זו קובעת occlusions סלקטיבית של microvessels pial וintraparenchymal בתוך האזור המוקרן ומקטינה את השונות בין נגעים ככלי אין ביטחונות שנותר כדי לספק חמצן באזור ממוקד.

למרות האופי המסוים שלה,מניות נזק photothrombotic מנגנונים חיוניים המתרחשים בשבץ מוחי. בדומה לחסימת עורק בשבץ מוחי אנושי, הצטברות טסיות דם והיווצרות קריש דם לקבוע הפרעה של זרימת דם באזור המוקרן ^7. כמו כן, מודל זה גם מניות תגובות דלקתיות חיוניות כמו בחסימת עורק מוח אמצעית ^8. עם זאת, בגלל גבולות delimitated היטב, אזור פנומברה, אשר מתאים לאזור של חילוף חומרים נשמרו באופן חלקי, הוא מאוד מופחת או חסר של אחרי נגע photothrombotic. גבול ברור זה יכול להקל על המחקר של תגובות הסלולר באזור קליפת המוח איסכמי או בשלמותה. מודל עכבר Photothrombosis מתאים במיוחד למחקרי שבץ במגוון רחב של בעלי חיים מהונדסים. ואכן מודלים הקלסיים לא יכולים להתאים לכל הזנים והמחקרים תקופה ארוכות בC57BL / 6 זן עכבר דיווח יחס תמותה גבוה שיכולים לגרום להטיה ^9.

Protocol

1. טרום ניתוח

1. שוקל רוז בנגל בצינור 1.5 מ"ל ולהתמוסס בתמיסת מלח סטרילית עד שמגיע לריכוז סופי של 15 מ"ג / מ"ל. סנן לעקר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסן אותו בחושך בטמפרטורה של עד חודשים חדר.
2. לעקר את כל מכשירי הניתוח ידי מעוקר. אזור הניתוח צריך להיות מחוטא פחות משעה לפני ביצוע הניתוח.
3. רשום את משקל גוף העכבר כדי להתאים את המינון של רוז בנגל להיות מוזרקת. הזרקנו 10 משקל חיה μl / g בCD1 נקבות עכברי 12 שבועות ישנים בפרוטוקול הנוכחי. הסכום של רוז בנגל דרוש כדי לייצר ניתן לקבוע את גודל נגע קליפת המוח הרצוי בקלות בקבוצה נפרדת של ניסויים ראשוניים על ידי בדיקת מינונים שונים (בדרך כלל 2 μl / g, 5 μl / g או 10 משקל גוף μl / ז). שימו לב שהסכום של רוז בנגל להיות מוזרקים תלוי מאוד בתנאי הניסוי, בעיקר הסוג של מקור אורבשימוש ומשך החשיפה לאור. במחקר הנוכחי, 10 (150 מיקרוגרם / גרם) מינון נמצא μl / g להיות נחוץ כדי לגרום photothrombosis בחשיפה לאור במשך 15 דקות, ואילו קבוצות אחרות דיווחו כי גם 50 מיקרוגרם / g ^6,8 ו -100 מיקרוגרם / g ¹⁰ זריקת intraperitoneal הייתה מספיקה לגרימת נגע photothrombotic.

2. נוהל הרדמה

1. הרדימי עכברים עם isoflurane בתא שקוף אינדוקציה (3.5-4% לזירוז, 1.5-2% לשמירה) בשיעור של 50% (V / V) תערובת גז חד תחמוצת dinitrogen oxygen/50% (V / V). הרדמה גזים מאפשרת בעקבות מהיר עד של בעלי החיים והן ברמה של גז הרדמה יכולה להיות מותאמת בקלות. לחלופין, עכברים יכולים גם להיות מורדמים על ידי תערובת קטמין-xylazine.
2. כשהוא הגיע הרדמה עמוקה, להסיר את החיה מורדמת מתא האינדוקציה, למקם אותו במסגרת stereotaxic ולשמור על הרדמה באמצעות מסיכת הפנים. התאם isofluraמינון ne כדי להשיג רמה נאותה הרדמה. לפקח על קצב הנשימה לאורך כל ההליך ולוודא שהוא קבוע (40 - 60 נשימות לדקה).
3. השתמש צובט הבוהן על מנת להבטיח את החיה מורדמת היא עמוק.
4. החל משחה העין, על מנת למנוע את העיניים מהתייבשות.
5. הכנס בעדינות את הבדיקה רקטלית כדי לנטר את הטמפרטורה לאורך כל ההליכים כירורגיים. הגדר את כרית חימום משוב מבוקרת הקשורים לשמירה על טמפרטורת גוף העכבר על 37 ± 0.5 ° C.

3. ניתוח להארת אזור היעד

1. לגלח את קרקפת העכבר עם מכונת גילוח חשמלי.
2. תקיפות לאבטח את הראש ולהכניס את סורגי האוזן לתוך meatus החיצוני. היזהר שלא עור התוף של נזק.
3. לחטא את העור על פני השטח עם לסירוגין swipes של אתנול 70% ובטאדין באמצעות צמר גפן.
4. השתמש באזמל כדי לעשות חתך לאורך קו האמצע מעין leVEL עד לצוואר. החל retractors עור כדי לשמור על הגולגולת חשופה.
5. בעדינות לחזור periostium את הקצוות של הגולגולת עם אזמל ולתת פני הגולגולת לייבש באמצעות צמר גפן סטרילי. זהה את גבחת ולמבדה. הנח micropipette זכוכית על גבחת כנקודת ייחוס, ולאחר מכן להעביר אותו לקואורדינטות של אזור עניין שלך. האזור של עניין נבחר למאמר זה הוא בערך בצורה נמרצות, שמרכז כ 2 מ"מ לרוחב גבחת, ומשתרע על שטח של כ -30 מ"מ ^2, הכולל את חלק גדול של קליפת המוח הסנסורית פי עכבר המוח על ידי האטלס ופרנקלין ¹¹ Paxinos.
6. סמן את המיקום של ריבית עם נקודות התייחסות והכניס סיבים אופטיים בקשר הדוק עם משטח הגולגולת כדי למנוע פיזור אור, אך לשים לב לא להפעיל לחץ עליו. האזור המואר יכול להיות מוגבל על ידי יישום על גולגולת מסכה עם צמצם קטן או כובע בקצה הסיב האופטי GUIדה.

4. הזרקת רוז בנגל והפעלה

1. טען את פתרון נגל רוז במזרק 1 מ"ל ולחשב את הסכום כדי להיות מוזרק בהתאם למינון של 10 μl / גרם של משקל גוף.
2. המשך זריקת intraperitoneal איטית.
3. בוא המפוזר הצבע ולהזין את זרם הדם. לאחר 5 דקות, לעבור על נורת האור הקרה. הימנע מתאורה של בעלי החיים על ידי כל מקור אחר של אור. אנחנו השתמשנו הפנס סיבים אופטי של עצמת W 150.
4. לאחר 15 דקות של תאורה, להפסיק חשיפה לאור ותפר את הפצע. חמש דקות של תאורה כבר מייצרות אוטם ו10 דקות היא סביר מספיק כדי להשיג אפקט מקסימאלי ^12. על מנת למזער את השונות, אנו בוחרים להאיר במשך 15 דקות.

5. תפר

1. הסר את retractors העור ולהחיל את תמיסת מלח סטרילית כדי למנוע התייבשות.
2. לסגור את הפצע באמצעות needl חיתוך הפוךדואר ומשי או חוט תפר ניילון.
3. לקטוע את אספקת הרדמה, להסיר בזהירות את העכבר ממנגנון stereotaxic ולשים אותו על כרית חימום מראש חימם עד שהוא ער לחלוטין, ולאחר מכן להחזיר אותו לכלוב שלה. טמפרטורת גוף צריך להיות במעקב צמוד לאורך כל ההליכים כדי להגביל את ההשתנות בהארכת האוטם. על פי הריכוז והתוואי של ממשל, רוז עדיין ניתן להבחין בנגל בזרם הדם במשך כמה שעות לאחר הזרקת ^13. מעדיף את שמיכת החימום למנורת ההתחממות, כדי למנוע נזקים משניים פוטנציאליים (רוז בנגל קליטת אורך הגל הוא בספקטרום הירוק).

תוצאות

פרוטוקול זה יהיה לייצר נגע קליפת המוח שכבר נראה לעין על נתיחה של קליפת המוח לעין בלתי מזוינת (איורים 1 א ', 1 ג'). נגע photothrombotic מתפתח בשכבות בקליפת המוח שטחיות ועמוקות שבו הרקמה שקופה במידה מספקת כדי לאפשר צילום הפעלה של רוז בנגל. מדידה של היקף אוטם מוחי יכול?...

Discussion

שינויים והחלפות

בגלל שיא הספיגה שלה ב 562 ננומטר, לייזר אור ירוק ממנורת קשת קסנון מסוננת נבחר במקור כדי להקרין רוז בנגל רגיש לאור. למרות עירור לייזר בתיווך עדיין היה בשימוש recently5, ניתן להחליף אותו על ידי מנורת אור הקרה שגם להבטיח עירו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made