تقييم الاختلافات في القدرة التنافسية في الحيوانات المنوية<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Summary

الفرق الحيوانات المنوية القدرة التنافسية بين ذبابة الفاكهة الذكور مع الأنماط الوراثية متميزة التأكد من خلال تجارب نقرا مزدوجا التزاوج. كل من هذه التجارب تنطوي على واحد من الذكور من الفائدة وذكر المرجع. علامات التعرف عليها بسهولة في ذرية تسمح الاستدلال من جزء صغير من الأفراد يولدون من كل ذكر.

Abstract

المنافسة بين الذكور مناوع لتخصيب البويضات هي واحدة من آليات الانتقاء الجنسي، أي التحديد التي تعمل على تعظيم عدد من الأحداث التزاوج الناجح بدلا من البقاء على قيد الحياة على تعظيم وقدرتها على البقاء ^1. المنافسة الحيوانات المنوية يمثل التنافس بين الذكور بعد التزاوج مع نفس الأنثى ^2، التي هي من قبيل الصدفة السائل المنوي لديهم في الزمان والمكان. تم الإبلاغ عن هذه الظاهرة في أنواع متعددة من النباتات والحيوانات ^3. على سبيل المثال، المصادة D. تحتوي على الإناث البطن عادة الحيوانات المنوية 2-3 الذكور ^4. يتم تخزين الحيوانات المنوية في الهيئات المتخصصة مع قدرة تخزين محدودة، والتي قد تؤدي إلى منافسة مباشرة من الحيوانات المنوية من الذكور ^2،5 مختلفة.

مقارنة القدرة التنافسية الحيوانات المنوية من الذكور مختلفة من الاهتمام (أنواع الذكور التجريبية) قد أنجز من خلال رقابة التجربه انقر نقرا مزدوجا التزاوجTS في المختبر ^6،7. لفترة وجيزة، تتعرض امرأة واحدة لاثنين من الذكور مختلفة على التوالي، ذكر تجريبية واحدة واحدة عبر التزاوج إشارة الذكور. ثم يتبع نظام التزاوج نفسه باستخدام أنواع أخرى ذكر التجريبية مما يسهل المقارنة غير المباشرة من القدرة التنافسية للالسائل المنوي لديهم من خلال مرجعية مشتركة. يتم التعرف على جزء صغير من الأفراد يولدون من التجريبية والمرجعية الذكور باستخدام علامات، الذي يسمح احد لتقدير القدرة التنافسية الحيوانات المنوية باستخدام تعبيرات حسابية بسيطة ^7،8. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تقدير القدرة التنافسية الحيوانات المنوية في اثنين من سيناريوهات مختلفة اعتمادا على ما إذا كان الذكور التجريبية هو الثاني أو الأول لزميله (جريمة وفحص الدفاع، على التوالي) ^9، والذي يفترض أن يكون معبرا من سمات اختصاص مختلفة.

هنا، نحن تصف النهج الذي يساعد على استجواب دور العوامل الجينية المختلفة التي تكمن وراء مزعومة رانه ظاهرة القدرة التنافسية الحيوانات المنوية في D. البطن.

Introduction

منذ احظت جيف باركر انتشار المنافسة الحيوانات المنوية في الحشرات وآثارها التطوري ^2، وقد حاول موجة من الدراسات في ذبابة الفاكهة وغيرها من الأنواع لتسليط بعض الضوء على هذه الظاهرة في العديد من المستويات المختلفة. وكانت بعض الأمثلة من المجالات ذات الاهتمام المسح من التباين في العشائر الطبيعية ^9،10، هندسته المعمارية الجينية وأهمية العوامل الوراثية الكامنة وراء ^11-14، ودورها في دفع عجلة التطور المشترك بين الجنسين ^15،16. في D. البطن الإناث، والقدرة المحدودة للأجهزة تخزين الحيوانات المنوية المتخصصة، وزوج من spermatheca وعاء المنوي ^6،17، ويساهم في المنافسة من الحيوانات المنوية من الذكور مختلفة. يتم نقل ما يقرب من 1،500 الحيوانات المنوية أثناء التزاوج إلى أنثى ولكن فقط ~ 500 يمكن استيعابها في الأجهزة المذكورة ^18،19. في المختبر، التي تسيطر عليها نقرا مزدوجا التزاوج التجاربالإدلاء بالبيانات التي تنطوي على ذكر مرجع واحد أو أكثر من الذكور من الفائدة التي استخدمت على نطاق واسع لتقييم القدرة التنافسية الحيوانات المنوية ^7،8.

ويقدر قدرة تنافسية الحيوانات المنوية ونسبة ذرية انجب من الذكور التجريبية في التجارب نقرا مزدوجا التزاوج على ذرية المجموع، أي أن كلا من الذكور التجريبية والمرجعية. يتألف القدرة التنافسية الحيوانات المنوية عنصرين، كل واحد منهم تقييمها في فحص منفصلة. في مقايسة جريمة، وقدرة الحيوانات المنوية من الذكور التجريبية لتهجير الحيوانات المنوية من الرجال أولا، أي ذكر مرجع، يتم تقييمها. وعلى العكس، في مقايسة الدفاع، وقدرة الحيوانات المنوية من الذكور التجريبية لمقاومة النزوح أو للحد من نجاح الإخصاب من الحيوانات المنوية من الذكور المرجعية وتقييمها. اعتمادا على نوع من الفحص، والدفاع أو جريمة، ويقدر قدرة الحيوانات المنوية التنافسية من خلال عشرات P ₁ أو P _2، على التوالي. P₁ و P ₂ لا يمكن إلا أن تأخذ القيم بين 0 و 1. عادة ما يتم تفسير القيم المتوسطة كدليل غير مباشر من الحيوانات المنوية الاختلاط، الذي يشير إلى وجود سيناريو الفسيولوجية التي تنطوي على منافسة الحيوانات المنوية مباشرة. باتباع نفس المنطق، يمكن تفسير القيم المتطرفة كدليل قوي لقدرة الحيوانات المنوية الفرق المنافسة. وأظهرت الدراسات المبكرة التي P ₂ في D. البطن هو أكثر من 0.8 زيادة عن الوقت المنقضي بين اثنين من التزاوج يطيل ^7. وقد استخدم نفس هذا التصميم التجريبي في ذبابة الفاكهة الأنواع الأخرى، P ₂ يجري إحصاء التي يشيع استخدامها في دراسات لتقييم الحيوانات المنوية القدرة التنافسية ^20. بالنسبة لمعظم الأنواع، وP القيم ₂ من سلالات اختبار أعلى من 0.6 ^21. ومع ذلك، يمكن أن عدة آليات أخرى لا علاقة لها منافسة مباشرة بين الحيوانات المنوية من الذكور مختلفة يسفر عن عشرات متطابقة (انظر المناقشة).

Dذرية istinguishing انجب من الذكور الأول أو الثاني هو ممكن من خلال استخدام علامات يسهل التعرف عليها. في الدراسات في وقت مبكر، وكان المشع واحد من الذكور في جرعات شبه مميتة، على سبيل المثال، الأشعة السينية مثل أن جميع البويضات المخصبة بواسطة الحيوانات المنوية المشع فشل ليفقس ^7. وفي وقت لاحق، كانت الطفرات تغيير تصبغ العين أو شكل الجناح علامات الأكثر استخداما. أمثلة من السابق هي طفرات من وزن الجسم (البني) ^9، CN (الزنجفر) ²² و W (أبيض) ^23، في حين أن الطفرات قبرصي (مجعد) ²⁴ يتوافق مع نوع الثاني من الظواهر، وقد تم الجمع بين بعض هذه الطفرات في نفس الشخص، على سبيل المثال CN وزن الجسم. وإلى حد أقل، إنزيمات متغايرة جينيا ²⁵ و ^26،27 الصغرية مع أنماط الميراث معروفة استخدمت أيضا.

التصميم التجريبي لاختبار الفروق فيالقدرة التنافسية الحيوانات المنوية وصفها هنا يتبع أساسا أن من كلارك وآخرون. ^9. النتائج المستمدة من هذه التجارب تعطي معلومات فقط حول أبوة الفرق من أنواع ذكر التجريبية تحت المجهر. المقايسات التي تجعل أيضا بدل عن الاختلافات بعد الإخصاب في اللياقة البدنية ^14،28 وتقنيات التصور الحيوانات المنوية ²⁴ تمكين الاختلافات في P ₁ (أو P ₂₎ يسجل أن تفسر على أنها اختلافات في اختصاص الحيوانات المنوية.

الشكل 1 يبين الأساس المنطقي لكل من الجرم والمقايسات الدفاع. لتوضيح اللوجستية للعملية، نفذت تجربة جريمة في D. البطن ¹⁴ سيتم شرحها بالتفصيل. وقد استخدم هذا الاختبار جريمة معينة لاختبار للحصول على تأثير يمكن قياسه من عائلة متعددة الجينات الحيوانات المنوية محددة سلسلة وسيطة داينين ​​(SDIC) على القدرة التنافسية الحيوانات المنوية. كل الأعضاءق من هذه العائلة متعددة الجينات الموجودة جنبا إلى جنب على الكروموسوم X. وقد تم توليد الذكور بالضربة القاضية بحذف الكتلة SDIC. لأن الجزء حذف شملت أيضا الجناح قصيرة الجينات الأساسية (SW) وكان الغرض من هذه الدراسة هو تقييم أهمية SDIC، تم انقاذ الذكور تحمل الحذف SDIC-SW بنسخة معدلة وراثيا من SW (يرمز كما P {SW} ، التي حملت أيضا مراسل الجين صغيرة بيضاء) على كروموسوم 2. وقد استخدم لون العينين كعلامة مرئية لتحديد الأبوة. كانت كل الذباب في خلفية متحولة الأبيض مع استثناء من تلك السلالة من ولاية أوريغون-R، والتي كانت تستخدم لذكور المرجعية.

Protocol

يجب أن يتم تنفيذ التجارب على نطاق صغير لتصبح مألوفة مع الإجراء بأكمله.

1. جمع إناث والذكور العذراء السذاجة

أبسط نسخة من التجربة المذكورة تتكون من أربعة أنواع من الصلبان الأولية، التي تنطوي على التركيبة التالية من البالغين: أ) W الأفراد ¹¹¹⁸ من أجل جمع الإناث عذراء؛ ب) الأفراد أوريغون-R من أجل جمع الذكور إشارة ساذجة؛ ج ) P {} SW الذكور والإناث متماثلة اللواقح عذراء من خط السيطرة الذي يحمل المنظمة من النوع البري من SDIC من أجل جمع الذكور التجريبية السذاجة (النوع الأول)، ود) P {} SW الذكور متماثلة اللواقح وSDIC-SW-الحذف التي تحمل الإناث العذراء من أجل جمع الذكور التجريبية الساذجة التي تحمل نقص SDIC-SW (النوع الثاني).

1. إعداد قوارير متعددة تحتوي على 8-10 إناث و 5 ذكور لكل منهما. السماح للإناث لوضعالبيض ونقل أشخاص إلى قارورة جديدة كل 3-5 أيام. استخدام زجاجات بدلا من قوارير إذا لزم الأمر، ودائما استخدام المواد الغذائية الطازجة. وعدد من قوارير المطلوبة تعتمد على عدد من أنواع ذكر التجريبية قيد الدراسة وعدد من الأفراد يقدر أن يكون من الضروري كشف الفروق (الجدول 1). أكثر من 10 من الإناث في قارورة قد تؤدي إلى الإفراط في الازدحام خلال نمو اليرقات، والتي قد تسبب التباين في خصوبة النسل. قارورة مخزن عند 25 درجة مئوية في غرفة التحكم في درجة حرارته.
2. البدء في جمع الإناث والذكور عذراء ساذجة في الأيام ^ال 11 و 12 ^ال بعد إعداد الصلبان الأولي. فترة الانتظار تتغير وفقا لدرجة الحرارة، وانخفاض درجات الحرارة في نتيجة قتا أطول التنموية تأخير مجموعة من الأفراد. وثمة عامل آخر يؤثر على توقيت لeclosion هو نوع من المتوسط. الطعام المغذي، مثل دقيق الذرة ^{متوسطة-29} الخميرة، ويؤكد تطور السليم للبالغينالجهاز التناسلي، مما يسهل التزاوج. جمع unmated تطير كل 4-6 ساعة. عندما جمع، تخدير الذباب عن طريق إدخال CO ₂ في قارورة، والاستفادة من الذباب إلى أسفل، والجنس منهم تحت stereomicroscope (الشكل 2). وضع الذباب المطلوب في قوارير مختلفة حسب الجنس والنمط الظاهري وتسمية قارورة بشكل مناسب.

ملاحظة 1. يبدأ روتين جمع في الصباح قبل التخلص من البالغين التي برزت خلال الليلة السابقة. جمع الإناث والذكور العذراء السذاجة مرة واحدة أو مرتين خلال النهار. عادة، D. الذكور البطن تصبح ناضجة جنسيا 8 ساعة بعد eclosion عند 25 ° C ^30. إذا تمسك الذباب تحت 12:12 ساعة الضوء / الظلام دورات، ومن المتوقع قمتين من eclosion: خلال ساعة الأولى 1-2 بعد تشغيل الضوء على، وخلال ساعة 2 قبل تشغيل ضوء قبالة. يحدث في غضون 24 ساعة Eclosion بعد يظلم خادرة.

ملاحظة 2. لا يزيد عن 10 من الإناث SHتوضع ولد في نفس القارورة لمنع الإفراط في الازدحام. هذا يحد أيضا من فقدان للإناث في حالة لديهم ليتم التخلص منها لأن واحدا منهم على الاقل ليس العذراء.

ملاحظة 3. من أجل جمع العدد المناسب من الإناث والذكور عذراء ساذجة في فترة زمنية قصيرة، ويمكن اعتماد التدابير التالية. إعداد قنينة من 15-20 ث ¹¹¹⁸ لإجراء التجارب التي تنطوي على نوعين من الذكور التجريبية (الجدول 1). رش بخفة على سطح وسائل الإعلام وإضافة بضع المجففة الكريات الخميرة نشطة لتسهيل وضع البيض. نقل الآباء على الأقل 4 مرات في أيام متتالية. لزيادة السطح المتاحة للالتشرنق في كل قارورة، إدراج ورقة متعددة مطوية (7 × 5 سم) خلال اليوم ^{الخامس عشر} 4 أو 5 بعد يتم تحويل الآباء إلى قارورة أخرى (الشكل 3). وإذا كان عدد البالغين خرجت من الصلبان الأولي لا يكفي، والانتظار لبضعة أيام وجمع األفرادALS من القنينات التي أقيمت في تواريخ مختلفة. خطة لتنفيذ التجارب على مدى عدة أيام متتالية حتى خارج عبء العمل.

2. تجارب نقرا مزدوجا التزاوج

ويبين الشكل 4 خطوات الرئيسية التي تشارك في التجارب نقرا مزدوجا التزاوج التي أجريت في ^14.

1. في صباح يوم 1، إعداد التزاوج الأول. الذكور أوريغون-R هي أول لزميله في مقايسة جريمة.
   1. باستخدام الشافطة، إعداد قارورة تحتوي على 10 أبيض العينين ث الإناث عذراء ¹¹¹⁸ 4-5 يوما و 10 أحمر العينين أوريغون-R الذكور السذاجة لكل منهما. يتم تعيين اثنين إلى ثلاثة قوارير تصل يوميا لمدة 5 أيام متتالية. قد تختلف عدد القنينات التي ستنشأ اعتمادا على عدد من الأفراد المتاحة. السماح للذباب لزميله لمدة 2 ساعة.
   2. تجاهل الذكور أوريغون-R وتضع كل أنثى في قارورة جديدة باستخدام الشافطة (الشكل 5). لا يمكن أن يتحقق تحديد الجنس عن طريق التفتيش البصري من عدد قليل منالاختلافات المورفولوجية (الشكل 2). تسمية كل قارورة بشكل مناسب وترك الأنثى في قارورة لمدة 2 يوم (الآخرة "V1").
2. في يوم 3، وإعداد التزاوج الثاني. يجب أن يتم تنفيذ مجموعة من الذكور وعبر إعداد عشوائيا من أجل تقليل أي تحيز محتمل تجاه أي من أنواع ذكر التجريبية.
   1. قبل ساعتين من تشغيل ضوء قبالة، ونقل مرة أخرى الأنثى إلى قارورة جديدة مع الشافطة. تسمية القارورة الجديدة بشكل مناسب (الآخرة "V2").
   2. أعرض ثلاثة ذكور التجريبية 5-6 أيام من العمر من نفس النمط الجيني إلى V2.
   3. كرر 2.2.1 و 2.2.2 لكل أنثى.
   4. في يوم 4، ساعتين الحق قبل ضوء في وضع التشغيل (أي ما لا يزيد عن 12 ساعة بعد 2.2.1)، وتجاهل الذكور باستخدام الشافطة.
3. في يوم 6، ونقل كل أنثى مرة أخرى إلى قارورة أخرى جديدة. تسمية قارورة جديدة بشكل مناسب (الآخرة "V3").
4. في يوم 10، وتجاهل ¹¹¹⁸ ث .
5. دراسة السلالات في V2 و v3. يتم تنفيذ عملية التفتيش الأولى بعد 13-15 يوما بعد أن يتم إدخال الأنثى في V2 (أو V3)، على سبيل المثال في يوم 17 بعد أول امرأة في ovipositing بدأت في V2. يتم تنفيذ عملية التفتيش الثانية بالضبط بعد 17 يوما. هذا الإطار الزمني يشكل الحدود الزمانية العلوي آمن يضمن أي الجيل الثاني في نفس القارورة. عمليتي تفتيش منع الإفراط في الازدحام مع تسهيل العد ذرية.
   1. في يوم 17، وفحص V1 وضمان عدم وجود ذرية أحمر العينين الحاضر، وإذا كان لا علامة القارورة وفقا لذلك. جود ذرية بيضاء العينين يشير إلى أن الإناث لم يكن عذراء في وقت التزاوج الأولي في حين لا ذرية يشير إلى أن التزاوج مع الإشارة أو الذكور التجريبية لم يحدث.
   2. في يوم 17، نفذ أول عملية تفتيش من V2. ظهرت تخدير ذرية في V2 مع CO ₂ وفرزها حسب اللون العين والجنس. أرقام ذرية سجل أنجب من الأولى والثانيةالذكور أندو. الشكل 6 يبين الظواهر المتوقعة في ذرية من كل مخطط التزاوج. في هذه التجربة ¹⁴ خاصة، فقط ذرية الإناث يمكن تعيين بشكل لا لبس فيه كما انجب من الإشارة أو الذكور التجريبية، وبالتالي فقط على المعلومات من بنات يمكن استخدامها لحساب P _2. إذا مع علامات أخرى في أبوة ذرية من الذكور يمكن تعيين بشكل لا لبس فيه، التهم ذرية من كلا الجنسين يمكن استخدامها في العمليات الحسابية المصب. تجاهل ذرية ولكن يبقى V2 للتفتيش الثاني.
   3. في يوم 20، والمضي قدما كما هو الحال في 2.5.2 مع السلاله ظهرت حديثا في V2 ثم تجاهل القارورة.
   4. في يوم 20، وفحص ذرية ظهرت في V3 للمرة الأولى واتبع الخطوة 2.5.2.
   5. في يوم 23، والمضي قدما كما هو الحال في 2.5.3 مع السلاله ظهرت حديثا في V3.

ملاحظة 1: ونظرا لتأثير محتمل على تضخيم عشرات P أن التزاوج متعددة قد يكون (2.2.2 و 2.2.3)، التزاوجيمكن أن تقتصر على فترة زمنية معينة. والإطار الزمني تعتمد على تردد remating المرتبطة النمط الجيني للإناث والذكور المستخدمة. يتم تقليل احتمال التزاوج متعددة خصيصا من مرة خلال الليل ^11.

ملاحظة 2: لا تقم بإضافة حبيبات الخميرة الحية لأن هذا قد يسبب مشاكل بسبب فرط المحتملة من الخميرة عندما يكون عدد الذباب الكبار منخفضة.

3. تحليل البيانات

1. وينبغي تنظيم التهم ذرية سجلت مناسب للتفتيش البصرية سهل والتحليل كفاءة مع الحزمة الإحصائية المناسبة (مثل أحزاب اللقاء المشترك من معهد SAS) أو أدوات مجانية على شبكة الإنترنت (على سبيل المثال http://vassarstats.net/ ).
2. القدرة التنافسية الحيوانات المنوية. أضف التهم من V2 و v3. الذباب الإناث التي أدت إلى ما لا أو محدودة جدا ذرية (على سبيل المثال <10)، توفي أثناء إجراء، أو كانت بنجاح إلا inseminaتعتبر تيد من قبل واحدة من الذكور اثنان على أنها غير مفيدة ومستثناة من أي تحليل إحصائي المصب (2.5.1 والجدول 2). حساب P ₂ درجة لكل أنثى بالمعلومات.
3. اختبار ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في القيم P ₂ بين الذكور التجريبية مقارنة. ويمكن القيام بذلك باستخدام حدودي (HSD مثل توكي) أو غير المعلمية الاختبارات (مثل الصلب Dwass) اعتمادا على عدة عوامل بما في ذلك عن أي انحراف في توزيع القيم P ₂ والتبعية بين التباين والمتوسط. يتم تطبيق التحول الزاوي عادة إلى أبعاد مثل P ₂ قبل استخدام الاختبارات المعلمية ^31.
4. الاختلافات معدل التزاوج (اختياري). لكل نوع من الذكور التجريبية، وحساب عدد الإناث تزاوج على نحو مضاعف، وتلك التي تزاوج فقط مع ذكر الأول (ذكر مرجع في مقايسة الجرم وذكر التجريبية في دefense مقايسة). باستخدام اختبار ثنائي الطرف فيشر الدقيق (متوفر في http://www.langsrud.com/fisher.htm )، وتحديد ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين هذين النوعين من الذكور التجريبية.
5. نسبة الجنس (اختياري). لكل من الذكور التجريبية، استخدم اختبار خي مربع لتحديد ما إذا كانت النسبة بين الجنسين في ذرية من كل ينحرف أنثى من نسبة 1:1 المتوقعة.

النتائج

يلخص الجدول 2 بعض السمات البارزة لتجربتين جريمة (فحوصات 1 و 2) التي D. تتم مقارنة البطن الذكور التجريبية مع وبدون (النوع الأول والثاني، على التوالي) كتلة SDIC الوظيفية ^14. بعد الأخذ في الاعتبار حالات مختلفة واجهتها مع بعض مكررات، تم العثور على 5...

Discussion

وصفناها التصميم التجريبي لتقييم الاختلافات في المساهمة النسبية متميزة وراثيا D. الذكور البطن إلى ذرية في التجارب التي تسيطر عليها نقرا مزدوجا التزاوج ^7،8. وقد تم ذلك في سياق العامل الوراثي الافتراض للتأثير على القدرة التنافسية الحيوانات المنوية، وقد ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes