Avaliar as diferenças na capacidade competitiva do esperma em<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Diferencial esperma capacidade competitiva entre Drosophila Homens com genótipos diferentes pode ser verificada através de experimentos double-acasalamento. Cada uma dessas experiências envolve um dos homens de interesse e um homem de referência. Marcadores facilmente identificáveis ​​na progênie permitem inferir da fração de indivíduos filhas de cada macho.

Resumo

A competição entre os machos conspecíficas para fertilizar os óvulos é um dos mecanismos de selecção sexual, isto é, selecção que opera sobre a maximização do número de eventos de acasalamento bem-sucedido em vez de maximizar a sobrevivência e viabilidade ^1. Competição do esperma representa a competição entre os machos depois da cópula com a mesma fêmea ^2, no qual o esperma são coincidentes no tempo e no espaço. Este fenómeno tem sido relatada em diversas espécies de animais e plantas ^3. Por exemplo, selvagens capturados D. fêmeas melanogaster geralmente contêm esperma 2-3 ⁴ machos. Os espermatozóides são armazenados em órgãos especializados, com capacidade de armazenamento limitada, o que pode levar à concorrência directa do esperma de diferentes homens ^2,5.

Comparando esperma capacidade competitiva de machos diferentes de interesse (tipos masculinos experimentais) foi realizada por meio de experimentação controlada double-acasalamentots no laboratório ^6,7. Resumidamente, uma única fêmea está exposto a dois machos diferentes consecutivamente, um macho experimental e uma referência masculina cross-acasalamento. O mesmo esquema de cruzamento é seguida usando outros tipos masculinos experimentais, facilitando assim a comparação indireta da capacidade competitiva de seu esperma através de uma referência comum. A fração de indivíduos filhas de os experimentais e de referência do sexo masculino é identificado por meio de marcadores, o que permite estimar a capacidade competitiva de espermatozóides usando expressões matemáticas simples ^7,8. Além disso, a capacidade competitiva do esperma pode ser estimado em dois cenários diferentes dependendo se o macho experimental é o segundo ou primeiro a mate (ataque e defesa ensaio, respectivamente) ^9, que se supõe ser o reflexo de diferentes atributos de competência.

Aqui, descrevemos uma abordagem que ajuda a interrogar o papel dos diferentes fatores genéticos que supostamente sustentam tele fenômeno da capacidade competitiva do esperma em D. melanogaster.

Introdução

Desde Geoff Parker observou a prevalência de competição do esperma nos insetos e suas implicações evolucionárias ^2, uma onda de estudos em Drosophila e outras espécies têm tentado lançar alguma luz sobre este fenômeno em muitos níveis diferentes. Alguns exemplos de áreas de interesse foram o levantamento de sua variação em populações naturais ^9,10, sua arquitetura genética e relevância de fatores genéticos subjacentes ^11-14, e seu papel na condução de co-evolução entre os sexos ^15,16. Em D. melanogaster fêmeas, a capacidade limitada dos órgãos de armazenamento de esperma especializados, um par de espermateca e receptáculo seminal ^6,17, contribui para a competição do esperma de diferentes homens. Aproximadamente 1.500 esperma são transferidos durante o acasalamento à fêmea, mas apenas ~ 500 podem ser acomodados nos órgãos referidos ^18,19. No laboratório, controlada acasalamento dupla experimentos envolvendo um homem de referência e um ou mais machos de juros têm sido amplamente utilizados para avaliar a capacidade competitiva do esperma ^7,8.

A capacidade competitiva de esperma é estimada como a percentagem de crias desejado pelo macho experimental nas experiências de acasalamento-duplo ao longo da descendência total, ou seja, que tanto do sexo masculino de referência e experimental. A capacidade competitiva de esperma compreende dois componentes, cada um deles avaliada num ensaio separado. No ensaio de ataque, a capacidade do esperma do homem experimental para deslocar o esperma do primeiro macho, ou seja, o macho de referência, é avaliada. Por outro lado, no ensaio de defesa, a capacidade do esperma do homem experimental para resistir deslocamento ou para reduzir o sucesso da fertilização do espermatozóide referência é avaliada. Dependendo do tipo de ensaio, a defesa ou ofensa, capacidade competitiva de esperma é estimado através dos pontos P ₁ ou P _2, respectivamente. P₁ e P ₂ só pode assumir valores entre 0 e 1. Os valores intermediários são geralmente interpretados como evidência indireta de esperma de mistura, o que sugere um cenário fisiológico que envolve a competição do esperma direto. Seguindo o mesmo raciocínio, valores extremos pode ser interpretado como evidência de forte diferencial esperma capacidade competitiva. Estudos anteriores mostraram que a P ₂ em D. melanogaster é acima de 0,8, como o aumento do tempo decorrido entre os dois cruzamentos prolonga ^7. Este mesmo modelo experimental foi usado em outras espécies de Drosophila, P ₂ ser a estatística utilizada em estudos para avaliar a capacidade competitiva de esperma ^20. Para a maioria das espécies, os valores das _duas estirpes testadas P é superior a 0,6 ^21. No entanto, vários outros mecanismos não relacionados à concorrência directa entre espermatozóides de diferentes machos podem produzir notas idênticas (ver discussão).

Dprogenitura istinguishing desejado pelos primeiros ou segundos machos é possível através do uso de marcadores facilmente identificáveis. Em estudos iniciais, um dos machos foi irradiada com doses subletais de, por exemplo, raios X, que praticamente todos os óvulos fertilizados por esperma irradiado não eclodiram ^7. Posteriormente, as mutações que alteram a pigmentação dos olhos ou forma de asa foram os marcadores mais usados. Os exemplos do anterior são as mutações pv (castanho) ^9, CN (cinábrio) e ²² W (branco) ^23, enquanto que a mutação CY (encaracolado) ²⁴ corresponde ao segundo tipo de fenótipos, alguns destas mutações foram combinadas no mesmo indivíduo, por exemplo, cn bw. Em menor medida, isoenzimas ²⁵ e ^26,27 microssatélites com padrões de herança conhecidos também têm sido utilizados.

O delineamento experimental para testar as diferenças decapacidade competitiva esperma descrito aqui segue essencialmente o de Clark et al. ^9. Os resultados obtidos a partir desses experimentos dar informações apenas sobre a paternidade diferencial dos tipos masculinos experimentais sob escrutínio. Ensaios que também fazem provisão para diferenças pós-fertilização na aptidão ^14,28 e técnicas de visualização de esperma ²⁴ permitir diferenças de P ₁ (ou P ₂₎ marca a ser interpretado como diferenças na competência do esperma.

A Figura 1 descreve a lógica tanto da ofensa e os ensaios de defesa. Para ilustrar a logística do processo, uma ofensa experimento realizado em D. melanogaster ^14, será explicada em detalhe. Este ensaio ofensa particular foi usado para testar um efeito mensurável do multigene família cadeia intermediária dynein específico Sperm (Sdic) sobre a capacidade competitiva do esperma. Todos os Estados-s desta família multigene residem em conjunto no cromossomo X. Homens Knockout foram geradas, suprimindo o cluster Sdic. Porque o segmento excluído também incluiu o essencial curto asa gene (sw) eo objetivo do estudo foi avaliar a relevância de Sdic, os homens portadores da deleção Sdic-sw foram resgatados por uma cópia transgênica do sw (simbolizado como P {sw} , que também realizado um mini-gene repórter de branco) no cromossoma 2. Cor dos olhos foi usado como um marcador visível para identificação de paternidade. Todas as moscas estavam num fundo branco mutante com a excepção daqueles a partir da estirpe de Oregon-R, que foram usadas como referência para os machos.

Protocolo

Experimentos em pequena escala deve ser realizada para se familiarizar com todo o processo.

1. Coleta de fêmeas e machos virgens Naïve

A versão mais simples do experimento descrito é composto por quatro tipos de cruzamentos iniciais, que envolvem a seguinte combinação de adultos: a) w ^1.118 indivíduos, a fim de coletar fêmeas virgens, b) Oregon-R indivíduos, a fim de recolher os machos de referência ingênuos, c ) P {sw} machos homozigotos e fêmeas virgens de uma linha de controle que leva a organização do tipo selvagem de Sdic a fim de recolher os machos experimentais ingênuos (Tipo I), ed) P {sw} machos homozigotos e Sdic-sw-exclusão de transporte de fêmeas virgens a fim de recolher os machos experimentais ingênuos que levam a deficiência Sdic-sw (Tipo II).

1. Configurar vários frascos contendo 8-10 fêmeas e 5 machos cada. Permitir que as mulheres para colocarovos e transferir os adultos a novos frascos a cada 3-5 dias. Use garrafas em vez de frascos, se necessário e use sempre alimentos frescos. O número de ampolas requeridas dependerão do número de tipos de machos experimentais em estudo e o número de indivíduos considerados necessários para detectar diferenças (Tabela 1). Mais de 10 fêmeas por frasco pode resultar em excesso de população durante o crescimento das larvas, o que pode provocar variações na fertilidade da progenitura. Guardar os frascos a 25 ° C numa câmara de temperatura controlada.
2. Iniciar a coleta de fêmeas e machos virgens ingênuas nos dias 11 ^º e 12 ^º depois de configurar as cruzes iniciais. O período de espera varia em função da temperatura; menores temperaturas resultam em maior tempo de retardamento do desenvolvimento do conjunto de indivíduos. Outro fator que afeta o momento de eclosão é o tipo de meio. Alimentos nutritivos, como meio de fubá, o fermento ^29, garante o bom desenvolvimento do adultosistema reprodutivo, o que facilita o acasalamento. Colete unmated voa cada 4-6 horas. Ao coletar, anestesiar moscas através da introdução de CO ₂ para dentro do frasco, toque as moscas para baixo, e sexo-los sob microscópio estereoscópico (Figura 2). Coloque as moscas desejados em diferentes frascos por sexo e fenótipo e rotular os frascos adequadamente.

Nota 1. Rotina de coleta começa pela manhã, descartando os adultos que surgiram durante a noite anterior. Recolhe fêmeas e machos virgens naive uma ou duas vezes durante o dia. Tipicamente, D. melanogaster os machos tornam-se sexualmente maduros 8 horas após a eclosão a 25 ° C ^30. Se as moscas são mantidas sob 12:12 h de luz / escuridão ciclos, espera-se dois picos de eclosão: durante o primeiro 1-2 horas após a luz é acesa, e durante a 2 horas antes que a luz é desligada. Eclosão ocorre dentro de 24 horas após o escurece pupa.

Nota 2. Não mais do que 10 fêmeas should ser colocado no mesmo frasco para evitar a superlotação. Isso também limita a perda de fêmeas no caso de terem de ser descartadas por pelo menos um deles não é virgem.

Nota 3. A fim de recolher o número apropriado de fêmeas e machos virgens ingênuas em um curto período de tempo, as seguintes medidas podem ser adotadas. Configure 15-20 frascos de w ¹¹¹⁸ para experimentos envolvendo dois tipos de homens experimentais (Tabela 1). Polvilhe levemente a superfície da mídia e adicionar algumas pelotas de fermento biológico seco para facilitar a oviposição. Transfira os pais, pelo menos quatro vezes em dias consecutivos. Para aumentar a superfície disponível para a fase de pupa em cada frasco, inserir papel multi-dobrada (7 x 5 cm) durante o 4 ^º ou 5 ^º dia após os pais são transferidos para um outro frasco (Figura 3). Se o número de adultos emergidos a partir do cruzamento inicial não é suficiente, espere mais alguns dias e recolher indivíduosals de frascos criado em datas diferentes. Plano para realizar os experimentos ao longo de vários dias consecutivos para igualar a carga de trabalho.

2. Experimentos Double-acasalamento

A Figura 4 mostra os principais passos envolvidos nas experiências de dupla acoplamento realizadas em ^14.

1. Na manhã do dia 1, criou o primeiro acasalamento. Os machos Oregon-R são os primeiros a acasalar no ensaio ofensa.
   1. Usando o aspirador, configurar frascos contendo outubro 4-05 dias de idade, de olhos brancos w fêmeas virgens ¹¹¹⁸ e 10 de olhos vermelhos Oregon-R machos virgens de cada um. Duas a três frascos são criados por dia durante 5 dias consecutivos. O número de frascos a ser configurado pode variar, dependendo do número de indivíduos disponíveis. Permitir que as moscas se acasalar por 2 horas.
   2. Descartar Oregon-R machos e fêmeas em cada lugar um novo frasco utilizando um aspirador (Figura 5). Identificação de sexo pode ser conseguida por meio de inspecção visual de algunsdiferenças morfológicas (Figura 2). Rotular cada frasco adequadamente e deixar a mulher no frasco por 2 dias (doravante "v1").
2. No dia 3, configure o segundo acasalamento. Selecção dos machos e transversais definidos, deve ser realizado de forma aleatória, de modo a minimizar qualquer tendência potencial para qualquer um dos tipos de machos experimentais.
   1. Duas horas antes da luz é desligada, transferir novamente a fêmea em um novo frasco com um aspirador. Rotular o novo frasco adequadamente (a seguir "v2").
   2. Introduzir três machos experimentais 5-6 dia de idade do mesmo genótipo em V2.
   3. Repita 2.2.1 e 2.2.2 para cada fêmea.
   4. No dia 4, duas horas antes direito a luz é ligado (ou seja, não mais do que 12 horas após a 2.2.1), descarte homens usando o aspirador.
3. No dia 6, transferir cada fêmea novamente em um novo frasco. Rotular os novos frascos de forma adequada (a seguir "v3").
4. No dia 10, descartar a ¹¹¹⁸ w fêmeas.
5. Examine as progênies em v2 e v3. A primeira inspecção é realizada após 13-15 dias após a fêmea é introduzida V2 (ou V3), por exemplo, no dia 17 após a primeira ovipositar começou fêmea em V2. A segunda inspeção é realizada exatamente após 17 dias. Este período de tempo representa um limite temporal, superior de segurança, que garante não de segunda geração no mesmo frasco. Duas inspecções evitar a superlotação, facilitando a contagem de progênie.
   1. No Dia 17, v1 inspecionar e garantir que não são descendentes de olhos vermelhos presente, se não marcar o frasco adequadamente. Presença de progenitura de olhos em branco indicam que a mulher não era virgem no momento do acoplamento inicial, enquanto nenhuma progénie indica que o acasalamento com o de referência ou os machos experimentais não ocorrem.
   2. No dia 17, realizar a primeira inspeção de v2. Anesthetize surgiu progênie em v2 com CO ₂ e classificá-los por cor dos olhos e sexo. Números recordes de progênie filhas de primeiro e segundoond homens. Figura 6 mostra os fenótipos esperados na progênie de cada esquema de acasalamento. Nesta experiência em particular ^14, apenas a descendência feminina pode ser atribuído inequivocamente como desejado pela referência ou os machos experimentais e, portanto, apenas a informação de filhas podem ser usados ​​para calcular P _2. Se com outros marcadores a paternidade de descendência masculina pode ser atribuído inequivocamente, progenitura contagens de ambos os sexos, pode ser usado nos cálculos a jusante. Descarte a descendência, mas manter v2 para segunda inspecção.
   3. No dia 20, proceder como no 2.5.2 com a prole recém-surgido em v2 e, em seguida, descartar o frasco.
   4. No dia 20, inspecionar a descendência surgiu em v3 pela primeira vez e siga o passo 2.5.2.
   5. No dia 23, proceder como no 2.5.3 com a prole recém-surgido em v3.

Nota 1: Devido ao efeito de inflar potencial na pontuação P que a poligamia pode ter (2.2.2 e 2.2.3), o acasalamentopode ser limitado a um determinado período de tempo. O período de tempo dependerá da frequência remating relacionado com o genótipo do sexo feminino e masculino usados. A probabilidade de acoplamento múltiplo é especialmente reduzido durante o período nocturno ^11.

Nota 2: Não adicione pelotas leveduras vivas, porque isso pode causar problemas devido ao potencial de crescimento excessivo da levedura quando o número de moscas adultas é baixo.

3. Análise de Dados

1. Contagem de progênie gravadas devem ser organizados de forma adequada para a inspeção visual e fácil análise eficiente, com um pacote estatístico adequado (por exemplo, JMP da SAS Institute) ou ferramentas baseadas em web livre (eg http://vassarstats.net/ ).
2. Capacidade competitiva do esperma. Adicionar contagens de v2 e v3. Moscas fêmeas que deram origem a nenhum ou muito limitada progênie (por exemplo, <10), morreu durante o procedimento, ou estavam apenas com êxito inseminaçãoted por um dos dois machos são considerados como não informativo e são excluídos de qualquer análise estatística jusante (2.5.1 e na Tabela 2). Calcular a pontuação P ₂ para cada fêmea informativo.
3. Testar se existem diferenças estatisticamente significativas nos valores de P ₂ entre os machos experimentais comparados. Isso pode ser feito usando paramétrico (HSD de Tukey, por exemplo) ou testes não paramétricos (por exemplo, aço-Dwass) dependendo de vários fatores, incluindo a assimetria da distribuição dos valores de P ₂ ea dependência entre a variância ea média. A transformação angular é normalmente aplicado em proporções, tal como P _2, antes da utilização de testes paramétricos ^31.
4. As diferenças de acasalamento (opcional). Para cada tipo macho experimental, calcular o número de fêmeas acasaladas duplamente e aqueles que só acoplado com o primeiro macho (o macho de referência no ensaio de ataque e o macho experimental no defense ensaio). Usando um teste exato bicaudal de Fisher (disponível em http://www.langsrud.com/fisher.htm ), determinar se existem diferenças estatisticamente significativas entre os dois tipos de homens experimentais.
5. Distribuição por sexo (opcional). Para cada homem experimental, utilize o teste do qui-quadrado para determinar se a proporção entre os sexos na progênie de cada um se desvia do sexo feminino a partir da proporção 1:1 esperada.

Resultados

A Tabela 2 resume algumas características marcantes de dois experimentos de ofensa (Ensaios 1 e 2), em que D. melanogaster machos experimentais com e sem (tipo I e II, respectivamente), um cluster Sdic funcional são comparados ^14. Depois de levar em conta as diferentes incidências encontradas com algumas repetições 58-83% das mulheres foram encontrados para ser informativo e, portanto, as contagens de paternidade de seus descendentes poderiam ser usados ​​para o cá...

Discussão

Nós descrevemos o projeto experimental para avaliar as diferenças na contribuição relativa de organismos geneticamente distinto D. melanogaster machos à progênie em experimentos controlados duplo-acasalamento ^7,8. Isto foi realizado no contexto de um factor genético hipótese de influenciar a capacidade competitiva do esperma e que tenha sido ilustrada no ensaio de ataque, embora um procedimento semelhante aplica-se ao ensaio de defesa (Figura 1). Esta concepção experimental...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes