Beurteilung Differenzen in Sperm Wettbewerbsfähigkeit in<em&gt; Drosophila</em

Zusammenfassung

Geringe Spermien Wettbewerbsfähigkeit unter Drosophila Männer mit unterschiedlichen Genotypen können durch Doppelklick Paarung Experimenten ermittelt. Jedes dieser Experimente beinhaltet eines der Männchen von Interesse und einem Verweis männlich. Leicht erkennbare Markierungen in der Nachkommenschaft erlauben Rückschluss auf den Anteil der Personen, die von jeder männliche gezeugt.

Zusammenfassung

Der Wettbewerb unter den Artgenossen Männchen zur Befruchtung der Eizellen ist einer der Mechanismen der sexuellen Selektion, dh Auswahl, die auf die Maximierung der Anzahl der erfolgreichen Paarung Veranstaltungen statt auf Maximierung Überleben und die Lebensfähigkeit ¹ arbeitet. Sperma Wettbewerb stellt die Konkurrenz zwischen Männern nach Kopulation mit derselben ^2, in denen ihre Spermien sind zufällig in Zeit und Raum. Dieses Phänomen ist in verschiedenen Arten von Pflanzen und Tieren ³ gemeldet. Zum Beispiel, in freier Wildbahn gefangenen D. melanogaster Weibchen Spermien enthalten in der Regel 2-3 Männchen ^4. Die Spermien werden in speziellen Organen mit begrenzter Speicherkapazität, die auf die direkte Konkurrenz der Spermien von verschiedenen Männchen ^2,5 führen könnten gespeichert.

Vergleicht Spermien Wettbewerbsfähigkeit der verschiedenen Männchen von Interesse (experimentelle männlichen Typen) hat durch kontrollierte Doppel-Paarung experimentell durchgeführt wordents im Labor ^6,7. Kurz gesagt, wird ein einziges Weibchen zu zwei verschiedenen Männern nacheinander, einer experimentellen Männchen und ein Cross-Referenz Paarung männlich ausgesetzt. Die gleiche Paarung Schema wird dann unter Verwendung von anderen experimentellen männlichen Typen und erleichtert so die indirekten Vergleich der Wettbewerbsfähigkeit ihrer Spermien durch eine gemeinsame Referenz. Der Anteil der Personen, die von der experimentellen und Referenz Männchen gezeugt wird identifiziert mit Markern, die man Sperma Wettbewerbsfähigkeit durch eine einfache mathematische Ausdrücke ^7,8 abschätzen können. Darüber hinaus können Spermien Wettbewerbsfähigkeit in zwei verschiedene Szenarien je nachdem, ob die experimentelle Männchen zweite oder erste Partner (Angriff und Verteidigung Assay bezeichnet) ^9, von der angenommen wird reflektierenden unterschiedlicher Kompetenz Eigenschaften geschätzt wird.

Hier beschreiben wir einen Ansatz, um die Rolle der verschiedenen genetischen Faktoren, die mutmaßlich zugrunde t verhören hilfter Phänomen der Spermien Wettbewerbsfähigkeit in D. melanogaster.

Einleitung

Seit Geoff Parker nahm die Prävalenz von Spermien Wettbewerb in Insekten und ihre evolutionären Implikationen ^2, haben eine Welle von Studien in Drosophila und andere Arten versucht, etwas Licht auf dieses Phänomen Schuppen auf vielen verschiedenen Ebenen. Einige Beispiele für Bereiche von Interesse waren die Umfrage ihrer Variation in natürlichen Populationen ^9,10, seine genetische Architektur und Relevanz der zugrunde liegenden genetischen Faktoren ^11-14, und seine Rolle bei der Koevolution zwischen den Geschlechtern ^15,16. In D. melanogaster Weibchen, die begrenzte Kapazität der spezialisierten Spermien-storage Organe, ein Paar Spermatheka und dem bahnbrechenden Aufnahme ^6,17, trägt dazu bei, den Wettbewerb der Spermien von verschiedenen Männchen. Etwa 1.500 Spermien bei der Paarung mit dem weiblichen, aber nur ~ 500 übertragen werden können in den genannten Organen ^18,19 untergebracht werden. Im Labor kontrollierte Doppelblind-Paarung Erfahrungengen mit einen Verweis Männchen und ein oder mehrere Männchen von Interesse wurden ausgiebig zur Auswertung Spermien Wettbewerbsfähigkeit ^7,8 verwendet.

Sperma Wettbewerbsfähigkeit ist als der Anteil der Nachkommen durch die experimentelle männlich in Doppel-Paarung Experimente über den gesamten Nachkommen gezeugt geschätzt, dh, dass sowohl von der experimentellen und Referenz Männer. Sperma Wettbewerbsfähigkeit besteht aus zwei Komponenten, von denen jede in einem separaten Test ausgewertet. In der Straftat-Assay wird die Fähigkeit der experimentellen männlichen Spermien, die Spermien aus dem ersten männlichen verdrängen, dh der Bezug männlich, ausgewertet wird. Umgekehrt bei der Verteidigung Assay wird die Fähigkeit des experimentellen männliche Samenzellen Verschiebung widerstehen oder um die Befruchtung Erfolg des Referenz männlichen Spermien reduziert wird ausgewertet. Je nach der Art des Assays, Angriff oder Verteidigung, ist Sperma Wettbewerbsfähigkeit durch die Partituren P ₁ oder P _2, jeweils geschätzt. P₁ und P ₂ können nur Werte zwischen 0 und 1 liegt. Zwischenwerte werden in der Regel als indirekter Nachweis von Spermien Mischen, also unter physiologischen Bedingungen im Zusammenhang mit Direktinvestitionen Spermien Wettbewerb schlägt interpretiert. Nach dem gleichen Grundprinzip, können extreme Werte als Beweis für eine starke Differenz Spermien Wettbewerbsfähigkeit interpretiert werden. Frühe Studien zeigten, dass P ₂ in D. melanogaster ist über 0,8 zunimmt, wenn die Zeit zwischen den beiden Paarungen verlängert ⁷ verstrichen ist. Dieselbe Versuchsanordnung in anderen Spezies Drosophila benutzt worden ist, wobei P ₂ der gebräuchliche Kennziffer in Studien Spermien Wettbewerbsfähigkeit ²⁰ auszuwerten. Für die meisten Arten ist die _P-2-Werte der getesteten Stämme höher als 0,6 ^21. Dennoch können einige andere Mechanismen nicht mit der direkten Konkurrenz zwischen Spermien verschiedener Männchen zu identischen Noten (siehe Diskussion).

Distinguishing Nachkommen von den ersten oder zweiten Männchen gewünscht ist durch den Einsatz von leicht identifizierbaren Marker möglich. In frühen Studien, einer der Männer bei subletalen Dosen bestrahlt wurde, z. B. X-Strahlen, so dass praktisch alle Eizellen von bestrahlten Spermien befruchtet versäumt, ⁷ schlüpfen. Anschließend wurden Mutationen verändern Augenpigmentierung oder Flügelform war die am häufigsten verwendeten Marker. Beispiele für erstere sind die Mutationen bw (braun) ^9, cn (Zinnober) und ²² W (weiß) ^23, während die Mutation Cy (Curly) ²⁴ entspricht der zweiten Art von Phänotypen, einige dieser Mutationen in die kombiniert wurden demselben Individuum, z. B. cn bw. In geringerem Umfang wurden Allozyme ²⁵ und ^26,27 Mikrosatelliten mit bekannten Vererbungsmuster auch verwendet worden.

Die Versuchsanordnung, um Unterschiede in testenSpermien Wettbewerbsfähigkeit hier beschriebenen folgt im Wesentlichen der von Clark et al. ^9. Ergebnisse aus diesen Versuchen abgeleitet geben Informationen nur über die Differential Vaterschaft der experimentellen männlichen Typen unter die Lupe genommen. Assays, die auch für die Zulage nach der Befruchtung Unterschiede in Fitness-und Samenzellen ^14,28 Visualisierungstechniken ²⁴ ermöglichen Unterschiede in P ₁ (oder P ₂₎ erzielt als Unterschiede in Spermien Kompetenz interpretiert werden.

Abbildung 1 skizziert das Grundprinzip sowohl der Straftat und die Verteidigung Assays. Um die Logistik des Prozesses zu veranschaulichen, eine Straftat durchgeführt Experiment in D. melanogaster ¹⁴ im Detail erläutert werden. Diese besondere Straftat Assay wurde verwendet, um für einen messbaren Effekt der Multigenfamilie Sperma-spezifische dynein Zwischenkette (Sdic) auf Spermien Wettbewerbsfähigkeit zu testen. All das Mitglieds dieser Genfamilie im Tandem auf dem X-Chromosom liegen. Knockout Männer wurden durch das Löschen der Sdic Cluster generiert. Weil das gelöschte Segment gehörte auch die essentiellen Gens kurze Flügel (sw) und der Zweck der Studie war es, die Bedeutung der Sdic bewerten, wurden die Männchen tragen Sdic-sw Löschung durch eine transgene Kopie sw gerettet (symbolisiert als P {sw} , die auch trug einen weißen Mini-Reporter-Gen) auf dem Chromosom 2. Augenfarbe wurde als sichtbare Markierung für Vaterschaft Identifizierung verwendet. All die Fliegen waren in einem weißen Hintergrund mit mutierten Ausnahme derjenigen, die aus dem Stamm Oregon-R, die als Referenz verwendet wurden Männchen.

Protokoll

Kleines Experimente durchgeführt werden, um sich mit der ganzen Prozedur werden.

1. Sammeln Virgin Weibliche und Männliche Naive

Die einfachste Version des skizzierten Experiment besteht aus vier Typen von anfänglichen Kreuze, die die folgende Kombination von Erwachsenen beinhalten: a) w ^1.118 Personen um jungfräulichen Weibchen sammeln, b) Oregon-R Einzelpersonen, um naive Referenz Männchen sammeln; c ) P {sw} homozygoten Männchen und jungfräulichen Weibchen aus einer Steuerleitung, die die Wildtyp-Organisation Sdic trägt, um naive experimentellen Männer (Typ I) zu sammeln, und d) P {sw} homozygoten Männchen und Sdic-sw-Deletion tragenden jungfräulichen Weibchen um naive experimentellen Männchen, welche die Sdic-sw-Mangel (Typ II) führen zu sammeln.

1. Richten Sie mehrere Fläschchen mit 8-10 Frauen und 5 Männer jeweils. Erlauben die Weibchen legenEier und übertragen Sie die Erwachsenen, um neue Fläschchen alle 3-5 Tage. Verwenden Flaschen anstatt Fläschchen, wenn notwendig und immer frische Lebensmittel. Die Zahl der je erforderlich ist, hängt die Anzahl der experimentellen männlichen untersuchten Arten und der Anzahl der Personen geschätzte Bedarf Unterschiede (Tabelle 1) zu erfassen, abhängen. Mehr als 10 Frauen pro Fläschchen könnte in Überbelegung während Larvenwachstum, die Variation in der Fruchtbarkeit der Nachkommen führen kann. Aufbewahrung von Röhrchen bei 25 ° C in einer temperaturgeregelten Kammer.
2. Starten Sammeln jungfräulichen Weibchen und Männchen naiv an den Tagen 11 und ^12. Nach dem Einrichten der anfänglichen Kreuze. Die Wartezeit variiert je nach der Temperatur; niedrigeren Temperaturen führen zu längeren Entwicklungszeit Verzögerung der Ansammlung von Individuen. Ein weiterer Faktor, der das Timing zum Schlüpfen der Art des Mediums. Nahrhaftes Essen, wie Maismehl-Hefe-Medium ^29, versichert die richtige Entwicklung der erwachsenenFortpflanzungsorgane, die Paarung erleichtert. Sammle ungesteckt fliegt jede 4-6 Stunden. Bei der Erhebung, betäuben fliegt durch die Einführung von CO ₂ in das Fläschchen, tippen Sie auf die Fliegen ab, und Sex sie unter Stereomikroskop (Abbildung 2). Legen Sie die gewünschten fliegt in verschiedenen Fläschchen nach Geschlecht und Phänotyp und Etikett der Fläschchen entsprechend.

Anmerkung 1. Sammlung Routine beginnt in der Früh mit dem Verwerfen der Erwachsenen, die in der vergangenen Nacht entstanden. Sammle jungfräulichen Weibchen und Männchen naiv einmal oder zweimal während des Tages. Typischerweise D. melanogaster Männchen geschlechtsreif werden 8 Stunden nach dem Schlüpfen bei 25 ° C ^30. Wenn Fliegen unter 0.12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklen beibehalten werden zwei Gipfeln eclosion erwartet: während der ersten 1-2 Stunden nach der das Licht auf, und während der 2 Stunden ausgeschaltet wird, bevor das Licht ausgeschaltet wird. Eclosion erfolgt innerhalb von 24 Stunden nach der Puppe verdunkelt.

Anmerkung 2. Nicht mehr als 10 Frauen should in die gleiche Flasche gesetzt werden, um Überfüllung zu vermeiden. Dies begrenzt auch den Verlust von Frauen im Falle sie verworfen werden, da mindestens eine von ihnen ist nicht virgin.

Anmerkung 3. Um die entsprechende Anzahl von jungfräulichen Weibchen und Männchen naiv in kurzer Zeit zu sammeln, können folgende Maßnahmen getroffen werden. Einrichten 15-20 Fläschchen w ¹¹¹⁸ für Experimente mit zwei Arten von experimentellen Männern (Tabelle 1). Leicht streuen die Oberfläche der Medien und ein paar getrocknete aktive Hefe Pellets Eiablage zu erleichtern. Übertragen Eltern mindestens 4 mal an aufeinander folgenden Tagen. Um die zur Verfügung stehende Fläche für Verpuppung in jedem Fläschchen zu erhöhen, legen mehrfach gefalteten Papier (7 x 5 cm) in der ^4. oder ^5. Tag nachdem die Eltern in ein anderes Fläschchen (Abb. 3) übertragen werden. Wenn die Anzahl der Erwachsenen entstanden aus der anfänglichen Kreuze ist nicht genug, noch ein paar Tage warten und sammeln Sie individuellALS von Röhrchen bis zu unterschiedlichen Terminen eingestellt. Planen Sie für die Durchführung der Experimente über mehrere Tage hintereinander zum Ausgleich der Arbeitsbelastung.

2. Doppel-Paarung Experimente

Abbildung 4 zeigt die wichtigsten Schritte in Doppel-Paarung in ¹⁴ Experimente durchgeführt beteiligt.

1. Am Morgen des 1. Tag, beim Einrichten des ersten Paarung. Die Oregon-R Männchen sind die ersten in der Offensive Assay paaren.
   1. Mit dem Sauger, Fläschchen, die Einrichtung von 04 bis 05 Oktober-day-old white-eyed w ¹¹¹⁸ jungfräulichen Weibchen und 10 rot-eyed Oregon-R naiv Männchen je. Zwei bis drei Flaschen werden täglich an 5 aufeinander folgenden Tagen eingestellt. Die Zahl der je eingerichtet werden können je nach der Anzahl der verfügbaren Individuen. Lassen Sie die Fliegen für 2 Stunden paaren.
   2. Verwerfen Oregon-R Männer und platzieren Sie jede Frau in ein neues Gefäß unter Verwendung eines Gebläses (Abbildung 5). Sex Identifikation kann durch visuelle Inspektion von wenigen erreicht werdenmorphologischen Unterschiede (Abbildung 2). Beschriften Sie jedes Fläschchen angemessen und lassen Sie die Frau in dem Fläschchen für 2 Tage (im Folgenden "v1").
2. Am Tag 3, Einrichten der zweiten Paarung. Auswahl von Männchen und Cross Einrichtung sollte zufällig durchgeführt werden, um mögliche Tendenz zu einem experimentellen männlichen Arten minimieren.
   1. Zwei Stunden, bevor das Licht ausgeschaltet ist, wieder übertragen die weiblichen in ein neues Gefäß mit einem Sauger. Beschriften Sie die neue Flasche angemessen (im Folgenden "v2").
   2. Führen Sie drei 5-6 Tage alten experimentellen Männchen des gleichen Genotyps in v2.
   3. Wiederholen 2.2.1 und 2.2.2 für jeden weiblich.
   4. An Tag 4 wird 2 Stunden direkt vor dem Licht auf (dh nicht mehr als 12 Stunden nach 2.2.1), verwerfen Männchen mit dem Sauger eingeschaltet.
3. Am Tag 6, übertragen jedes Weibchen wieder in eine andere neue Flasche. Beschriften Sie die neuen Fläschchen angemessen (im Folgenden "v3").
4. Am 10. Tag, entsorgen Sie die w ¹¹¹⁸ Frauen.
5. Untersuchen Sie die Nachkommen in v2 und v3. Die erste Inspektion ist nach 13-15 Tagen durchgeführt, nachdem das Weibchen in v2 (oder v3), am Tag 17 nach der weiblichen anfing Eiablage in v2 zB eingeführt wird. Die zweite Prüfung ist genau nach 17 Tagen durchgeführt. Dieser Zeitrahmen stellt eine sichere obere zeitliche Grenze, die keine zweite Generation in der gleichen Flasche garantiert. Zwei Kontrollen verhindern Überbelegung und erleichtert Nachkommen zählen.
   1. Am Tag 17, inspizieren v1 und sicherzustellen, dass es rot-eyed Nachkommen vorhanden, wenn nicht markieren das Fläschchen entsprechend. Vorhandensein von weißen Augen Nachkommen zeigt an, dass das Weibchen nicht Jungfrau zum Zeitpunkt der ersten Paarung, während keine Nachkommen zeigt, dass die Paarung mit dem Verweis oder den experimentellen Männer traten nicht auf.
   2. Am Tag 17, führen Sie die erste Inspektion v2. Anesthetize entstanden Nachkommen in v2 mit CO ₂ und sortieren sie nach Augenfarbe und Geschlecht. Nimm Nachkommen Zahlen des ersten und zeugtezweite Männchen. Abbildung 6 zeigt die erwarteten Phänotypen bei den Nachkommen von jeder Paarung Schema. In diesem speziellen Experiment ^14, können nur weibliche Nachkommen eindeutig zugeordnet werden, da durch den Verweis oder die experimentellen Männchen gezeugt und deshalb nur die Informationen von den Töchtern kann verwendet werden, um P ₂ zu berechnen. Wenn mit anderen Markern die Vaterschaft von männlichen Nachkommen eindeutig zugeordnet werden kann, kann Nachkommen Grafen von beiden Geschlechtern in nachgelagerten Berechnungen verwendet werden. Entsorgen Sie die Nachkommen aber halten Sie für die zweite Inspektion v2.
   3. Am Tag 20, wie in 2.5.2 mit dem neu entstandenen Nachkommen in v2 gehen und dann das Fläschchen entsorgen.
   4. Am Tag 20, inspizieren die entstanden Nachkommen in v3 zum ersten Mal, und folgen Sie Schritt 2.5.2.
   5. Am Tag 23, wie in 2.5.3 mit dem neu entstandenen Nachkommen in v3 gehen.

Anmerkung 1: Aufgrund der möglichen Auswirkungen auf Aufblasen P Partituren, dass mehrere Paarung haben könnte (2.2.2 und 2.2.3), Paarungauf einen bestimmten Zeitrahmen beschränkt. Die Zeitspanne hängt von der Frequenz remating mit dem Genotyp des weiblichen und männlichen verwendet verbunden abhängen. Die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Paarung ist speziell während der Nachtzeit ¹¹ reduziert.

Anmerkung 2: Fügen Sie keine lebende Hefe Pellets, weil diese Probleme wegen möglicher Überwucherung der Hefe, wenn die Zahl der erwachsenen Fliegen niedrig ist verursachen könnten.

3. Data Analysis

1. Aufgezeichnet Nachkommen zählt sollten angemessen für eine einfache Sichtprüfung und effiziente Analyse organisiert werden mit einem geeigneten statistischen Paket (zB JMP von SAS Institute) oder kostenlose Web-basierte Tools (zB http://vassarstats.net/ ).
2. Sperma Wettbewerbsfähigkeit. Fügen zählt von v2 und v3. Weibliche Fliegen, die Anlass gegeben haben, keine oder sehr begrenzte Nachkommen (zB <10), starb während des Verfahrens, oder waren nur erfolgreich BesamungTed von einer der beiden Männer werden als nicht informativ betrachtet und von einer eventuell nachgeschalteten statistischen Analyse (2.5.1 und Tabelle 2) ausgeschlossen. Berechnen Sie den P ₂ Punkte für jeden informative weiblich.
3. Testen Sie, ob es statistisch signifikante Unterschiede in P _2-Werte unter den experimentellen Männern. Dies kann mit Hilfe parametrischer (zB Tukey HSD) oder nicht-parametrische (zB Stahl-Dwass) Tests in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Schiefe der Verteilung der P _2-Werte und die Abhängigkeit zwischen der Varianz und der Mittelwert werden. Die Winkelumwandlung allgemein Proportionen wie P ₂ angelegt vor der Verwendung der parametrischen Tests ^31.
4. Mating Kursdifferenzen (optional). Für jeden experimentellen männlichen Typ, der überlege die Zahl der doppelt gedeckt Frauen und solche, die nur mit dem ersten Mann (der Verweis männlich in der Offensive Assay und die experimentelle Männchen in der d gepaartefense Assay). Verwendung eines zweiseitigen Fisher-Test (erhältlich unter http://www.langsrud.com/fisher.htm ), ob statistisch signifikante Unterschiede zwischen den beiden Typen von experimentellen Männer.
5. Geschlechterverhältnis (optional). Für jeden experimentellen männlich, verwenden Sie den Chi-Quadrat-Test, ob das Verhältnis der Geschlechter in den Nachkommen von jedem weiblichen weicht von dem erwarteten 1:1-Verhältnis zu bestimmen.

Ergebnisse

Tabelle 2 fasst einige hervorstechende Merkmale von zwei Experimenten Straftat (Assays 1 und 2), in dem D. melanogaster experimentellen Männern mit und ohne (Typ I und II, jeweils) einer funktionellen Sdic Cluster ¹⁴ verglichen. Nach Berücksichtigung verschiedener Vorfälle mit einigen Wiederholungen angetroffen wurden 58-83% der Frauen gefunden informativ sein und damit die Vaterschaft zählt ihrer Nachkommen könnten für die Berechnung P ₂ verwendet werden. D...

Diskussion

Wir haben die experimentellen Design beschrieben, um Unterschiede in den relativen Beitrag von genetisch unterschiedlichen beurteilen D. melanogaster Männchen auf die Nachkommenschaft in kontrollierten Doppelblind-Paarung Experimente ^7,8. Dies wurde im Zusammenhang mit einer genetischen Faktor Hypothese Spermien Wettbewerbsfähigkeit beeinflussen, und es hat in der Tat Assay veranschaulicht, obwohl ein ähnlicher Vorgang gilt für die Verteidigung Assay (Fig. 1) geschehen. Diese Ver...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes