Photothrombotic虚：マウス脳卒中研究のための低侵襲かつ再現性の光化学皮質病変モデル

要約

Photothrombosisは、再現性の高い方法で、興味のある分野での小よく区切り梗塞を誘発するための迅速、低侵襲技術です。これは、トランスジェニックマウスの脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。

要約

photothromboticストロークモデルは、以前に注入された光感受性色素の光活性化によって与えられた皮質領域内虚血性損傷を誘発することを目指しています。照明続いて、色素が活性化され、その後の血小板凝集し、最終的に局所血流の中断を決定する血栓の形成、を、内皮細胞膜の損傷成分という一重項酸素を生成する。当初は1977年にローゼンブラムとエルSabbanによって提案されたこの手法は、後のラット脳内で1985年にワトソンによって改良と現行モデルの基礎を設定されていた。また、トランスジェニックマウス系統の可用性の向上、さらにphotothrombosisモデルの関心を高めるために貢献した。簡潔には、感光性染料（ローズベンガル）が腹腔内注射し、血流に入る。冷光源によって照射されたときに、色素が活性化になると、ローカルの結果、血小板の活性化および血栓症、内皮損傷を誘発する血流の中断。光源は、再現可能かつ非侵襲的な方法で、任意の目的の皮質領域のターゲティングを可能開頭の必要がなく無傷の頭蓋骨に適用することができる。マウスはその後縫合と目を覚ますために許可されています。虚血性損傷の評価が迅速トリフェニルテトラゾリウムクロリド又はクレシルバイオレット染色によって達成することができる。この技術は、正確なセルの特性又は機能的研究のために非常に有利で小型化と十分に区切られた境界の梗塞を生成する。また、トランスジェニックマウスにおける脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。

概要

21世紀の初めには、虚血性脳卒中は、長期障害¹とストロークは、2004年²で約5,7万人が死亡を占めている死亡、世界中の第二の原因の第二の原因を表して壊滅的な疾患である。に入れ、多くの努力にもかかわらず、脳卒中後の機能回復を改善するために利用できる有効な治療法はまだありません。それらは虚血性障害の病態のモデル化を可能にし、in vivoで異なる神経保護戦略の有効性を試験するようにストロークの動物モデルが広くストローク研究の分野で使用されている。これらのモデルのほとんどは、他のモデルは、通常、特定の領域、モータと体性感覚野に小型の病変を研究するために開発されたのに対し、（一時的または恒久的に）中大脳動脈内の血流を遮断することによって広範な梗塞を誘発することを目指します。しかし、いくつかの要因は、ACを生成するために寄与することができる使用マウス系統を含む実験的な脳卒中の研究、の変動のertain度、すべての上に、研究に含まれており、動物の年齢や性別、技術は、虚血性損傷を誘発するために採用。後者の点に関しては、期間と侵襲手術（ つまり開頭術の必要性）だけでなく、確実に虚血性病変を誘発するために、オペレータに必要な外科的なスキルは、in vivo脳卒中研究で成功し、公平のための重要な決定要因である。

photothrombosisの概念は当初、1977年³ローゼンブラムとエルSabbanによって提案され、ワトソンらがラットの脳におけるそのアプリケーションによって有名になった1985年⁴技術が大幅に向上し、現在のモデル³の基礎を設定された^{- 6。} photothromboticアプローチは以前に血液系、WHに供給される光感受性色素の光活性化を介して皮質梗塞を誘発することを目的と光にさらされる地域では地元の血管血栓症におけるICH結果。循環色素が冷光源によって適切な波長で照射されるとき、それは順番に反応性の高い一重項酸素生成物を多量に生成した酸素分子にエネルギーを放出する。これらの酸素中間体は、血小板付着および凝集に、最終的に局所脳流れの中断^7を決定血栓の形成をもたらす、内皮細胞膜の過酸化を誘導する。

Photothrombosisは、それが普通の人間のストロークで発生しますが、光にさらされる分野での血流の選択的な中断、その結果より多くの表面的な血管に病変を誘発するような唯一の動脈を閉塞または破壊しない非正規虚血モデルである。この理由のため、このアプローチは、皮質可塑性の細胞および分子生物学的研究のために適切であり得る。この技術の主な利点は、実行のそのシンプルさに存在します。スクラブ2分;頭皮を剃るための1分;;定位固定装置に動物を配置し、3〜5分また、photothrombosisは簡単に20分待ち（麻酔のために3分を含む動物あたり約40分で行うことができ消毒液で頭皮、切開をし、頭蓋骨をきれいに、冷光ファイバを配置し、2〜4分;腹腔内拡散のために5分待ち、、ローズベンガル液を注入する1分、照明の15分、そして5分〜傷をきれいに）動物を縫合。さらに、全く手術専門知識は病変がそのまま頭蓋骨のシンプルな照明を通じて誘導されるように、この手法を実行するために必要ありません。古典的な動脈閉塞とは異なり、この方法では、照射されたゾーン内に軟膜と実質内微小血管閉塞の選択を決定しない側副血管の目標領域内に酸素を供給するために残っていないような病変間のばらつきを低減する。

その特定の性質にもかかわらず、photothrombotic被害株は不可欠なメカニズムは、脳行程で発生する。同様に、ヒト行程における動脈閉塞し、血小板凝集及び血栓の形成が照射領域⁷の血流の中断を決定する。同様に、このモデルはまた、中大脳動脈閉塞⁸のように本質的な炎症反応を共有しています。しかし、よくdelimitated境界、部分的に保存され代謝の領域に対応する半影ゾーンでは、photothrombotic病変の後に非常に低下したり、存在しないです。これは明確な境界線は、虚血性または無傷皮質領域内の細胞応答の研究を容易にすることができる。 Photothrombosisマウスモデルは、トランスジェニック動物の様々な研究のストロークに特に適している。確かにバイアス^9を引き起こす可能性が高い死亡率を報告した古典的なモデルはC57BL / 6マウス系統内の全株と長期研究に合わせることはできません。

プロトコル

1。手術前

1. 1.5mlチューブにローズベンガルを秤量し、15 mg / mlの最終濃度に達するまで無菌食塩水に溶解する。 0.2μmのフィルターを通して滅菌をフィルタリングして、最大2ヶ月、室温で暗所に保管してください。
2. オートクレーブですべての手術器具を殺菌する。手術領域は、手術を開始する前に、1時間未満で消毒されるべきである。
3. 注入されるローズベンガルの投与量を調節するために、マウスの体重を記録します。我々は現在のプロトコルで12週齢の雌CD1マウスに10μlの/ gの動物体重を注入した。ローズベンガルの量は、所望の皮質病変の大きさを容易異なる投与量（典型的に2μlの/ gであり、5μlの/ g以上は10g /μlの体重）試験することによって予備実験の別個のセットを決定することができる生成するために必要とされる。注入されるローズベンガルの量は、特に実験条件、光源の種類に大きく依存することに留意使用され、露光の期間。本研究では、10グラム/液（150μgの/ g）の用量は、その他のグループは、報告されたのに対し、15分間露光によりphotothrombosisを誘導するのに必要であることが分かった50μgの/ gの^6,8および100μg/ml/ gのどちら¹⁰腹腔内注射はphotothrombotic病変を誘導するために十分であった。

2。麻酔の手順

1. 50％の透明な誘導室（誘導3.5から4パーセント、維持するための1.5から2パーセント）（v / v）のoxygen/50％（v / v）の一酸化二窒素ガス混合物中のイソフルランでマウスを麻酔。気体の麻酔動物の迅速なウェイクアップを可能にし、麻酔ガスのレベルを容易に調整することができる。また、マウスはまたケタミンキシラジン混合により麻酔することができます。
2. 深い麻酔に到達すると、誘導室から麻酔した動物を除去定位フレームに配置し、フェースマスクを用いて麻酔を維持する。 isofluraを調整十分な麻酔レベルを達成するためにね線量。手続き全体の呼吸速度を監視し、それが一定である（40 - 毎分60回の呼吸）を確認してください。
3. 動物が深く麻酔であることを確認するために、つま先のピンチを使用してください。
4. 乾燥から目を防ぐために、眼軟膏を適用する。
5. 優しく外科手術全体の温度を監視するために直腸プローブを挿入します。 37℃でのマウスの体温を維持するための関連するフィードバック制御加熱パッド±0.5℃に設定する

3。対象領域の照明のための手術

1. 電気かみそりでマウスの頭皮を剃る。
2. しっかりと頭を保護し、外部の道に耳棒を挿入します。損傷鼓膜ないように注意してください。
3. 綿棒を使用して、70％エタノールおよびベタジンのスワイプを交互に表面に皮膚を消毒する。
4. 目ルから正中線に沿って切開をするメスを使用首までVEL。頭蓋骨を露出保つために皮膚のリトラクタを適用します。
5. 優しくメスで頭蓋骨の端に骨膜を撤回し、頭蓋骨の表面は滅菌綿棒を使用して乾燥させます。ブレグマとラムダを識別します。基準点としてブレグマたガラスマイクロピペットを置き、その後、興味のある領域の座標に移動します。この記事のために選択された関心領域は、ほぼ丸く形ですブレグマへ横約2mmを中心に、そしてフランクリンによるマウス脳アトラスによると感覚運動皮質の大部分を含む約30mm ²の領域をカバーし、 Paxinos ^11。
6. 基準点と利益の位置をマークし、光の散乱を防ぐため、それに圧力を発揮しないように注意を払うために頭蓋骨の表面に密着して光ファイバを置く。照射領域は光ファイバーGUIの先端に小さなアパーチャまたはキャップを頭蓋骨にマスクを適用することによって制限することができますデ。

4。ローズベンガルインジェクションとアクティベーション

1. 1ミリリットルの注射器にローズベンガルソリューションをロードし、体重を10μl/ gでの投与量に応じて注入される量を計算。
2. 遅い腹腔内注射に進みます。
3. 染料拡散しましょう​​と、血流を入力してください。 5分後、冷光照明に切り替える。光の他のソースによって動物の照明を避けてください。私たちは、150 Wの強さの光ファイバ照明器を使用していました。
4. 照射の15分後、露光を停止し、創傷を縫合。照明分は既に心筋梗塞を生成し、10分で最大効果^12を得るのに十分である可能性が高い。ばらつきを最小限にするために、我々は15分間照射することを選択する。

5。縫合

1. 皮膚トラクターを取り外し、脱水症状を避けるために、滅菌生理食塩水を適用します。
2. 逆切断needlを使って傷を閉じるまでeとシルクやナイロン縫合糸。
3. 麻酔の配信を中断し、慎重に定位固定装置からマウスを削除して、それが完全に目を覚ましになるまで予め温め加熱パッドの上に置くと、そのケージに戻します。体温は、梗塞拡張の変動を制限するための手順全体を注意深く監視する必要があります。濃度および投与経路に従って、ベンガルはまだ¹³注射後数時間の血流を検出することができるローズ。潜在的な二次的な損害（ローズベンガル吸収波長は緑色スペクトルにある）を回避するために、温暖化ランプに加熱毛布を好む。

結果

このプロトコルは、すでに肉眼（ 図1A-1C）の皮質の解剖時に表示されている皮質病変を生成します。 photothrombotic病変組織がローズベンガルの光活性化を可能にするために十分に透明である浅と深い皮質層に発症。脳梗塞の程度の測定を4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した後、新鮮な組織、あるいは、クレシルバイオレットによるトリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC...

ディスカッション

修正や代用

なぜなら562 nmでの吸収ピークから、濾過キセノンアークランプからの緑色光レーザーは、もともと感光ローズベンガルを照射するように選ばれた。レーザー媒介励起がまだrecently5を用いたが、それはまた、色素の励起^10,15を確実に冷光ランプに置き換えることができます。冷光光ファイバは、レーザー光源より操作しやすく、安価である。しかし、レー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made