Выявление различий в сперме конкурентоспособности на<em&gt; Drosophila</em

Резюме

Дифференциальный спермы конкурентоспособности среди Drosophila Мужчин с различными генотипами может быть установлено через двойную спаривания экспериментов. Каждый из этих экспериментов включает в себя один из самцов интерес и опорный мужчины. Легко идентифицируемые маркеров в потомстве позволяет вывод о доле лиц, родившихся от каждого мужчины.

Аннотация

Конкуренция между конспецифичный мужчин для удобрения яйцеклетки является одним из механизмов полового отбора, т.е. выбор, который работает на максимизации количества успешных событий спаривание, а не на максимизацию выживание и жизнеспособность ^1. Конкуренции спермы представляет конкуренция между мужчинами после совокупляется с тем же сука ^2, в котором их спермой носят случайный характер во времени и пространстве. Это явление было сообщено в нескольких видов растений и животных ^3. Например, пойманных D. MELANOGASTER самки обычно содержат сперму от 2-3 кобелей ^4. Сперма хранится в специализированных органов с ограниченным объемом памяти, которая может привести к прямой конкуренции спермы от разных самцов ^2,5.

Сравнение спермы конкурентоспособности разных самцов интереса (экспериментальные типы мужчин) была выполнена через контролируемом двойном спаривания экспериментальныеTS в лаборатории ^6,7. Короче говоря, одна женщина подвергается воздействию двух разных самцов последовательно, одна экспериментальная мужчина и одна поперечная спаривания ссылкой мужчины. Та же схема спаривания затем следует использовать другие экспериментальные мужской типов облегчая тем самым косвенное сравнение конкурентоспособности их спермы через общий ссылки. Доля лиц, родившихся от экспериментальных и справочных мужчины идентифицируется с использованием маркеров, которая позволяет оценить конкурентоспособность спермы с помощью простых математических выражений ^7,8. Кроме того, сперма конкурентоспособность может быть оценена в двух различных сценариев в зависимости от того экспериментальных самец второй или первый помощник (нападения и защиты анализа, соответственно) ^9, в которой предполагается, что отражает различные атрибуты компетенции.

Здесь мы описываем подход, который помогает допросить роль различных генетических факторов, которые лежат в основе предположительно тОн явление спермы конкурентоспособности в D. MELANOGASTER.

Введение

Так как Джефф Паркер отметил распространенность конкуренции спермы у насекомых и ее эволюционные последствия ^2, всплеск исследований у дрозофилы и других видов пытались пролить свет на это явление на многих различных уровнях. Некоторые примеры областей, представляющих интерес был обзор его изменения в природных популяциях ^9,10, его генетической архитектуры и значимости генетических факторов, лежащих в основе ^11-14, и ее роль в продвижении коэволюции между полами ^15,16. У D. MELANOGASTER женщин, ограниченных возможностей специализированных спермы хранения органов, пара сперматекой и семеприемником ^6,17, способствует конкуренции спермы от разных самцов. Примерно 1500 сперму передаются во время спаривания, чтобы женщины, но только ~ 500 могут быть размещены в указанных органах ^18,19. В лаборатории, контролируемом двойном спаривания экспериментных с участием мужской ссылки и одного или более самцов интерес широко используются для оценки спермы конкурентоспособность ^7,8.

Сперма конкурентоспособность оценивается как доля потомства хряков экспериментальных мужчиной в двойном спаривания эксперименты над общей потомства, то есть как с экспериментальной, и справочные мужчины. Сперма конкурентоспособность включает два компонента, каждый из которых оценивали в отдельном тесте. В нарушение анализа, способность экспериментальной мужской спермы сместить спермы из первых мужчин, т.е. опорный мужчин, оценивается. С другой стороны, в оборонной анализа, способность экспериментальной мужской спермы сопротивляться смещению или уменьшить оплодотворения успех спермы мужской ссылкой оценивается. В зависимости от типа анализа, обороны или правонарушение, сперма конкурентоспособность оценивается путем оценки P ₁ или P ₂ соответственно. P₁ и Р ₂ может принимать значения от 0 до 1. Промежуточные значения, которые обычно трактуются как косвенное свидетельство смешивания спермы, что предполагает физиологические сценария с прямой конкуренции спермы. Следуя той же обоснование, экстремальные значения можно интерпретировать как доказательство сильных дифференциальных спермы конкурентоспособность. Ранние исследования показали, что P ₂ в D. MELANOGASTER составляет более 0,8 растет, так как время, прошедшее между двумя вязки удлиняет ^7. Этот же эксперимента были использованы в других видов Drosophila, Р ₂ является широко используется статистический в исследования для оценки спермы конкурентоспособность ^20. Для большинства видов, P ₂ значений штаммов выше 0,6 ^21. Тем не менее, ряд других механизмов, не связанных с прямой конкуренции между спермой разных самцов могут давать одинаковые оценки (см. обсуждение).

