العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني

Summary

نحن تصف بروتوكول لعزل وتنقية العدلات من نخاع العظم الماوس عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة والعدلة لوضع العلامات باستخدام الأصباغ CellTracker. وهذا يمثل طريقة بسيطة وسريعة واستنساخه واقتصادية من أجل الحصول على أعداد كبيرة من العدلات للدراسات وظيفية المصب أو نقل وتتبع التجارب بالتبني.

Abstract

العدلات هي خلايا المستجيب الحرجة من نظام المناعة الفطرية. يتم تجنيدهم بسرعة في مواقع الالتهاب الحاد وبذل آثار وقائية أو المسببة للأمراض اعتمادا على الوسط التهابات. ومع ذلك، على الرغم من الدور الذي لا غنى عنه من العدلات في الحصانة، فهم مفصل من العوامل الجزيئية التي تتوسط الآثار العدلات 'المستجيب وimmunopathogenic في الأمراض المعدية المختلفة والحالات الالتهابية لا يزال غير موجود، وذلك جزئيا بسبب وضعهم قصيرة نصف الحياة، وصعوبات في التعامل مع هذه الخلايا وعدم وجود البروتوكولات التجريبية موثوق بها للحصول على أعداد كافية من العدلات للدراسات وظيفية المصب وتجارب نقل بالتبني. ولذلك، طرق بسيطة وسريعة واقتصادية وموثوق بها، مطلوبة بكثرة لحصاد أعداد كافية من العدلات الماوس لتقييم وظائف مثل البلعمة والقتل، خلوى الإنتاج، وتحبب والاتجار بها. وتحقيقا لهذه الغاية،نقدم كثافة بروتوكول التدرج استنساخه القائم على الطرد المركزي، والتي يمكن تكييفها في أي مختبر لعزل أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظام من الفئران مع نقاء عالية وقدرتها على البقاء. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم بروتوكول بسيط يستخدم الأصباغ CellTracker لتسمية العدلات المعزولة، والتي يمكن بعد ذلك يتم نقل adoptively في الفئران المتلقية وتعقبها في العديد من الأنسجة لمدة 4 ساعة على الأقل بعد النقل باستخدام التدفق الخلوي. باستخدام هذا النهج، ووضع العلامات الفرق من العدلات من الفئران من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص مع الأصباغ CellTracker مختلفة يمكن استخدامها بنجاح لإجراء دراسات إعادة تعمير تنافسية لتقييم الدور المباشر للجينات معينة في الاتجار العدلات من الدم إلى الأنسجة المستهدفة في الجسم الحي .

Introduction

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في البشر. هم المكون الرئيسي الخلوية في الجهاز المناعي الفطري ويكون بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. المرضى الذين يعانون من قلة العدلات المكتسبة ونقص المناعة الأولية التي تؤثر على أعداد العدلات و / أو وظيفة تطوير التهابات الغازية التي تهدد الحياة البكتيرية والفطرية، وتسليط الضوء على أهمية هذه الخلايا في الدفاع المضيف ^1. الاعتراف المناعي للغزو مسببات الأمراض في موقع الإصابة بهم وما شابه ذلك نمط الاعتراف مستقبلات النتائج في الاستقراء لمدبرة الاستجابة المناعية الفطرية، الأمر الذي يؤدي إلى إفراز chemoattractants التي تولد التدرج الكيميائي قادرة على تجنيد العدلات من مجرى الدم إلى الأنسجة الملتهبة ² . بعد العدلات دخول موقع الإصابة، فإنها تصبح تفعيلها، الأمر الذي يؤدي إلى خلوى وchemokine الإنتاج، وامتصاص الممرض، وقتل عن طريق الأكسدة وغير المؤكسدة ليchanisms ^3. وإلى جانب دورها المعترف بها بشكل جيد في المناعة الفطرية، كما تم مؤخرا أظهرت العدلات للعب أدوار هامة مثل المبادرين من الاستجابات المناعية التكيفية فعالة ^4. من ناحية أخرى، وبصرف النظر عن الأدوار وقائي بهم في الحصانة، العدلات قد توسط أيضا إصابة الأنسجة والباثولوجيا المناعية بسبب التراكم المفرط و / أو التنشيط في مواقع الالتهاب، كما هو مبين في مجموعة متنوعة من الأمراض المعدية والمناعة الذاتية ^5-7.

على الرغم من الدور الذي لا غنى عنه من العدلات في تصاعد الاستجابات المناعية الفطرية الفعالة ووظائفها المستجيب عديد المظاهر في العديد من الأمراض المعدية والالتهابات، والصعوبات التقنية مع التعامل مع هذه الخلايا وعدم وجود البروتوكولات التجريبية موثوق أعاق البحوث مع العدلات على مدى العقود الماضية. ولذلك، واستخدام المقايسات استنساخه لعزل العدلات ينبغي أن تسهل إجراء المزيد من البحوث على immunolo العدلات بوساطةوظائف gical خارج الحي والحية. حتى الآن، وقد وصفت عدة طرق لعزل العدلات مثل الطرد المركزي المتدرج الكثافة من الدم البشري والدم الماوس أو نخاع العظم ^8،9، إيجابية أو سلبية تخصيب immunomagnetic من العدلات من الدم أو نخاع العظم الماوس ^10،11، والحصاد من العدلات من التجويف البريتوني من الفئران بعد الحقن داخل الصفاق من thioglycollate أو وكلاء الالتهابية الأخرى ^12. على الرغم من العدلات يمكن عزلها بسهولة في أعداد كبيرة من الدم البشري، وهذا الأسلوب هو الأمثل في الفئران نظرا لمحدودية حجم الدم الماوس يحول دون العزلة من العدلات كافية للدراسات وظيفية أو تجارب نقل بالتبني ^13. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن العائد من thioglycollate-أثارت الخلايا من التجويف البريتوني هو أكبر مقارنة بما كان عليه من الدم الماوس، ونقاء من العدلات في غسيل البريتوني التهابات يختلف بين60-90٪، والعدلات معزولة يحمل النمط الظاهري تفعيلها. وهكذا، جمع الخلايا باستخدام هذا الأسلوب يمكن فقط أن تستخدم لإجراء الدراسات الفنية للتنشيط ولكن ليس من العدلات unstimulated، كما التجويف البريتوني الماوس لديها عدد قليل العدلات في حالة مستقرة ^12. بدلا من ذلك، نخاع العظم هو خزان مريحة للحصاد أعداد كبيرة من العدلات إما unstimulated أو تنشيط ^11،14، والتي يمكن ان تستخدم بعد ذلك لدراسات وظيفية المصب مثل البلعمة والقتل وتحبب، أو لنقل بالتبني في الفئران المتلقية.

هنا نحن تصف بسيطة وسريعة (~ 2 ساعة) البروتوكول، الذي يوفر العائد المرتفع (~ 6-12 × 10 ⁶ العدلات / الماوس غير مصاب، أو ما يصل إلى 30-40 × 10 ⁶ العدلات / فأر مصاب) من الذهب الخالص (80 -95٪) العدلات مع> 95٪ الجدوى من نخاع العظام. يستخدم هذا الأسلوب Histopaque المتاحة تجاريا، والتي هي كثافة التدرج سيبا الخليةوسائل الاعلام التموينية تتألف من Ficoll ودياتريزوات الصوديوم، لفصل العدلات من نخاع العظام من الفئران. هذه الطريقة تعطي أرقام أكبر بكثير من العدلات في الماوس مقارنة مع الدم أو البريتوني تجويف، فإنه يمكن استخدامها لجمع العدلات من الفئران سواء في حالة مستقرة أو بعد الإصابة، وأنه من الأسهل أن طبقة بالمقارنة مع أسلوب الطرد المركزي المتدرج الكثافة التي تستخدم متقطع التدرجات Percoll تتألف من 55٪ / 65٪ / 75٪ Percoll في برنامج تلفزيوني ^9. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تناقص الوقت والموارد اللازمة لجمع العدلات نقية بشكل ملحوظ مقارنة مع العزلة العدلة باستخدام الفرز مضان تنشيط الخلايا. أيضا، لأن هذا الأسلوب لا ينطوي على خطوة تخصيب immunomagnetic، هو أكثر فعالية من حيث التكلفة، وأنه يتجنب التعرض الخلايا إلى العمود المغناطيسي والأجسام المضادة، مما يخفض من احتمال تفعيل العدلات.

بالإضافة إلى إجراء الدراسات الفنية للneutroph معزولةILS خارج الحي ونقل بالتبني من الخلايا في الفئران المتلقية، ويصف هذا البروتوكول أيضا طريقة لوصفها من العدلات المعزولة باستخدام الأصباغ CellTracker مختلفة. وضع العلامات الفرق من العدلات من الفئران من مختلف الخلفيات الوراثية يمكن تكييفها في دراسات إعادة تعمير تنافسية لتتبع العدلات نقل في أنسجة الفئران المتلقي باستخدام التدفق الخلوي، والتي يمكن أن توفر البصيرة الآلي على الدور المباشر للجينات معينة في الاتجار العدلات من الدم إلى الهدف أجهزة ملتهبة ^6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. العزلة من الفأر نخاع العظم والخلايا

1. الموت ببطء الفئران باستخدام بروتوكول رعاية الحيوان المؤسسة اللجنة وافقت عليها وترش على سطح الحيوان مع الايثانول 70٪.
2. إجراء شق في الجلد في منتصف البطن وإزالة الجلد من الجزء القاصي من الفأرة بما في ذلك الجلد الذي يغطي السفلية.
3. قطع العضلات من السفلية باستخدام مقص وخلخل بعناية لحق من مفصل الورك، مع تجنب كسر عظم الفخذ رئيس.
4. إزالة العضلات المتبقية من عظم الفخذ والساق باستخدام مشرط ومقص وفصل عظم الفخذ من الساق عند الركبة الرعاية ممارسة مشتركة لعدم كسر نهايات العظام. وضع العظام في طبق بتري تحتوي RPMI الجليد الباردة 1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين.
5. انتقل إلى الخطوات التالية في إطار نسيج الثقافة هود. اتخاذ الاحتياطات اضافية للحفاظ على تقنيات معقمة صارمة لتجنب neutrophiL التنشيط.
6. شطف كل العظام مع الايثانول 70٪ (داخل طبق بتري)، يليه ثلاثة يغسل اللاحقة في الجليد الباردة PBS العقيمة (داخل أطباق بتري) لشطف قبالة الإيثانول من سطح العظام.
7. في الداخل نظيفة طبق بتري معقمة، وقطع المشاش في العظام والاحتفاظ بها جانبا.
8. استخدام إبرة عيار 25 وحقنة سم مكعب 12 مليئة RPMI تستكمل مع FBS 10٪ و 2 ملي EDTA، وتدفق خلايا نخاع العظام من كلا طرفي مهاوي العظام على 50 مل المسمار أعلى أنبوب فالكون مزودة 100 ميكرون تحديد. من أجل إزالة جميع الخلايا بكفاءة، كشط السطح الداخلي للعظام باستخدام إبرة عيار 25.

ملاحظة: ابيضاض من العظام يشير إلى أن خلايا تم كشط بما فيه الكفاية.

ملاحظة: استخدم حوالي 10 مل من وسائل الاعلام لطرد عظم فخذ / الزوج الساق. مضيفا EDTA إلى وسيلة ضرورية لمنع تراكمها من الخلايا.

9. قطع المشاش العظامفي الصغيرة 0.5-1 ملم ³ قطع مع مشرط وسحق لهم من خلال مرشح ميكرون 100 باستخدام نهاية الخلفي من 2.5 مل إيبندورف Combitip زائد بيوبور غيض ماصة.
10. الطرد المركزي في 1،400 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
11. ليز خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة التعليق الخلية بيليه في 20 مل من 0.2٪ كلوريد الصوديوم لحوالي 20 ثانية تليها إضافة 20 مل من 1.6٪ كلوريد الصوديوم. (الحرجة: لا يتجاوز 20-30 ثانية من تحلل منخفض التوتر لتجنب موت الخلايا نخاع العظام ينصح استخدام ناقص التوتر كلوريد الصوديوم لتحلل أكثر من العازلة lysing ACK لأن الأخير لديه القدرة على تفعيل العدلات).
12. أجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 1،400 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لجمع الخلايا.
13. غسل الخلايا مع المتوسط ​​1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 2 ملي EDTA وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.12.
14. العائد من خلايا نخاع العظام باستخدام هذا الأسلوب هو ما يقرب من 60 حتي 80000000 في المعافين C57BL 8-12 أسبوع من العمر / 6 الماوس.

2. فصل من العدلاتبواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة

1. عد خلايا نخاع العظم و resuspend في 1 مل من الجليد الباردة PBS العقيمة.
2. أضف 3 مل من Histopaque 1119 (الكثافة، 1.119 جم / مل) في أنبوب مخروطي 15 مل.
3. تراكب 3 مل من Histopaque 1077 (الكثافة، 1.077 جم / مل) على مل 3 من Histopaque 1119.

ملاحظة: Histopaque 1119 وHistopaque 1077 ينبغي أن تكون درجة حرارة إلى 18-26 درجة مئوية قبل الاستخدام.

خطوة حاسمة: إعداد التدرجات فورا قبل الاستخدام وإعداد والتدرج في وقت مبكر يؤدي إلى انتشار بين طبقتين ونقاء العدلة دون المستوى الأمثل والانتعاش.

خطوة حاسمة: تتراكب Histopaque 1077 أكثر من 1119 يحتاج إلى أن يتم ببطء لتجنب خلط اثنين من الكثافة، والتي سوف يحول دون فصل الخلايا خلال الطرد المركزي.

4. تراكب خلية نخاع العظم التعليق على الجزء العلوي من Histopaque 1077.

خطوة حاسمة: Overlفي Aying الخلية نخاع العظم التعليق أكثر من 1077 احتياجات Histopaque إلى أن يتم ببطء لتجنب تعكير صفو العلاقة بين الخلايا وHistopaque 1077.

ملاحظة: إعادة التعليق خلايا نخاع العظام من الماوس المعافين في 1 مل من برنامج تلفزيوني تعطي نقاء العدلة من> 90٪. ومع ذلك، وتجميع العديد من عينات نخاع العظام التنازلات نقاء العدلة، على سبيل المثال، إعادة التعليق 300 × 10 ⁶ خلايا في 3 مل PBS يقلل من نقاء العدلات> 90٪ إلى 80٪ ~. ولذلك، ينبغي للمحققين إجراء تجارب رائدة لتحديد العد / حجم الخلية ظروف مثالية لتجاربهم الخاصة

5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 2،000 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية دون فرامل.

ملاحظة: الطرد المركزي من التدرج في درجة حرارة الغرفة أمر بالغ الأهمية وضرورية لفصل فعلي من العدلات.

6. جمع العدلات في واجهة من Histopaque 1119 وHistopaque 1077 طبقات.
7. غسل العدلات جمعها مرتين مع المتوسط ​​1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين والطرد المركزي في 1،400 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
8. عد العدلات وتحديد قدرتها على الاستمرار.

ملاحظة: العدلات هي عادة> 95٪ قابلة للحياة و> 90٪ نقية على النحو الذي يحدده تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. العائد نموذجي من العدلات من نخاع العظام (أي 2 عظم الفخذ والظنبوب العظام 2) من غير مصاب 8-12 C57BL من العمر الأسبوع / 6 الماوس ~ 6-12٬000٬000 الخلايا. هذا العدد هو أكبر بكثير عندما يتم حصاد العدلات من نخاع العظام من الحيوانات المصابة. وبالتالي، تم انتشال ~ 30-40000000 العدلات / الماوس عندما استخدمت الفئران المصابة المبيضات للحصاد الخلية ^6.

3. وضع العلامات من العدلات باستخدام الأصباغ CellTracker

1. Resuspend والعدلات في 5 × 10 ⁶ خلية / مل في برنامج تلفزيوني prewarmed عند 37 درجة مئوية.
2. إضافة صبغة CellTracker في تناسق النهائيالتموينية من 5 ميكرومتر.

ملاحظة: CellTracker الأخضر (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein ثنائي الأسيتات) وCellTracker أورانج (CMTMR (5 - (و-6)-4-كلوروميثيل Tetramethylrhodamine الأمينية بيروكسايد) والمستخدمة في هذا البروتوكول لتسمية تفاضلي العدلات من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص الفئران.

ملاحظة: إعداد محلول المخزون من 10 ملم من الأخضر CellTracker وCellTracker أورانج، قسامة، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى يوم من التجربة.

3. احتضان العدلات مع 5 ميكرومتر من الصبغة CellTracker المقابلة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي تهتز في الظلام.
4. غسل الخلايا مرتين مع الثلج الباردة المتوسط ​​1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين.

ملاحظة: غسل كفاءة من الخلايا بعد خطوة وصفها مع صبغ CellTracker أمر ضروري لتجنب صبغ انتقال التلوث قبل خلط السكان العدلة تفاضلي المسمى لهبوطاtream دراسات إعادة تعمير تنافسية.

4. نقل بالتبني من العدلات في الفئران والتحليل من العدلات المحول باستخدام التدفق الخلوي

1. العدلات resuspend في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة عند تركيز 25 × 10 ⁶ خلية / مل وحقن 200 ميكرولتر من تعليق في الوريد الذيل الأفقي بحيث يتم نقل 5 × 10 ⁶ العدلات في الماوس. للدراسات العدلة إعادة تعمير تنافسية، مزيج العدلات من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص في نسبة 1:1 وحقن ما مجموعه 5 × 10 ⁶ العدلات في الماوس على النحو الوارد أعلاه.

ملاحظة: على الأقل ما يصل إلى 10 × 10 ⁶ العدلات يجوز نقل adoptively في الماوس دون سمية فوري واضح لهذه الحيوانات.

2. في أوقات مختلفة بعد نقل بالتبني (على سبيل المثال 1، 2، 3 أو 4 ساعات بعد نقل)، الموت ببطء الفئران والدم الحصاد، و / أو نخاع العظم و / أو غيرها من الجهاز المستهدف (ق) من الفائدة.
3. إعداد سيتعليق خلية ngle من هذه الأنسجة للتحليل الكمي والنوعي للنقل adoptively العدلات المسمى باستخدام بروتوكولات نشرت ^6،15.
4. بعد لايف / الميت تلطيخ الجدوى والحصار اف سي، خلايا التسمية مع CD45 (استنساخ 30-F11)، Ly6G (استنساخ 1A8) وCD11b (استنساخ M1/70) وبوابة لايف CD45 ⁺ Ly6G ^{+ +} CD11b العدلات. العدلات في هذه البوابة تشمل العدلات مواطن من الماوس المتلقي فضلا عن العدلات المسمى نقل adoptively، والتي هي ⁺ FITC (إذا كان المسمى مع CellTracker الأخضر) أو PE ⁺ (إذا كان المسمى مع خلية المقتفي أورانج).

ملاحظة: قد يتم تعقب العدلات في الدم ونخاع العظام والكلى من الفئران المصابة المبيضات لمدة 4 ساعة على الأقل بعد النقل.

ملاحظة: التثبيت مع بارافورمالدهيد 2٪ في برنامج تلفزيوني لا يؤثر سلبا على كثافة مضان يعني من العدلات المسمى مع غرام CellTrackerالتابعين أو CellTracker البرتقال لمدة 48 ساعة على الأقل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

هو الأمثل هذا البروتوكول بالنسبة للمحصول من خلايا نخاع العظام من الفئران وفصل لاحق من العدلات من هذه الخلايا بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة باستخدام المتاحة تجاريا وسائل الاعلام فصل الخلية Histopaque. عزل العدلات باستخدام هذه الطريقة يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوع?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا نقدم بروتوكول موثوق بها، بسيطة، سريعة واقتصادية لعزل أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظام من الفئران مع نقاء عالية وجدوى استخدام نهج الطرد المركزي المتدرج الكثافة. عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح، يمكن استردادها ~ 6-12 × 10 ⁶ العدلات من الماوس المعاف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Quality Biological Inc	351-027-101
0.2% and 1.6% sodium chloride	JT Baker	3624	Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Molecular Probes	L-23105	Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
			Materials
C57BL/6 mice	Taconic
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml syringes	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 mm cell strainers	BD Falcon	352360
Bactericidal Petri dishes	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)	Biomedical Research Instruments	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments sterilized prior to use
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Refrigerated centrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 °C shaking water bath	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.