Ischémie Photothrombotic: A photochimique modèle de lésion corticale minimalement invasive et reproductible pour les études de course de souris

Résumé

Photothrombosis est une technique rapide, peu invasive pour induire petite et bien délimitée du myocarde dans les domaines d'intérêt de façon très reproductible. Il est particulièrement adapté pour étudier les réponses cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la plasticité du cerveau chez les souris transgéniques.

Résumé

Le modèle de course photothrombotic a pour but d'induire une altération ischémique dans une zone corticale donnée au moyen de photo-activation d'un colorant sensible à la lumière précédemment injecté. Après illumination, le colorant est activé et produit de l'oxygène singulet qui endommage les composants de membranes de cellules endothéliales, de l'agrégation des plaquettes et la formation subséquente de thrombus, qui détermine la suite de l'interruption de la circulation sanguine locale. Cette approche, initialement proposé par Rosenblum et El-Sabban, en 1977, a ensuite été améliorée par Watson en 1985 dans le cerveau de rat et a jeté les bases du modèle actuel. En outre, la disponibilité accrue des lignées de souris transgéniques a également contribué à susciter l'intérêt sur le modèle de photothrombosis. En bref, un colorant photosensible (rose Bengale) est injecté par voie intrapéritonéale et pénètre dans la circulation sanguine. Lorsqu'ils sont éclairés par une source de lumière froide, le colorant devient activé et induit des lésions endothéliales avec l'activation des plaquettes et de la thrombose, entraînant localel'interruption de la circulation sanguine. La source de lumière peut être appliquée sur le crâne intact sans avoir besoin d'une craniotomie, ce qui permet un ciblage d'une zone corticale d'intérêt de façon reproductible et non invasive. La souris est ensuite suturée et autorisé à se réveiller. L'évaluation des lésions ischémiques peut être rapidement accompli par le chlorure de triphényl-tétrazolium ou coloration au violet de crésyl. Cette technique produit un infarctus de frontières bien délimitées petite taille et, ce qui est très avantageux pour la caractérisation des cellules précises ou des études fonctionnelles. En outre, il est particulièrement adapté pour étudier les réponses cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la plasticité du cerveau chez les souris transgéniques.

Introduction

Au début du 21ème siècle, accident vasculaire cérébral ischémique est une maladie dévastatrice qui représente la deuxième cause d'invalidité à long terme ¹ et la deuxième cause de mortalité dans le monde de la course, dans lequel représentait environ 5,7 millions de décès en 2004 ^2. En dépit des nombreux efforts qui ont été mis en, il n'y a toujours pas de traitement efficace pour améliorer la récupération fonctionnelle après un AVC. Les modèles animaux d'AVC sont largement utilisés dans le domaine de la recherche sur l'AVC, car ils permettent la modélisation de la physiopathologie des lésions ischémiques et de tester l'efficacité de différentes stratégies neuroprotectrices in vivo. La plupart de ces modèles visent à induire vastes infarctus en interrompant (temporairement ou définitivement) le flux sanguin dans l'artère cérébrale moyenne, tandis que d'autres modèles ont été développés pour étudier les lésions de petite taille dans des domaines spécifiques, généralement le moteur et cortex somatosensoriel. Cependant, plusieurs facteurs peuvent contribuer à générer acertains degré de variabilité dans les études expérimentales AVC, y compris la souche de souris utilisée, l'âge et le sexe des animaux inclus dans l'étude et, surtout, la technique adoptée pour induire la lésion ischémique. En ce qui concerne ce dernier point, la durée et le caractère invasif de la chirurgie (par exemple la nécessité d'une craniotomie) ainsi que l'habileté chirurgicale nécessaire à l'opérateur pour induire de manière fiable une lésion ischémique sont des facteurs déterminants pour la réussite et impartiale dans l'étude course vivo .

Le concept de photothrombosis a été initialement proposé par Rosenblum et El-Sabban en 1977 ³ et est devenu célèbre par son application dans le cerveau de rat par Watson et al en 1985 ⁴ dans lequel la technique a été largement améliorée et a jeté les bases du modèle actuel ^{3. - 6.} L'approche photothrombotic vise à induire un infarctus cortical par la photo-activation d'un colorant sensible à la lumière précédemment livrés dans le système sanguin, which se traduit par une thrombose des vaisseaux locale dans les zones exposées à la lumière. Lorsque le colorant circulant est éclairée à la longueur d'onde appropriée par une source de lumière froide, il libère de l'énergie aux molécules d'oxygène, qui à leur tour génèrent une quantité importante de produits hautement réactives de l'oxygène singulet. Ces intermédiaires oxygénés provoquent la peroxydation endothélial de la membrane cellulaire, conduisant à l'adhésion des plaquettes et de l'agrégation, et, éventuellement, à la formation de thrombus, qui déterminent l'interruption de la circulation cérébrale locale ^7.

Photothrombosis est un modèle ischémique non canonique qui n'a pas occlure ou casser un seul artère, comme il arrive habituellement à course humaine, mais induit des lésions dans des récipients plus superficielles, ce qui entraîne l'interruption sélective de l'écoulement sanguin dans les zones exposées à la lumière. Pour cette raison, cette approche peut convenir aux études cellulaires et moléculaires de la plasticité corticale. Le principal avantage de cette technique réside dans sa simplicité d'exécution.En outre, photothrombosis peut être facilement réalisée en environ 40 minutes par animal, y compris attente de vingt minutes (3 min d'anesthésie; 1 min à raser le cuir chevelu; 3 à 5 min de placer l'animal dans l'appareil stéréotaxique; 2 min à frotter le cuir chevelu avec une solution antiseptique, faire une incision et nettoyer le crâne; 2 à 4 min à placer la fibre de lumière froide; 1 min à injecter la solution de rose Bengale; 5 min-attente pour la diffusion par voie intrapéritonéale, 15 mn de l'illumination, et à 5 min à nettoyer la plaie et suturer l'animal). En outre, aucune expertise chirurgicale est nécessaire pour effectuer cette technique que la lésion est induite par une simple illumination du crâne intact. Contrairement à l'occlusion artérielle classique, cette méthode détermine occlusions sélectifs de microvaisseaux pie-mère et intraparenchymal au sein de la zone irradiée et réduit la variabilité des lésions comme aucun vaisseau collatéral est laissée à fournir de l'oxygène dans la zone ciblée.

En dépit de son caractère particulier, leactions de dégâts photothrombotic mécanismes essentiels survenant dans accident vasculaire cérébral. De même que pour l'occlusion de l'artère en course humaine, l'agrégation plaquettaire et de la formation de caillot déterminent l'interruption de la circulation sanguine dans la zone irradiée ^7. De même, ce modèle partage également les réponses inflammatoires essentiels au milieu occlusion de l'artère cérébrale ^8. Toutefois, en raison des limites bien délimité, la zone de pénombre, ce qui correspond à une zone du métabolisme partiellement conservée, est très réduite, voire inexistante après une lésion photothrombotic. Cette frontière claire peut faciliter l'étude des réponses cellulaires à l'intérieur de l'aire corticale ischémique ou intact. modèle de souris Photothrombosis est particulièrement adapté pour les études AVC dans une variété d'animaux transgéniques. En effet, les modèles classiques ne peuvent pas s'adapter à toutes les souches et les études de longue période dans C57BL / 6 souche de souris signalé un taux élevé de mortalité qui peut entraîner un biais ^9.

Protocole

1. Pré-chirurgie

1. Peser rose Bengale dans un tube de 1,5 ml et dissoudre dans une solution saline stérile jusqu'à atteindre une concentration finale de 15 mg / ml. Stériliser par filtration à travers un filtre de 0,2 um et le stocker dans l'obscurité, à température ambiante jusqu'à deux mois.
2. Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage. La zone chirurgicale doit être désinfecté au moins une heure avant de lancer l'opération.
3. Noter le poids du corps de la souris pour ajuster la dose de rose Bengale à injecter. Nous avons injecté 10 ul / g poids de l'animal en souris femelles CD1 12 semaines dans le présent protocole. Le montant de Rose Bengale nécessaire pour produire la taille de la lésion corticale désirée peut être facilement déterminée dans un ensemble distinct d'expériences préliminaires en testant différentes doses (généralement 2 pl / g, 5 ul / g ou 10 ul / g de poids corporel). Notez que le montant de Rose Bengale à injecter est très dépendante des conditions expérimentales, en particulier le type de source de lumièreutilisé et de la durée de l'exposition lumineuse. Dans la présente étude, 10 pl / g (150 pg / g), la dose a été jugée nécessaire pour induire photothrombosis lors de l'exposition à la lumière pendant 15 min, tandis que d'autres groupes ont signalé que ce soit 50 pg / g ^6,8 et 100 pg / g ¹⁰ injection intrapéritonéale était suffisante pour induire une lésion photothrombotic.

2. Procédure d'anesthésie

1. Anesthésier des souris avec de l'isoflurane dans une chambre d'admission transparent (3,5 à 4% pour l'induction, de 1,5 à 2% pour les maintenir) dans 50% (v / v) de mélange de gaz de monoxyde de diazote oxygen/50% (v / v). Anesthésie gazeuse permet un réveil rapide jusqu'à des animaux et le niveau de gaz anesthésique peut être réglé facilement. Alternativement, les souris peuvent également être anesthésiés par un mélange kétamine-xylazine.
2. Lorsque l'anesthésie profonde est atteinte, retirer l'animal anesthésié de la chambre d'induction, le placer dans le cadre stéréotaxique et maintenir une anesthésie à l'aide d'un masque facial. Réglez le isofluraNE dose d'atteindre un niveau d'anesthésie adéquate. Surveiller le taux de respiration tout au long de la procédure et assurez-vous qu'elle est constante (40 - 60 respirations par minute).
3. Utilisez pincées d'orteil afin de s'assurer que l'animal est profondément anesthésié.
4. Appliquer une pommade oculaire, afin d'éviter que les yeux de sécher.
5. Insérez délicatement la sonde rectale pour surveiller la température tout au long des procédures chirurgicales. Régler le coussin chauffant asservi associé pour maintenir la température du corps de la souris à 37 ± 0,5 ° C.

3. Chirurgie de l'éclairage de la zone cible

1. Rasage du cuir chevelu de la souris avec un rasoir électrique.
2. Fixez solidement la tête et insérer les barres d'oreilles en conduit auditif externe. Veillez à ne pas endommager les tympans.
3. Désinfectez la peau à la surface de glisse de 70% d'éthanol et bétadine à l'aide de cotons-tiges alternatif.
4. Utiliser un scalpel pour faire une incision le long de la ligne médiane à partir de l'œil leVel vers le cou. Appliquer rétracteurs de peau pour garder le crâne exposé.
5. Rétracter doucement le périoste sur les bords du crâne avec un scalpel et laissez la surface du crâne sec à l'aide de cotons-tiges stériles. Identifier le bregma et lambda. Placez une micro-pipette en verre sur le bregma comme point de référence, puis déplacez-le vers les coordonnées de votre région d'intérêt. La région d'intérêt choisi pour cet article est à peu près vertement forme, centrée à environ 2 mm latéral au bregma, et couvrant une superficie d'environ 30 mm ^2, qui comprend une grande partie du cortex sensori-moteur selon l'Atlas du cerveau de souris par Franklin et Paxinos ^11.
6. Marquer la position de l'intérêt des points de référence et de mettre une fibre optique en contact étroit avec la surface du crâne pour éviter dispersion de la lumière, mais attention à ne pas exercer de pression sur elle. La zone lumineuse peut être limitée par l'application sur le crâne d'un masque avec une petite ouverture ou d'un bouchon à l'extrémité de la fibre optique guide.

4. Rose Bengale Injection et activation

1. Chargez la solution Bengale Rose dans une seringue de 1 ml et de calculer le montant à injecter selon une dose de 10 ul / g de poids corporel.
2. Procéder à une injection intrapéritonéale lente.
3. Laissez le colorant diffuse et entrer dans le flux sanguin. Après 5 min, allumer l'éclairage de lumière froide. Eviter tout éclairage de l'animal par toute autre source de lumière. Nous avions l'habitude d'éclairage de 150 W intensité fibre optique.
4. Après 15 min d'éclairage, arrêtez exposition à la lumière et suturer la plaie. Cinq minutes d'éclairage produisent déjà du myocarde et 10 min est susceptible suffisante pour obtenir un effet maximal ^12. Afin de minimiser la variabilité, nous choisissons d'éclairer pendant 15 min.

5. Suturer

1. Retirez les rétracteurs de la peau et appliquer une solution saline stérile pour éviter la déshydratation.
2. Refermer la plaie à l'aide needl coupe inversee et de soie ou de fils de suture en nylon.
3. Interruption d'anesthésie, retirez soigneusement la souris de l'appareil de stéréotaxie et la posa sur un coussin chauffant préchauffé jusqu'à ce qu'il soit complètement réveillé, puis retourner dans sa cage. La température corporelle doit être surveillée attentivement tout au long des procédures pour limiter la variabilité dans l'extension infarctus. Selon la concentration et de la voie d'administration, le Rose Bengale peut encore être détecté dans le sang pendant plusieurs heures après l'injection ^13. Préfère la couverture chauffante de la lampe de chauffage pour éviter des dommages secondaires potentiels (Rose Bengale absorption longueur d'onde est dans le spectre vert).

Résultats

Ce protocole va produire une lésion corticale qui est déjà visible sur la dissection du cortex à l'oeil nu (Figures 1A-1C). La lésion photothrombotic se développe dans les couches corticales superficielles et profondes dans lequel le tissu est suffisamment translucide pour permettre photo-activation de la Rose Bengale. La mesure de l'étendue de l'infarctus cérébral peut être effectuée rapidement par une coloration histologique avec le chlorure de triphényl-tétrazolium (TTC) sur ...

Discussion

Modifications et substitutions

En raison de son pic d'absorption à 562 nm, un laser de lumière verte à partir d'une lampe à arc au xénon filtré a été initialement choisi pour irradier le photosensible rose Bengale. Bien excitation laser à médiation était encore utilisé recently5, il peut être remplacé par une lampe à lumière froide qui également assurer excitation colorant ^10,15. Fibres optiques lumière froide sont plus faciles à manipuler et moins coûteux...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made