Реопознавательные потомства хряков первого или второго мужчины можно с помощью легко узнаваемых маркеров. В начале исследования, одно из самцов облучали в сублетальных дозах, например, рентгеновские лучи таким образом, что практически все яйца оплодотворенные облученных спермиев не в люк ^7. Впоследствии мутаций, изменяющих пигментации глаз или форму крыла были наиболее часто используемых маркеров. Примерами первого являются мутации м.т. (коричневый) ^9, сп (киноварь) и ²² Вт (белый) ^23, в то время как мутация Су (завитые) ²⁴ соответствует второму типу фенотипы, некоторые из этих мутаций были объединены в же человек, например, CN BW. В меньшей степени, аллозимы ²⁵ и микроспутников ^26,27 с известной модели наследования были также использованы.

Схема эксперимента для проверки на различия всперма конкурентоспособности описанные здесь следует, что по существу Кларка и др.. ^9. Результаты, полученные из этих экспериментов дают информацию только о дифференциальных отцовства экспериментальных типов мужчин в центре внимания. Анализы, которые также делают учет после оплодотворения различия в ^{фитнес-14,28} и спермы методы визуализации ²⁴ включите различия в P ₁ (или P ₂₎ забивает гол должно интерпретироваться как различия в сперме компетенции.

На рисунке 1 приводится обоснование как преступления и обороны анализов. Для иллюстрации логистику процесса, преступление эксперимента, проведенного в D. MELANOGASTER ¹⁴ будет объяснено более подробно. Данный анализ преступления был использован для тестирования для измеримого эффекта мультигенного семейства спермы конкретных динеин промежуточного звена (SDIC) на сперму конкурентоспособность. Все членыс этой мультигенные семьи проживают в тандеме на Х-хромосоме. Нокаут мужчины были получены путем удаления SDIC кластера. Поскольку удален сегмент также включены основного гена коротким крылом (SW) и цель исследования заключалась в оценке актуальности SDIC, самцами, несущими SDIC-SW удаления были спасены трансгенной копией SW (символизируется P {Ю} , которая также проводится мини-белого гена-репортера) на хромосоме 2. Цвет глаз был использован в качестве маркера для видимого отцовства идентификации. Все мухи в белом фоне мутант за исключением тех из штамма, Oregon-R, которые использовались в качестве ссылки мужчин.

протокол

Небольших экспериментов должны быть выполнены, чтобы ознакомиться со всей процедурой.

1. Сбор Девы Женщины и наивные мужчины

Простейший вариант, изложенные эксперимент состоит из четырех типов начальных кресты, которые включают следующую комбинацию взрослых: а) W ¹¹¹⁸ лиц и организаций в целях сбора девственной женщины, б) Oregon-R лиц и организаций в целях сбора наивных мужчин ссылки; C ) P {З} гомозиготных самцов и самок из девственница линии управления, который несет дикого типа организации SDIC для того, чтобы собирать наивных экспериментальных мужчин (тип I) и г) Р {З} гомозиготных самцов и SDIC-SW-удаление несущие Девы женщин с целью сбора экспериментальных наивные мужчины, которые несут SDIC-SW дефицита (тип II).

1. Настройка нескольких флаконов, содержащих 8-10 женщин и 5 мужчин каждый. Разрешить женщин, чтобы заложитьяйца и передать взрослым новые флаконы каждые 3-5 дней. Используйте бутылки, а не флаконы при необходимости и всегда использовать свежие продукты. Количество флаконов, будет зависеть от ряда экспериментальных мужской типов исследуемых и числа лиц, по оценкам, необходимы для определения различий (табл. 1). Более 10 женщин на одного флакона может привести к перенаселенности во время роста личинок, которые могут вызвать изменения в плодородии потомства. Хранить флаконов при температуре 25 ° С в камере с регулируемой температурой.
2. Начните собирать девственной самки и наивные мужчины в дни ^11-й и ^12-й после установки начального кресты. Период ожидания изменяется в зависимости от температуры, ниже температуры приводят к развитию дольше время задержки совокупность индивидов. Другим фактором, влияющим на сроки вылупления это тип среды. Питательной пищи, такие как кукурузная мука-дрожжевой среде ^29, обеспечивает правильное развитие взрослыхрепродуктивной системы, что облегчает спаривания. Сбор Разъединенные летит каждые 4-6 часа. При сборе, обезболить мух путем введения CO ₂ во флакон, нажмите слетает, и секс их под стереомикроскоп (рис. 2). Поместите необходимое мух в различных флаконах по полу и фенотипа и этикетке флакона соответствующим образом.

Примечание 1. Регулярный сбор начинается утром путем отбрасывания взрослых, которые возникли в течение предыдущей ночи. Сбор девственной самки и наивные мужчины один или два раза в течение дня. Как правило, D. MELANOGASTER самцы становятся половозрелыми 8 часов после вылупления при 25 ° C ^30. Если мух выдерживают в 12:12 ч света / темноты циклов, два пика вылупления ожидается: в первые 1-2 часов после того, как свет включен, и в течение 2 часов, прежде чем свет выключен. Eclosion происходит в течение 24 часов после того, как куколку темнеет.

Примечание 2. Не более 10 женщин SHУльд быть введены в том же флаконе для предотвращения чрезмерной скученности. Это также ограничивает потерей женщин в случае, если они должны быть отброшены, потому что по крайней мере один из них не является девственницей.

Примечание 3. Для того чтобы собрать необходимое количество женщин целинных и наивные мужчины в течение короткого периода времени, следующие меры могут быть приняты. Установка 15-20 флаконов ж ¹¹¹⁸ для экспериментов с участием двух типов экспериментальных самцов (табл. 1). Слегка посыпать поверхность средствами массовой информации и добавить несколько сушеных дрожжей активных гранул для облегчения яйцекладки. Передача родителей по крайней мере 4 раза в последующие дни. Для увеличения свободного поверхность для окукливания в каждом флаконе, вставьте несколько сложенной бумаги (7 х 5 см) в течение ^4-й или ^5-й день после родителей передаются в другой флакон (рис. 3). Если количество появились взрослых от начального крестов не хватает, ждать еще несколько дней и собирают индивидуальноАЛС из флаконов созданы в разное время. Планируют провести эксперименты на протяжении нескольких дней подряд, чтобы выровнять нагрузку.

2. Дважды спаривания Эксперименты

На рисунке 4 показаны основные шаги в двойной игре спаривания эксперименты, проведенные в ^14.

1. Утром 1-го дня, создал первые спаривания. Oregon-R мужчин в первую очередь мат в преступлении анализа.
   1. Использование аспиратора, созданы 10 флаконов, содержащих 4-5-дневных белоглазых W ¹¹¹⁸ целинных и женщин 10 красными глазами Oregon-R наивных мужчин каждый. От двух до трех флаконов создана в день в течение 5 дней подряд. Количество флаконов, которая будет создана могут отличаться в зависимости от количества доступных физических лиц. Разрешить мухи спариваются в течение 2 часов.
   2. Откажитесь Oregon-R мужчин и разместить каждую самку в новый флакон использованием аспиратора (рис. 5). Пол идентификации может быть достигнуто путем визуального осмотра несколькоморфологические различия (рис. 2). На каждом флаконе надлежащим образом и оставляют женщин во флаконе в течение 2 дней (в дальнейшем «V1»).
2. На 3 день создана вторая спаривания. Выбор мужчин и поперечных создан следует проводить при случайном чтобы свести к минимуму любые потенциальные уклон в сторону любого из экспериментальных мужской типов.
   1. За два часа до выключения света, перенос заново женского в новый флакон с аспиратором. Маркировку нового флакона соответствующим (далее "V2").
   2. Введем три 5-6-дневных экспериментальных самцов того же генотипа в v2.
   3. Повторите 2.2.1 и 2.2.2 для каждой женщины.
   4. На 4-й день, два часа прямо перед свет включен (то есть не более 12 ч после 2.2.1), отбросить мужчин с помощью аспиратора.
3. На 6 день передачи каждая самка снова в другой новый флакон. Маркировку нового флакона соответствующим (далее "V3").
4. На 10 день, отказаться от W ¹¹¹⁸ суки.
5. Изучите потомства в V2 и V3. Первый осмотр проводится после 13-15 дней после женского вводится в v2 (или V3), например, на 17 день после того, как женщина впервые начал откладывающих яйца в v2. Вторая проверка проводится ровно через 17 дней. Эти сроки создает безопасный верхний временной границе, что гарантирует отсутствие второго поколения в том же флаконе. Инспекциями второго предотвращения перенаселенности, облегчая потомства счета.
   1. На 17 день, проверять v1 и убедиться, что есть красные глаза потомства настоящее время; если не метка флакон соответственно. Наличие белоглазых потомства указывается, что женщинам не было девственной во время начального спаривания пока нет потомства не указывает, что спаривание со ссылкой или экспериментальной мужчины не произошло.
   2. На 17 день, выполните первый инспекция v2. Anesthetize появилось потомство в v2 с CO ₂ и сортировать их по цвету глаз и сексе. Запись потомство номера родившихся от первого и вторОНД мужчин. На рисунке 6 показан ожидаемый фенотипов в потомстве каждого спаривания схеме. В данном эксперименте ^14, только женский потомство может быть однозначно назначается в качестве желаемого путем ссылки или экспериментальных мужчин и, следовательно, только информация от дочери могут быть использованы для вычисления P _2. Если с другими маркерами отцовства мужское потомство может быть однозначно назначен, считается потомство обоих полов могут быть использованы в последующих расчетах. Откажитесь от потомства, но держать v2 для второй проверки.
   3. На 20 день, дальше как в 2.5.2 с вновь возникшим в потомстве v2, а затем отказаться от флакона.
   4. На 20 день, осмотрите потомство появилось в версии 3 в первый раз и следовать шаг 2.5.2.
   5. В День 23, действуйте в п. 2.5.3 с вновь возникшим в потомстве v3.

Примечание 1: В связи с потенциальной раздувания влияние на оценки P, что несколько спаривания может иметь (2.2.2 и 2.2.3), спариваниеможет быть ограничена конкретного периода времени. Сроки будут зависеть от remating частота, связанная с генотипом самки и мужчины использовали. Вероятность спаривания несколько специально уменьшена в ночное время ^11.

Примечание 2: Не следует добавлять живые дрожжи гранул, поскольку это может вызвать проблемы из-за возможного чрезмерного роста дрожжей, когда количество взрослых мух является низким.

3. Анализ данных

1. Записанные рассчитывает потомства должна быть организована соответствующим образом для легкого визуального осмотра и эффективный анализ с подходящей статистического пакета (например, JMP от SAS Institute) или бесплатный веб-инструменты (например http://vassarstats.net/ ).
2. Сперма конкурентоспособность. Добавить насчитывает от V2 и V3. Женский мух, которые породили нет или очень ограниченное потомство (например, <10), умер во время процедуры, или были только успешно inseminaTed одним из двух самцов рассматриваются как неинформативные и исключаются из любой вниз по течению статистический анализ (2.5.1 и таблица 2). Вычислить P ₂ балла за каждое информативно женщины.
3. Проверьте, есть ли статистически значимых различий в значениях P ₂ среди мужчин по сравнению экспериментальных. Это может быть сделано с использованием параметрических (например HSD Тьюки) или непараметрические (например, сталь-Dwass) тестов в зависимости от нескольких факторов, включая асимметрии распределения значений P ₂ и зависимость между дисперсией и средним. Углового преобразования обычно применяется к пропорции, такие как P ₂ до использования тестов параметрического ^31.
4. Спаривание курсовой разницы (опция). Для каждой экспериментальной мужской тип, рассчитать количество вдвойне повязана женщин и те, которые только повязана с первым мужчиной (ссылка мужчин в совершении преступления и анализа экспериментальных мужчиной в Defense анализа). Используя двусторонний точный критерий Фишера (продается в http://www.langsrud.com/fisher.htm ), определить, есть ли статистически значимые различия между этими двумя типами экспериментальных мужчины.
5. Соотношение полов (опционально). Для каждой экспериментальной мужчин, используйте критерий хи-квадрат, чтобы определить, является ли соотношение полов в потомстве от каждой самки отклоняется от ожидаемого соотношении 1:1.

Результаты

В таблице 2 приведены некоторые характерные черты двух экспериментах преступления (Анализы 1 и 2), в котором Д. MELANOGASTER экспериментальных мужчин с и без (тип I и II, соответственно) SDIC функциональных кластеров сравниваются ^14. Приняв во внимание различным уровням сто?...

Обсуждение

Мы описали эксперимента для оценки различий в относительном вкладе генетически различных D. MELANOGASTER мужчин к потомству в контролируемом двойном спаривания эксперименты ^7,8. Это было сделано в контексте генетического фактора предположили влиять на сперму конкурентоспособнос...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes