の精子競技能力の違いを評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em

要約

間の差分精子競争力ショウジョウバエ男性はダブル交配実験により確認することができる。これらの実験の各々は、金利および参照男性の男性のいずれかを含んでいる。子孫で容易に識別マーカーはそれぞれ男性で父親個人の画分の推論を可能にする。

要約

卵子が受精するための同種オス間の競争は、生き残りと生存^1の最大化に成功した交配イベントの数を最大化するのではなく、上で動作性選択、 つまり選択のメカニズムの1つです。精子競争が彼らの精子は、時間と空間の偶然であるのと同じ女性²で交尾後のオス間の競争を表しています。この現象は、植物や動物³の複数の種が報告されている。例えば、野生で捕獲されたD.ショウジョウバエのメスは通常2-3人の男性⁴から精子が含まれています。精子は、異なる男性^2,5から精子の直接競争につながる可能性が限られたストレージ容量を持つ専門の臓器に格納されています。

関心の異なる男性（実験オスタイプ）の精子競争力を比較すると対照二重交配experimenを介して実行されています実験^6,7のTS。簡単に説明すると、単一の女性を連続二つの異なる男性、1実験雄と1クロス交配リファレンス男性にさらされている。同じ交配スキームは、その後こうして共通の基準を通じて精子の競争力の間接的な比較を容易にし、他の実験的な男性のタイプを使用して続いている。実験および参照男性が父親の個人の割合は、一つは単純な数式の^7,8を使用して精子競争能力を推定することができるマーカーを使用して識別されます。また、精子競争力を実験オス異なる能力属性の反射であると仮定されメイト（それぞれ攻撃と防御アッセイ^）09への第2又は第であるかに応じて2つの異なるシナリオで推定することができる。

ここでは、推定さtの根底に異なる遺伝因子の役割を調べるために役立ちアプローチを説明彼D.の精子競争力の現象キイロ 。

概要

ジェフ·パーカーが、昆虫やその進化の意味²の精子競争の有病率を指摘しているので、 ショウジョウバエや他の種における研究の急増は、多くの異なるレベルでこのような現象にいくつかの光を当てることを試みた。関心のある分野のいくつかの例は、自然個体^9,10、その遺伝アーキテクチャと遺伝的要因^11-14、そして男女^15,16の間に共進化を駆動におけるその役割の基礎との関連性で、その変化の調査であった。 D.でショウジョウバエの雌、専門の精子貯蔵器官の限られた容量、貯精嚢と精レセプタクル^6,17のペアは、別の男性からの精子の競争に貢献しています。約1,500精子が挙げ臓器^18,19に収容することができます女性だけ〜500に交尾中に転送されます。研究室では、管理されたダブル交配実験基準男性および1つまたは複数の目的の雄を含むメンツが広く精子競争力^7,8を評価するために使用されてきた。

精子競争能力は合計子孫上、 すなわちその実験と参照男性の両方からダブル交配実験で実験男性によって産ま子孫の割合と推定される。精子競争能力は、2つのコンポーネント、別個のアッセイで評価し、それらの各々を含む。オフェンスアッセイ、第雄から精子を置換するための実験的な男性の精子の能力では、基準マレ、 すなわち評価される。逆に、防御アッセイにおいて、変位に抵抗するか、または基準男性の精子の受精の成功を低減するために実験的な男性の精子の能力が評価される。アッセイ、防御または攻撃の種類に応じて、精子競争力がゴールP ₁又はP ₂のそれぞれを介して推定される。 P_{1、P 2は、0}と1の間の値だけを取ることができる。中間値は、通常は直接精子競争を伴う生理的なシナリオを示唆している精子混合、の間接的な証拠として解釈されます。同じ根拠に続いて、極端な値が強力な差動精子競争能力の証拠として解釈することができます。初期の研究では、ことを示したDのP ₂ ショウジョウバエは ^7が長く2交配間の経過時間として増加0.8を超えています。この同じ実験計画は、他のショウジョウバエ種で使用されている、P _2は、精子競争力^20を評価する試験において一般的に使用される統計量である。ほとんどの種について、試験した菌株のP ₂の値が0.6以上である^21。それにもかかわらず、別の男性の精子との間の直接的な競争とは無関係な他のいくつかのメカニズムが同じスコアを（説明を参照）を得ることができます。

D第一又は第二の男性が産まistinguishing子孫を容易に識別マーカーの使用を介して可能である。初期の研究では、男性のいずれかの致死線量で照射した、例えば、照射された精子によって受精したX線ように実質的にすべての卵子では⁷孵化に失敗しました。続いて、眼の色素沈着または翼の形状を変化させる変異は、最も一般的に使用されるマーカーされている。前者の例としては、突然変異であるBW（ブラウン^）9、CN（辰砂 ^）22とW（白 ^）23、表現型の二種類に変異サイ （ カーリー ^）24 ​​に対応しながら、これらの変異のいくつかはに統合されました同じ個人、 例えばCN体重 。公知の遺伝パターンと少ない程度、アロザイム²⁵及びマイクロサテライト^26,27にも使用されている。

の違いをテストするための実験デザインここで説明する精子競争力は本質的にクラークらのことを次の^9。これらの実験から得られた結果は、精査の下で実験的な男性のタイプの差父親に関する情報のみを与える。受精後のフィットネス^14,28の違いと精子可視化技術^24は P ₁の違い（またはP _2）スコアが精子能力の違いとして解釈されることを可能にするためにも金を作るアッセイ。

図1は攻防アッセイの両方の原理を概説します。プロセスの物流を説明するために、攻撃実験をD.で行うキイロ ¹⁴について詳細^に説明する。この特定の犯罪アッセイは精子競争力上の多重遺伝子ファミリー精子特有のダイニン中間鎖（SDIC）の測定可能な効果をテストするために使用されていました。すべてのメンバーこの多重遺伝子ファミリーのsがX染色体上にタンデムに存在します。ノックアウト男性はSDICクラスタを削除することによって生成された。削除されたセグメントはまた必須遺伝子短い翼（SW）が含まれており、研究の目的は、SDICの関連性を評価することであったので、SDIC-SWの削除を運ぶ男性は（P {SW}として象徴SWのトランスジェニックコピーによって救出されたまた、染色体2上のミニ白レポーター遺伝子）を実施している。眼の色は父親を識別するための可視マーカーとして使用した。すべてのハエは参照男性として用いた菌株オレゴン-Rからのものを除いて、 白の変異背景にあった。

プロトコル

小規模実験は全体の手順に慣れるために実行する必要があります。

1。処女雌とナイーブ男性の収集

概説された実験の最も単純なバージョンは、大人は、次の組み合わせを含む初期の十字架、の4つのタイプで構成されます。）W ¹¹¹⁸個人処女雌を収集するためにと、b）オレゴン-Rの個人ナイーブ参照男性を収集するために; C ）P {SW}ホモ接合男性と処女の女性ナイーブ実験男性（タイプI）を収集するために、SDICの野生型の組織を運ぶ制御ラインからのステップと、d）P {SW}ホモ接合男性とSDIC-SW-削除を運ぶSDIC-SW欠乏 （タイプII）を運ぶナイーブ実験男性を収集するために処女雌を。

1. 8-10女性と5人の男性をそれぞれ含む複数のバイアルを設定します。女性は産むことを許可卵、すべての3〜5日新しいバイアルに大人を転送します。ペットボトルではなく、必要に応じてバイアルを使用し、常に新鮮な食品を使用しています。必要なバイアルの数は、研究中の実験雄タイプの数との違い（ 表1）を検出することが必要であると推定個体数に依存する。バイアルあたり10以上の女性は、子孫の生殖能力の変動を引き起こす可能性が幼虫の成長、中にオーバー混雑になる可能性があります。 25で保存バイアル°温度制御チャンバー内のC。
2. 初期の十字架を設定した後の日に11 ^番目と12 ^番目の処女雌とナイーブな男性の収集を開始。待機期間は、温度に応じて異なり、低い温度の結果は長く発達時に個人のコレクションを遅らせる。孵化するタイミングに影響を及ぼす他の要因は、媒体の一種である。このようなコーンミール·酵母媒体²⁹として栄養価の高い食品は、大人の適切な開発を保証交配を促進する生殖器系、。嵌合解除の収集は、すべての4-6時間を飛ぶ。収集する場合、バイアルにCO _2を導入することにより、ハエを麻酔、ハエを下にタップし、セックス実体顕微鏡下でそれら（ 図2）。セックスと適切に表現型とラベルバイアルによって異なるバイアルに希望のハエを置きます。

（注1）。コレクションルーチンが破棄によって、午前中に前の夜の間に現れた大人を開始します。日中は一度か二度処女雌とナイーブな男性を収集します。一般的には、D.ショウジョウバエの雄は^25℃30℃で羽化後に性的に成熟した8時間になります。ハエは、午前12時12時間の明/暗サイクルの下で維持されている場合は、羽化の二つのピークが予想されています：最初の1〜2時間の間に光をオフにする前に、光が上、そして2時間の間になった後。羽化は蛹暗く後24時間以内に発生します。

（注2）。 10以上の女性SHウルド、過混雑を防止するために同一のバイアルに入れられる。これはまた、それらの少なくとも一つが処女でないので廃棄されなければならない場合には、女性の損失を制限する。

注3。短時間で処女雌と雄ナイーブの適切な数を収集するために、以下の対策を採用することができる。実験的な男性の2つのタイプ（ 表1）を含む実験のために¹¹¹⁸ワットの15〜20バイアルを設定します。軽く媒体の表面を振りかけると産卵を促進するために、いくつかの乾燥アクティブ酵母ペレットを追加します。連続した日に親に少なくとも4回を転送します。両親が別のバイアル（ 図3）に転送された後に各バイアルで蛹化のために利用可能な表面を増加させるために、4 ^回目か5 ^日目の間にマルチ折り畳まれた紙を（7×5センチ）を挿入します。最初の交配から生まれた、大人の人数が十分でない場合、いくつかのより多くの日を待ち、個人を集める別の日に設定するバイアルからALS。ワークロードを均等にするためにいくつかの連続日間の実験を行うことを計画します。

2。ダブル交配実験

図4は ¹⁴で行わダブル交配実験に関わる主な手順を示しています。

1. 1日目の朝、最初の交配を設定します。オレゴン-Rの男性は犯罪アッセイで交尾する最初のです。
   1. 吸引器を使用し、10 4-5日齢の白色目W ¹¹¹⁸処女雌と10赤い目オレゴン-Rナイーブ男性それぞれを含むバイアルを設定します。二から三のバイアルを5日間連続して毎日設定されています。セットアップするバイアルの数は、利用可能な個体数に応じて異なる場合があります。ハエが2時間交尾することができます。
   2. オレゴン-Rの男性を破棄し、吸引器（ 図5）を使用して、新しいバイアルにそれぞれの女性を配置します。雌雄の判別は、少数の目視検査によって達成することができる形態素差（ 図2）。適切に各バイアルにラベルを付け、2日間（以下 "V1"）用バイアルに女性を残す。
2. 3日目に、第二の交尾を設定します。セットアップ男性とクロスの選択は、実験的な男性型のいずれかに向けた潜在的なバイアスを最小化するために、ランダムに行われるべきである。
   1. ライトがオフになっている二時間前に、アスピレーターで新しいバイアルに再びメスを移す。適切に新しいバイアルにラベルを付けます（以下、 "V2"）。
   2. V2に同じ遺伝子型の3 5〜6日齢の実験的な男性を紹介します。
   3. それぞれの女性のための2.2.1と2.2.2を繰り返します。
   4. 二時間右4日目、光がオンされる前（ つまり、2.2.1の後には12以上の時間）で、吸引器を使って男性を捨てる。
3. 6日目に、別の新しいバイアルに再び各女性を転送します。適切に（以下、 "V3"）新しいバイアルにラベルを付けます。
4. 10日目で^、1118ワットを破棄雌（商標）。
5. v2とv3では子孫を調べます。女性はV2の女性最初に起動した産卵後17日目に例えば V2（またはv3）に導入された後の最初の検査は13-15日後に行われます。第2の検査は17日後に正確に実行されます。この時間枠は、同じバイアルには第二世代であることが保証され、安全な上限時間的な境界をもたらす。子孫カウントを促進しつつ二検査が過剰混雑を防ぐ。
   1. 17日目で、V1を検査し、現在の赤い目の子孫が存在することを確認してください。それに応じてバイアルをマークされていない場合。白目子孫の存在はない子孫が参照または実験的な男性とその交配が発生しなかったことを示していないながら、女性が最初の交配時に処女ではなかったことを示しています。
   2. 17日目で、V2の最初の検査を行う。麻酔は、CO ₂とV2に子孫が登場し、目の色や性別によって、それらを並べ替える。最初と秒で父親レコード子孫番号ONDの男性。 図6は、各交配スキームの子孫で予想される表現型を示しています。この特定の実験¹⁴では、基準又は実験によって産ま雄雌の子孫としてのみを明確に割り当てることができるので、唯一の娘からの情報は、P _2を計算するために使用することができる。他のマーカーとの男性の子孫の父親が明確に割り当てることができる場合は、雌雄の子孫の数は下流の計算に用いることができる。子孫を捨てますが、第2の検査のためにv2を保つ。
   3. 20日目に、V2で新たに浮上して子孫と2.5.2のように進み、その後、バイアルを捨てる。
   4. 20日目に、初めてv3では現れ子孫を検査し、ステップ2.5.2に従ってください。
   5. 23日目では、v3では新たに浮上して子孫と2.5.3のように進んでください。

注1：複数の交配が持つかもしれないことをPのスコアに対する潜在膨張効果（2.2.2および2.2.3）のため、交配特定の時間枠に限定することができる。時間枠は使わ女性と男性の遺伝子型に関連付けられているremating周波数に依存します。複数交配の確率は特別に夜の時間¹¹時に削減されます。

注2：大人のハエの数が低いときに、これは酵母の潜在的な異常増殖が原因で問題を引き起こす可能性があるため、生酵母ペレットを追加しないでください。

3。データ解析

1. 録画子孫カウントは、適切な統計パッケージ（SASインスティテュートから例えば JMP）または無料のWebベースのツール（ 例で簡単に目視で効率的な分析のために適切に組織されるべきhttp://vassarstats.net/ ）。
2. 精子競争能力。 v2とv3のからカウントを追加します。ないか非常に限られた子孫（ 例えば <10）に上昇を与えている女性のハエは、手順の間に死亡した、または唯一の成功しinseminaあっ2人の男性の一人テッドは、非有益とみなされており、任意の下流の統計分析（2.5.1及び表2）から除外されます。各有益な女性のためのP ₂得点を計算します。
3. 比べ実験男性の間でP ₂値の統計的に有意な差があるかどうかをテストします。これはパラメトリック（ 例えば TukeyのHSD）またはP ₂値の分布の歪度と分散と平均の間の依存関係など、いくつかの要因に依存してノンパラメトリック（ 例えばスチールDwass）テストを使用して行うことができます。角度変換は、一般にパラメトリック検定³¹の使用に先立って、例えばP ₂などの割合に適用される。
4. 合率の違い（オプション）。各実験オスタイプの場合、二重に交配した雌と、最初の男性（犯罪アッセイにおける参照オスとDの実験の雄と交配するものの数を計算efenseアッセイ）。両側フィッシャーの正確確率検定を（で入手使用http://www.langsrud.com/fisher.htm ）、実験的な男性の2つのタイプの間に統計的に有意な差があるかどうかを判断する。
5. 性比（オプション）。各実験の男性の場合は、予想される1:1の比率から、各女性の外れから子孫の性比かどうかを判断するためにカイ二乗検定を使用しています。

結果

表2は、Dに（アッセイ1及び2）2犯罪の実験のいくつかの顕著な特徴をまとめたもの機能SDICクラスタとと（タイプIおよびII、それぞれ）なしのショウジョウバエの実験男性は^14を比較されます。いくつかの基準にレプリケートで発生する異なる発生率を取った後、雌の58から83パーセントは、有益であることが判明したため、その子孫の父親カウントがP ...

ディスカッション

我々は、遺伝的に異なるの相対的な寄与の違いを評価するために実験的な設計を記載しているD.対照二重交配実験^7,8で子孫にショウジョウバエのオス。これは、精子競争能力に影響を与えると仮定遺伝因子のコンテキスト内で行われたと同様の手順では、防御アッセイ（ 図1）に適用されるが、それはオフェンスアッセイ内に例示されている。この実験計画?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes