הבדלי שומה ביכולת תחרותית בזרע<em&gt; דרוזופילה</em

Summary

יכולת התחרותית ההפרש בין זרע דרוזופילה גברים עם גנוטיפים שונים ניתן לקביעה באמצעות ניסויים כפולי הזדווגות. כל אחד מניסויים אלו כרוך אחד הזכרים של עניין והתייחסות גברית. סמנים לזיהוי בקלות בצאצאים לאפשר היסק של חלק קטן מאנשי אביהם היה כל זכר.

Abstract

תחרות בין הזכרים conspecific לדישון הביציות היא אחד מהמנגנונים של ברירה מינית, כלומר בחירה שפועלת למקסם את מספר אירועי הזדווגות המצליחים ולא על הישרדות וכדאיות ¹ מרחיבה את עוצמה. תחרות זרע מייצגת את התחרות בין זכרים לאחר הזדווגות עימו ² הנקבה, שבזרע שלהם הם מקריים בזמן ובמרחב. תופעה זו כבר דווחה במינים רבים של צמחים ובעלי חיים ^3. לדוגמה, שנלכד בטבע ד ' נקבות melanogaster מכילות בדרך כלל זרע 2-3 זכרים ^4. הזרע מאוחסנים באיברים מיוחדים עם קיבולת אחסון מוגבלת, אשר עלול להוביל לתחרות הישירה של הזרע מזכרים שונים ^2,5.

השוואה בין היכולת התחרותית זרע של זכרים שונים של עניין (סוגים ניסיוניים גברים) שבוצע באמצעות ניסיוני כפולת הזדווגות מבוקרתTS במעבדה ^6,7. בקצרה, נקבה אחת חשופה לשני זכרים שונים ברצף, גברים ניסיוניים אחד ואחת ממין זכר התייחסות צולבת הזדווגות. אותו ערכת ההזדווגות לאחר מכן ואחרי השימוש בסוגי גברים ניסיוניים אחרים וכך להקל על ההשוואה העקיפה של היכולת התחרותית של הזרע שלהם באמצעות התייחסות משותפת. חלק קטן מאנשי אביהם היו הזכרים הניסיוניים והתייחסות מזוהה באמצעות סמנים, המאפשר אחד כדי להעריך את היכולת התחרותית זרע באמצעות ביטויים מתמטיים פשוטים ^7,8. בנוסף, ניתן להעריך את היכולת התחרותית זרע בשני תרחישים שונים, תלויים אם הזכר הניסיוני הוא שני או ראשון להזדווג (עבירה וassay הגנה, בהתאמה) ^9, שהנחה הוא שהוא משקף את יכולת תכונות שונות.

כאן, אנו מתארים את הגישה שעוזרת לחקור את תפקידם של גורמים גנטיים שונים שעומדים בבסיס לא putativelyהוא התופעה של כושר תחרות זרע בד melanogaster.

Introduction

מאז ג'ף פרקר ציין השכיחות של תחרות זרע בחרקים והשלכותיה אבולוציוניים ^2, גל של מחקרים בדרוזופילה ומינים אחרים ניסה לשפוך קצת אור על תופעה זו ברמות רבות ושונות. כמה דוגמאות לתחומי העניין היו הסקר של הווריאציה שלה באוכלוסיות טבעיות ^9,10, הארכיטקטורה ורלוונטי של גורמים גנטיים שבסיס הגנטי שלה ^11-14, ותפקידה בנהיגת אבולוציה משותף בין המינים ^15,16. בד melanogaster נקבות, הקיבולת המוגבלת של איברי זרע האחסון מיוחדים, זוג spermatheca וקיבול זרע ^6,17, תורם לתחרות של הזרע מזכרים שונים. כ -1,500 זרע מועבר במהלך הזדווגות לנקבה אבל רק ~ 500 ניתן לאכלס באיברים שהוזכרו ^18,19. במעבדה, מבוקרת כפולה הזדווגות ההתנסותments מעורב זכר התייחסות ואחד או יותר מזכרים של עניין נעשה שימוש נרחב להערכת יכולת ^7,8 זרע תחרותית.

יכולת התחרותית זרע הערכה היא כמו היחס של צאצאים הוליד על ידי הזכר הניסיוני בניסויים כפול הזדווגות על הצאצאים המוחלט, כלומר, שגם מניסיוני והתייחסות לזכרים. יכולת התחרותית זרע מורכב משני מרכיבים, שכל אחד מהם הוערך בassay נפרד. ב assay העבירה, ביכולתו של הזרע הגברי הניסיוני כדי לעקור את הזרע מהזכר הראשון, כלומר ההתייחסות הגברית, מוערכת. לעומת זאת, בassay ההגנה, יכולתו של הזרע הגברי הניסיוני להתנגד עקירה או להפחית את ההצלחה ההפריה של הזרע גברי ההתייחסות מוערכת. בהתאם לסוג של assay, הגנה או התקפה, יכולת התחרותית זרע הערכה היא דרך עשרות P ₁ או ₂ P, בהתאמה. P₁ ו-P ₂ יכול לקחת ערכים בין 0 ו -1 בלבד. ערכי ביניים בדרך כלל מתפרשים כראיות עקיפות של זרע ערבוב, אשר טוען תרחיש פיסיולוגי מעורב תחרות זרע ישירה. בעקבות אותו הרציונל, ניתן לפרש את ערכים קיצוניים כהוכחה ליכולת התחרותית זרע ההפרש חזקה. מחקרים מוקדמים הראו כי P ₂ בד melanogaster הוא מעל 0.8 הגדלת כמו הזמן שחלף בין שתי ההזדווגויות מאריכות ^7. אותו עיצוב ניסיוני זה כבר נעשה שימוש במינים תסיסנית אחרים, P ₂ להיות נתון נפוץ במחקרים כדי להעריך את יכולת זרע ²⁰ התחרותית. עבור רוב המינים, את ₂ ערכי P של הזנים שנבדקו הוא גבוהים יותר מאשר 0.6 ^21. עם זאת, מספר מנגנונים אחרים שאינם קשורים לתחרות הישירה בין הזרע של זכרים שונים יכולים להניב תוצאות זהות (ראה דיון).

Dצאצאי istinguishing הוליד ידי הזכרים הראשונים או שני אפשרי באמצעות שימוש בסמני זיהוי בקלות. במחקרים מוקדמים, אחד מהזכרים היה מוקרן במינונים sublethal של, למשל, קרני ה-X כך שכמעט כל הביציות מופרות על ידי זרע מוקרן לא הצליחה לבקוע ^7. בהמשך, מוטציות משינוי פיגמנטציה עין או צורת כנף היו הסמנים הנפוצים ביותר. דוגמאות ללשעבר הן מוטציות BW (חום) ^9, cn (כינאבאר) ²² ו w (לבן) ^23, ואילו את המוטציה (קרלי) ²⁴ מקבילה Cy לסוג השני של פנוטיפים, כאשר חלק ממוטציות אלו כבר משולבים ב אותו אדם, למשל CN BW. במידה פחותה יותר, היו בשימוש allozymes ²⁵ ומייקרו ^26,27 עם דפוסי ירושה ידועים גם בשם.

תכנון הניסוי לבדיקת הבדלים בהיכולת התחרותית זרע שתוארה כאן נובע למעשה זה של קלארק ואח'. ^9. תוצאות ניסויים אלה נגזרים מלתת מידע אך ורק על אבהות ההפרש של סוגי הגברים הניסיוניים תחת בדיקה. מבחני שגם הופכים את ההפרשה להבדלים לאחר הפריה בכושר ^14,28 וטכניקות להדמיה זרע ²⁴ לאפשר הבדלים _ב1 P (או P ₂₎ ציונים להתפרש כהבדלים ביכולת זרע.

איור 1 מתאר את הרציונל של שניהם עבירה והמבחנים הבטחוני. כדי להמחיש את הלוגיסטיקה של התהליך, ניסוי בוצע בעבירת ד melanogaster ¹⁴ שיוסבר בפירוט. assay עבירה מסוים זה משמש לבדיקת השפעה מדידה של שרשרת multigene משפחת הזרע הספציפית dynein ביניים (SDIC) על יכולת התחרותית זרע. כל חברים של משפחת multigene זה מתגורר במקביל על כרומוזום X. הזכרים נוקאאוט נוצרו על ידי מחיקת אשכול SDIC. בגלל הקטע שנמחק כלל גם זרוע הקצרה הגן החיוני (SW) ומטרתו של המחקר הייתה להעריך את הרלוונטיות של SDIC, גברים שנשאו את מחיקת SDIC-SW חולצו על ידי עותק מהונדס של SW (סמלה כP {SW} , שגם נשא את גן כתב מיני לבן) בכרומוזום 2. צבע עיניים שימש כסמן גלוי לזיהוי אבהות. כל הזבובים היו ברקע לבן עם מוטציה למעט אלה מזן אורגון-R, אשר שמשו כזכרי התייחסות.

Protocol

ניסויים בקנה מידה קטנה צריכים להתבצע כדי להכיר את ההליך כולו.

1. איסוף נקבות וזכרי בתולה נאיביים

הגרסה הפשוטה של הניסוי שתואר מורכבת מארבעה סוגים של צלבים ראשוניים, אשר כרוך השילוב הבא של מבוגרים: א) יחידים w ¹¹¹⁸ על מנת לאסוף נקבות בתולה, ב) יחידים אורגון-R כדי לאסוף זכרים התייחסות נאיביים; ג ) P {} SW זכרים ונקבות הומוזיגוטים בתולה מפס בקרה שמבצע ארגון פראי הסוג של SDIC כדי לאסוף זכרים ניסיוניים נאיביים (סוג I); ו-D) P {} SW זכרים הומוזיגוטים וSDIC-SW-מחיקה נשיאת נקבות בתולה כדי לאסוף זכרים ניסיוניים נאיביים הנושאים את מחסור SDIC-SW (סוג II).

1. הגדר את בקבוקונים המכילים מספר רב של 8-10 נקבות וזכרים 5 כל אחד. לאפשר לנקבות להטיל אתביצים ולהעביר את המבוגרים לבקבוקונים חדשים בכל 3-5 ימים. להשתמש בבקבוקים ולא בבקבוקונים במידת צורך, ותמיד להשתמש במזון טרי. מספר הבקבוקונים הנדרשים יהיה תלוי במספר סוגי גברים ניסיוניים תחת מחקר ואת מספר האנשים העריכו שצריכה כדי לזהות הבדלים (טבלת 1). יותר מ -10 נשים בכל בקבוקון עלולות לגרום לצפיפות יתר במהלך צמיחת הזחל, שעלול לגרום לשינוי בפוריות של הצאצאים. בקבוקונים לאחסן ב -25 ° C בתא בטמפרטורה מבוקר.
2. להתחיל לאסוף נקבות וזכרי בתולה נאיביות בימים ^ה 11 ^וה 12 לאחר ההגדרה הראשוניים הצלבים. תקופת המתנה משתנה בהתאם לטמפרטורה, תוצאת טמפרטורות נמוכה יותר בזמן ארוך יותר עיכוב התפתחותי האוסף של יחידים. גורם נוסף המשפיע על העיתוי לeclosion הוא הסוג של מדיום. אוכל מזין, כגון קמח תירס, שמרים בינוניים ^29, מבטיח התפתחות תקינה של המבוגרמערכת רבייה, המאפשרת הזדווגות. אסוף מבלי שהזדווגו לפני עף כל 4-6 שעות. בעת איסוף, להרדים זבובים על ידי החדרת CO ₂ לתוך הבקבוקון, הקש על הזבובים למטה, ומינם תחת stereomicroscope (איור 2). מניחים את הזבובים הרצויים לתוך צלוחיות שונות לפי מין ופנוטיפ ותווית את הבקבוקונים כראוי.

שים לב 1. שגרת אוסף מתחילה בבוקר על ידי השלכת את המבוגרים שצצו במהלך הלילה הקודם. לאסוף נקבות וזכרי בתולה נאיביים פעם או פעמיים במהלך היום. בדרך כלל, ד ' זכרים melanogaster להיות 8 שעות לבגרות מינית אחרי eclosion של 25 מעלות צלזיוס ^30. אם זבובים נשמרים תחת מחזורי אור / חושך הפועל 12:12, שתי פסגות של eclosion צפויות: במהלך 1-2 שעות הראשונה לאחר שהאור דולק, ובמהלך שעות 2 לפני שהאור כבוי. Eclosion מתרחש בתוך 24 שעות לאחר מכהת הגולם.

שימו לב 2. לא יותר מ 10 נקבות shולד יהיה להכניס אותו הבקבוקון כדי למנוע צפיפות יתר. זה גם מגביל את ההפסד של נקבות במקרה שיש להם להיות מושלכים, כי לפחות אחד מהם הוא לא בתולה.

הערה 3. על מנת לאסוף את המספר המתאים של נקבות וזכרי בתולה תמים בפרק זמן קצר, אפשר לאמץ את הצעדים הבאים. הגדר את הבקבוקונים של 15-20 W ¹¹¹⁸ לניסויים מעורבים שני סוגים של גברים ניסיוניים (טבלת 1). קל ומפזרים את פני השטח של כלי התקשורת ולהוסיף כמה כדורי שמרים פעילים יבשים כדי להקל על ההטלה. העבר את ההורים לפחות 4 פעמים ביום ברציפות. כדי להגדיל את השטח זמין להתגלמות בכל בקבוקון, הכנס נייר מקופל רב (7 ס"מ X 5) ביום ^{ה -4} או 5 לאחר שההורים מועברים לתוך בקבוקון נוסף (איור 3). אם מספר המבוגרים עלו מהצלבים ראשוני זה לא מספיק, תחכה לעוד כמה ימים ולאסוף individuALS מבקבוקונים להגדיר בתאריכים שונים. מתכנן לבצע את הניסויים על פני כמה ימים רצופים כדי לאזן את עומס העבודה.

2. ניסויים כפולי הזדווגות

איור 4 מציג את השלבים העיקריים מעורבים בניסויים כפול הזדווגות שבוצעו ^ב14.

1. בבוקרו של יום 1, להגדיר את ההזדווגות הראשונה. הזכרים אורגון-R הם הראשון להזדווג בassay העבירה.
   1. שימוש aspirator, להגדיר בקבוקונים המכילים 10 נקבות 4-5-בני יומם לבנים עיני w ¹¹¹⁸ בתולה וכל אחד מהם 10 גברים נאיביים אדומי עיניים אורגון-R. שנים עד שלושה בקבוקונים מוגדרים ביום למשך 5 ימים רצופים. מספר הבקבוקונים שיוקמו עשוי להשתנות בהתאם למספר אנשים זמינים. לאפשר לזבובים להזדווג במשך שעה 2.
   2. בטל זכרים אורגון-R ולמקם כל נקבה לתוך בקבוקון חדש באמצעות aspirator (איור 5). זיהוי מין יכול להיות מושגת על ידי בדיקה ויזואלית של כמההבדלים מורפולוגיים (איור 2). תווית בקבוקון אחד כראוי ולהשאיר את הנקבה בבקבוקון ל2 ימים (להלן "V1").
2. ביום 3, להגדיר את הזיווג השני. בחירה של זכרים ולחצות להגדיר צריכה להתבצע באופן אקראי על מנת לצמצם הטיות אפשריות כלפי כל אחד מסוגי הניסויים ממין זכר.
   1. שעתיים לפני שהאור כבוי, להעביר שוב את הנקבה לתוך בקבוקון חדש עם aspirator. תווית הבקבוקון החדש כראוי (להלן "V2").
   2. להציג את שלושה זכרים ניסיוניים 5-6 ימים בת של אותו גנוטיפ לv2.
   3. חזור על 2.2.1 ו2.2.2 עבור כל אישה.
   4. ביום 4, שתי שעות נכונה לפני שהאור דולקת זכרים (כלומר לא יותר מ -12 שעות לאחר 2.2.1), להשליך על ידי השימוש בaspirator.
3. ביום 6, להעביר כל נקבה שוב לתוך בקבוקון חדש אחר. לתייג את הבקבוקונים החדשים כראוי (להלן "V3").
4. ביום 10, לבטל את ¹¹¹⁸ w נקבות.
5. לבחון את progenies בV2 וV3. הבדיקה הראשונה מתבצעת לאחר 13-15 ימים לאחר הנשי מוחדר v2 (או v3), למשל ביום 17 לאחר ovipositing הראשון התחיל הנשי בv2. הבדיקה השנייה מבוצעת בדיוק לאחר 17 ימים. מסגרת זמן זה מציב גבול עליון בטוח זמני שמבטיח לא דור שני באותו הבקבוקון. שתי בדיקות למנוע צפיפות יתר תוך הקלת ספירת צאצאים.
   1. ביום 17, לבדוק V1 ולהבטיח כי יש צאצאים אדומים עיני הווה, אם לא יציין את הבקבוקון בהתאם. נוכחות של צאצאים לבנים עיניים מצביעה על כך שהנשים לא היו בתולה בעת ההזדווגות ראשונית בעוד שאף צאצאים מציין כי הזדווגות עם ההפניה או הזכרים הניסיוניים לא התרחש.
   2. ביום 17, לבצע את הבדיקה הראשונה של V2. הרדם יצא צאצאים בV2 עם CO ₂ ולמיין אותם לפי צבע עיניים ומין. מספרי שיא צאצאי אביהם הראשון והשנייהזכרים ond. איור 6 מציג את פנוטיפים הצפויים בצאצאים של כל ערכת הזדווגות. ^ב14 ניסוי המסוים הזה, רק נקבת צאצאים ניתן להקצות באופן חד משמעי כהולידו על ידי ההפניה או הזכרים הניסיוניים ולכן רק את המידע מבנות יכול לשמש כדי לחשב P _2. אם עם סמנים אחרים האבהות של צאצאי זכרים ניתן להקצות באופן חד משמעי, ספירת צאצאים של שני המינים ניתן להשתמש בחישובים במורד הזרם. מחק את הצאצאים אבל לשמור v2 לבדיקה שנייה.
   3. ביום 20, פעל כב2.5.2 עם הצאצאים יצאו זה עתה בV2 ואז להשליך את הבקבוקון.
   4. ביום 20, לבדוק את הצאצאים יצאו בV3 בפעם הראשונה ובצע את השלב 2.5.2.
   5. ביום 23, פעל כב2.5.3 עם הצאצאים יצאו זה עתה בV3.

הערה 1: בשל השפעה פוטנציאלי ניפוח על ציוני P שהזדווגות מרובה אולי יש לי (2.2.2 ו2.2.3), הזדווגותיכול להיות מוגבל למסגרת זמן מסוימת. מסגרת הזמן תהיה תלויה בתדירות remating קשורה לגנוטיפ של הנקבה והזכרים בשימוש. ההסתברות להזדווגות מרובה מצטמצמת במיוחד במהלך הלילה ¹¹ פעם.

הערה 2: אל תוסיף כדורי שמרים חיים, כי זה עלול לגרום לבעיות עקב צמיחת יתר של שמרי פוטנציאל כאשר מספר הזבובים הבוגרים הוא נמוך.

3. ניתוח נתונים

1. ספירת צאצאי הקלטות צריכה להיות מאורגנת כראוי לבדיקה ויזואלית קלה וניתוח יעיל עם חבילה סטטיסטית מתאימה (למשל JMP ממכון SAS) או כלים מבוססי אינטרנט בחינם (לדוגמא http://vassarstats.net/).
2. יכולת התחרותית זרע. הוסף ספירות ומv2 v3. זבובים ממין נקבה שעוררו לא מוגבלים מאוד או צאצאים (למשל <10), נפטרו במהלך ההליך, או שהיו רק בהצלחה inseminaטד על ידי אחד משני הגברים נחשבים לבלתי אינפורמטיבי ואינם נכלל בכל ניתוח סטטיסטי במורד הזרם (2.5.1 וטבלה 2). לחשב את ציון P ₂ עבור כל נקבה אינפורמטיבי.
3. לבחון האם קיימים הבדלים מובהקים סטטיסטי בערכי P ₂ בקרב הגברים בהשוואה הניסיוניים. ניתן לעשות זאת באמצעות פרמטרים (HSD של טיוקי למשל) או שאינן פרמטריים בדיקות (למשל פלדה Dwass) בהתאם למספר גורמים, כולל הטיה של התפלגות ערכי P ₂ ותלות בין השונות ואת הממוצע. השינוי זוויתי מיושם בדרך כלל לממדים כגון P ₂ לפני השימוש במבחנים פרמטריים ^31.
4. הפרשי שער מזווגים (אופציונלי). לכל סוג זכר ניסיוני, לחשב את מספר נקבות הזדווגו כפליים ואלה שהזדווגו רק עם הזכר הראשון (זכר ההתייחסות בassay העבירה והגברי הניסיוניים בדassay efense). באמצעות בדיקה המדויקת של פישר שני זנב (זמין בhttp://www.langsrud.com/fisher.htm), לקבוע אם קיימים הבדלים משמעותיים סטטיסטי בין שני הסוגים של גברים ניסיוניים.
5. יחס מינים (אופציונלי). לכל זכר ניסיוני, השתמש במבחן צ'י המרובע כדי לקבוע אם יחס מינים בצאצאים מכל נקבה סוטה מ1:1 הצפוי.

תוצאות

טבלה 2 מסכמת כמה מאפיינים בולטים של שני ניסויי עבירה (מבחני 1 ו -2) שבו ד זכרים ניסיוניים melanogaster עם ובלי (סוג I ו-II, בהתאמה) אשכול SDIC תפקודי הם בהשוואה ^14. לאחר שלקח בחשבון מקרים שונים בהם נתקל עם כמה חזרות, 58-83% מהנשים נמצאו להיות אינפורמטיבי ול?...

Discussion

יש לנו תאר את עיצוב הניסיון להעריך הבדלים בתרומה היחסית של גנטי מובחן ד זכרים melanogaster לצאצאים בניסויים כפול ^7,8 הזדווגות מבוקרות. זה נעשה בהקשר של גורם גנטי שערנו להשפיע על יכולת התחרותית זרע וזה כבר מאויר בתוך assay העבירה למרות שהליך דומה חל על assay ההגנה <...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes