İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Özet

Bir yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla ve CellTracker boyalar kullanılarak nötrofil etiketlemesi için fare kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu ve saflaştırılması için bir protokol açıklamaktadır. Bu aşağı fonksiyonel çalışmalar ya da evlatlık transferi ve izleme deneyler için nötrofil çok sayıda elde etmek için basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik yöntem temsil eder.

Özet

Nötrofiller doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli efektör hücrelerdir. Bunlar hızla akut inflamasyon bölgelerinde işe ve inflamatuar ortamı bağlı olarak koruyucu veya patojenik etkiler gösterebilir vardır. Bununla birlikte, farklı bulaşıcı hastalıklar ve inflamatuar koşullarda nötrofil 'efektör ve immunopathogenic etkileri aracılık moleküler faktörlerin bağışıklık, ayrıntılı bir anlayış nötrofil vazgeçilmez bir rol rağmen hala kısmen, kısa yarı ömrü, bunların kullanımı ile zorluklar, eksik hücreleri ve alt fonksiyonel çalışmalar ve evlat edinen transferi deneyler için nötrofil yeterli sayıda elde etmek için güvenilir deneysel protokollerin eksikliği. Bu nedenle, basit, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir yöntem gibi fagositoz, öldürme, sitokin üretimi, degranülasyonunun ve ticareti gibi işlevleri değerlendirmek için fare nötrofil yeterli sayıda hasat için son derece arzu edilir. Bu amaçla,yüksek saflıkta ve canlılığı olan farelerin kemik iliğinden nötrofil sayıda izole etmek için, herhangi bir laboratuvar olarak adapte edilebilir, tekrarlanabilir yoğunluk gradyan santrifüj tabanlı bir protokol, mevcut. Ayrıca, daha sonra adoptively akım sitometri kullanarak en az 4 saat sonrası transferi için alıcı farelere transfer ve çeşitli dokularda izlenebilir izole nötrofil, etiketlemek için CellTracker boyalar kullanan basit bir protokol mevcut. Bu yaklaşımı kullanarak, farklı CellTracker boyalarla yabani tip ve gen-eksik fareler nötrofil diferansiyel etiketleme başarılı bir şekilde in vivo olarak hedef dokulara kan nötrofilleri ticareti özel genlerin doğrudan rolünün değerlendirilmesi için rekabet repopulation çalışmaların gerçekleştirilmesi için kullanılabilecektir .

Giriş

Nötrofiller, insanlarda en bol lökositlerdir. Onlar mikroorganizmaların işgalci karşı ilk savunma hattı olarak doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve hareket temel hücresel bileşenidir. Nötrofil sayısı ve / veya fonksiyonunu etkileyen kazanılmış nötropeni ve primer immün yetmezlikler olan hastalar konak savunma ¹ bu hücrelerin önemini vurgulayarak hayatı tehdit eden invazif bakteriyel ve mantar enfeksiyonları, geliştirmek. Iltihaplı doku ² içine kan dolaşımından işe nötrofil yeteneğine sahip bir kemotaktik degrade oluşturmak chemoattractants salgılanmasına yol açan bir yönetilen doğal immün yanıt, en indüksiyon kendi soydaş desen tanıma reseptörleri sonuçları enfeksiyon yerinde patojenlerin işgalci bağışıklık tanınması . Nötrofiller enfeksiyon sitesine girmek sonra, aktif hale, hangi sitokin ve kemokin üretimi, patojen alımı yol açar ve oksidatif ve non-oksidatif beni ile öldürüyorchanisms ^3. Doğuştan gelen bağışıklık onların iyi bilinen rolü yanı sıra, nötrofil yakın zamanda etkili adaptif immün yanıtları ⁴ başlatanlar gibi önemli rol oynar gösterilmiştir. ^5-7 bulaşıcı ve öz bağışıklık hastalıklarının çeşitli 'de gösterildiği gibi, diğer yandan, ayrı bağışıklık kendi koruyucu rolleri, nötrofiller, aynı zamanda, aşırı birikimi ve / veya inflamasyon bölgelerinde aktivasyonuna bağlı doku hasarı ve İmmünopatoloji aracılık edebilir.

Montaj etkili doğal immün yanıtları ve çeşitli enfeksiyon hastalıkları ve inflamatuar durumlar, güvenilir deneysel protokollerin bu hücrelerin ve eksikliği taşıma ile teknik zorluklar içinde pleiotropik efektör fonksiyonları nötrofil vazgeçilmez bir rol rağmen geçmiş yıllarda nötrofil, araştırma engellemiştir. Bu nedenle, nötrofillerin izolasyonu için tekrarlanabilir analizlerin kullanımı ve nötrofil aracılı immunolo için daha fazla araştırma kolaylaştırmalıdırjik fonksiyonları, ex vivo ve in vivo. Bugüne kadar, çeşitli yöntemler, örneğin insan kanı, yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye ve fare kan veya kemik iliği ^8,9, fare kan veya kemik iliği ^10,11 nötrofillerin pozitif veya negatif zenginleştirme immünomanyetik olarak nötrofillerin izolasyonu için anlatıldığı ve hasat edilmiştir tiyoglikolat veya diğer enflamatuar ajanların ¹² intraperitoneal enjeksiyonu takiben farelerin periton boşluğundan nötrofillerin. Nötrofiller insan kanından kolayca çok sayıda izole edilebilir, ancak bu yöntem, işlevsel çalışmalar ve adoptif transfer deneyleri ¹³ için yeterli nötrofil izole edilmesini önleyen fare kan sınırlı bir hacme bağlı olarak farelerde suboptimaldir. Verimi tiyoglikolat-ortaya çıkardı, ancak ek olarak, periton boşluğundan kan hücrelerinin fare ile karşılaştırıldığında daha büyüktür, inflamatuar peritoneal lavaj nötrofillerin saflık arasında değişir% 60-90, ve izole edilen nötrofillerin aktive edilmiş bir fenotip sergiler. Bu yüzden, hücreler, fare peritoneal boşluğuna kararlı durum ¹² az sayıda nötrofil olduğu gibi bu yöntem sadece, aktif fonksiyonel çalışmalar yapmak için kullanılmaz, ancak uyarılmamış nötrofil edilebilir kullanılarak toplandı. Bunun yerine, kemik iliği ve daha sonra, fagositoz, öldürme ve degranülasyonu veya alıcı farelere adoptif transfer gibi akım aşağı fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir ya da uyarılmamış ve aktifleştirilmiş nötrofillerin ^11,14, çok sayıda hasat edilmesi için uygun bir haznedir.

Bu yazıda, yüksek verim sağlayan basit ve hızlı (~ 2 saat) protokolü, tarif (~ 6-12 × 10 ⁶ nötrofil / bulaşmamış fare veya 30-40 × 10 ⁶ nötrofil / enfekte fare) saf (80 -95%) kemik iliğinden>% 95 canlılığı ile nötrofil. Bu yöntem, yoğunluk gradyanlı hücre ayrı olarak ticari olarak temin edilebilen Histopaque kullanırFicoll ve sodyum diatrizoate oluşan oranı ortam, farelerin kemik iliğinden nötrofil ayırmak için. Bu yöntem, kan ya da periton boşluğu ile karşılaştırıldığında fare başına nötrofil önemli ölçüde daha fazla sayıda verir, bu kararlı durum ya da enfeksiyon sonrası her iki farenin nötrofillerin toplamak için kullanılan ve süreksiz kullanan yoğunluk gradyan santrifüj yönteme göre tabakası daha kolay olabilir % 55 /% 65 / PBS içinde 75% ⁹ Percoll oluşan Percoll gradient. Buna ek olarak, zaman ve saf nötrofil toplamak için gerekli kaynakları önemli ölçüde Floresan-Aktif Hücre Ayırma kullanarak nötrofil izolasyon göre azalmıştır. Ayrıca, bu yöntem, bir immünomanyetik zenginleştirme aşamasında anlamına gelmez, çünkü daha düşük maliyetli olan ve bu nedenle nötrofil aktivasyonunun olasılığını azaltarak, manyetik kolonu ve antikorlar hücrelerinin maruz kalma önler.

Izole neutroph fonksiyonel çalışmalar performans ek olarakils ex vivo ve alıcı farelere hücrelerinin adoptif transfer, bu protokol, aynı zamanda farklı CellTracker boyalar kullanılarak izole nötrofil etiketlenmesi için bir yöntem açıklanır. Çeşitli genetik kökenden farelerden alınan nötrofil Diferansiyel etiketleme kandan nötrofil ticareti belirli genlerin doğrudan rol mekanik fikir sağlayabilir akım sitometri kullanarak alıcı farelerin dokularında transfer nötrofil izlemek için rekabetçi repopulation çalışmalarda adapte edilebilir hedef iltihaplı organları ⁶ içine.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Fare Kemik İliği Hücreleri İzolasyon

1. Kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanan protokolünü kullanarak fareler Euthanize ve% 70 etanol ile hayvan yüzey sprey.
2. Orta karın deri bir kesi yapmak ve alt ekstremite kaplayan deri ve fare distal kısmından cilt kaldırmak.
3. Makas kullanarak alt ekstremite kasları kesilmiş ve femur başı kırılma kaçınarak dikkatle, kalça eklemi gelen asetabulum yerinden.
4. Bir neşter ve makas kullanılarak femur ve tibia gelen kalan kasları çıkarın ve kemik uçları kırmak değil diz egzersiz bakım de tibia gelen femur ayırın. % 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş buz gibi soğuk RPMI 1640 1X içeren bir Petri kabındaki kemikleri yerleştirin.
5. Bir doku kültürü kaputu altında aşağıdaki adımlara devam edin. Neutrophi önlemek için sıkı steril teknikleri korumak için ekstra önlem alınl aktivasyonu.
6. Kemik yüzeyinden etanol durulayın buz soğukluğunda steril PBS içinde üç yıkamadan sonra (Petri içinde) ve ardından% 70 etanol (bir Petri kabı içinde) ile her bir kemik durulayın.
7. Temiz bir steril Petri kabı içinde, kemiklerin epifizleri kesti ve onları bir kenara saklayın.
8. Bir 25-gauge iğne ve RPMI,% 10 FBS ve 2 mM EDTA eklenmiş ile dolu bir 12 cc şırınga kullanarak ve bir 100 mikron ile donatılmış, 50 ml'lik vida üst Falcon tüpüne kemik şaftlann her iki ucunda ikinci kemik iliği hücrelerinin bir hizada filtre. Etkili bir biçimde hücreleri çıkarmak amacıyla, 25-gauge iğne kullanılarak kemik iç yüzeyi raspa.

NOT: kemik haşlama hücreleri yeterince kazınmış olduğunu gösterir.

NOT: femur / tibia çifti temizlemek için medya yaklaşık 10 ml kullanın. Orta EDTA ekleyerek hücrelerin kümeleşmeyi önlemek için gereklidir.

9. Kemik epifizleri CutBir neşter ve bir 2.5 ml Eppendorf Combitip Artı Biopur pipet arka uç kullanarak 100 mikron filtre aracılığıyla şut küçük 0.5-1 mm ³ adet.
10. 4 ° C, 7 dakika boyunca 1400 rpm'de santrifüj
11. Yaklaşık olarak 20 saniye boyunca% 0.2 NaCl, 20 ml hücre pelletini tekrar süspanse ederek, kırmızı kan hücrelerinin lize% 1.6 NaCl, 20 ml ilave edilir. (Kritik: kemik iliği hücre ölümü önlemek için hipotonik lizis 20-30 sn aşmayın ikinci nötrofil aktive potansiyeline sahiptir, çünkü parçalama için hipotonik NaCl kullanımı ACK parçalama tampon üzerinde tavsiye edilir.).
12. 4 at 1.400 rpm 7 dakika santrifüj ° C hücreleri toplamak için.
13. % 10 FBS ve 2 mM EDTA ile takviye edilmiş RPMI 1640 hücreleri 1X yıkayın ve adım 1.12 olarak santrifüj.
14. Bu yöntemi kullanarak, kemik iliği hücrelerinin verimi yaklaşık 60-80.000.000 enfekte 8-12 haftalık C57BL / 6 fare başına verilir.

2. Nötrofiller ayrılmasıyoğunluk dereceli santrifüj yoluyla

1. Kemik iliği hücreleri saymak ve buz soğukluğunda steril 1 ml PBS içinde yeniden süspanse.
2. 15 ml konik bir tüp içinde Histopaque 1119, 3 ml (yoğunluğu, 1.119 g / ml) eklenir.
3. Histopaque 1119, 3 ml üzerinde Histopaque 1077 kaplama 3 ml (yoğunluk 1.077 g / ml).

NOT: Histopaque 1.119 ve Histopaque 1.077 18-26 ısındı olmalıdır ° C kullanmadan önce.

Kritik Adım: hemen önceden degrade iki kat ve optimal nötrofil saflık ve kurtarma arasındaki difüzyon ile sonuçlanır hazırlama gibi kullanmadan önce geçişlerini hazırlayın.

Kritik Adım: Kaplama santrifüj sırasında hücre ayırma engel olan iki yoğunlukları, karıştırma önlemek için yavaş yavaş yapılması 1119 ihtiyaçları üzerinde Histopaque 1.077.

4. Histopaque 1077 üstüne kemik iliği hücre süspansiyonu Yerleşimi.

Kritik Adım: Overlhücreler ve Histopaque 1077 arasındaki ara rahatsız etmemek amacıyla yavaşça yapılması gereken Histopaque 1077 ihtiyaçları üzerinde kemik iliği hücre süspansiyonu Aying.

Not: 1 ml PBS enfekte olmamış bir fare kemik iliği hücreleri Resuspending,>% 90 saflıkta nötrofil verir. Bununla birlikte, pek çok kemik iliği örneklerinden havuzu nötrofil saflık uzlaşma, örneğin, 3 ml PBS ~% 80 ile>% 90 saflıkta nötrofil azaltır 300 x 10 ⁶ hücre yeniden süspansiyon haline getirilmesi. Bu nedenle, araştırmacılar kendi özel deneyler için ideal bir hücre sayısı / hacim koşulları tanımlamak için Pilot deneyler yapmalıdır

5. 25 2.000 rpm'de 30 dakika ° frensiz C için santrifüj.

NOT: Oda sıcaklığında gradyan santrifüj nötrofil etkin bir şekilde ayrılması için önemli ve gereklidir.

6. Histopaque 1119 arayüzü nötrofil toplayın ve 1.077 katmanları Histopaque.
7. RPMI ile iki kere yıkayın toplanan nötrofillerden 1X 1640% 10 FBS ve 4, 7 dakika boyunca 1400 rpm'de% 1 penisilin / streptomisin ve santrifüj ° C ile desteklenmiş
8. Nötrofil saymak ve canlılığı belirler.

Not: Nötrofiller, tipik olarak> FACS analizi ile belirlendiği gibi% 95 uygulanabilir ve>% 90 saf. Bulaşmamış 8-12 haftalık C57BL / 6 fare kemik iliğinden nötrofillerin tipik verim (yani 2 femur ve tibia kemikleri 2) ~ 6-12.000.000 hücredir. Nötrofil enfekte hayvanların kemik iliğinden hasat edilir, bu numara büyük ölçüde daha büyüktür. Candida ile enfekte farelerde hücre hasat ⁶ kullanıldı zaman Bu nedenle, ~, 30-40 milyon nötrofil / fare ele geçmiştir.

3. CellTracker Boyalar kullanarak Nötrofiller etiketlenmesi

1. 5. nötrofil süspanse x 10 ⁶ hücre / mL PBS içinde 37 ° C'de önceden ılıtılır
2. Son bir concent bir CellTracker boya ekle5 mcM oranı.

Not: CellTracker Yeşil (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein diasetat) ve CellTracker Turuncu (CMTMR (5 - (and-6)-4-klorometil benzoil amino tetramethylrhodamine) için farklı yabani tip ve gen-eksikliği nötrofillerin etiketlemek için bu protokolü kullanılmıştır fareler.

NOT: Deney gününe kadar -80 10 CellTracker Green mM ve CellTracker Portakal, kısım, ve mağaza bir stok solüsyonu ° C hazırlayın.

3. Karanlıkta çalkalanan bir su banyosu içerisinde 37 ° C 'de 10 dakika boyunca, karşılık gelen CellTracker boya 5 uM nötrofil inkübe edin.
4. % 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş buz gibi soğuk RPMI 1640 hücreleri 1X ile iki kere yıkayın.

NOT: hücrelerin Verimli yıkama CellTracker boya ile etiketleme adım çıkışlar için diferansiyel-etiketli nötrofil nüfus karıştırmadan önce boya çapraz bulaşmayı önlemek için gereklidir sonratream rekabetçi repopulation çalışmaları.

4. Fare ve Akım Sitometri kullanarak Aktarılan Nötrofiller Analizinde nötrofillerin Kabul edilmiş Transfer

1. 25 x 10 ⁶ hücre / ml ile 5 x 10 ⁶ nötrofil fare başına aktarılır, böylece, yanal kuyruk damarı içine süspansiyonu 200 ul enjekte edilir bir konsantrasyonda buz gibi soğuk PBS içinde süspanse nötrofil. Rekabetçi repopulation nötrofil çalışmaları için, bir 1:1 oranında yabani tip ve gen-eksikliği nötrofil karıştırmak ve yukarıdaki gibi fare başına 5 x 10 ⁶ nötrofiller toplam enjekte edilir.

NOT: En az en fazla 10 x 10 ⁶ nötrofil adoptively hayvanlara açık hemen toksisite olmadan fare başına devredilebilir.

2. Evlatlık transferi (örneğin 1, 2, 3 veya 4 saat sonrası transferi) ardından farklı zamanlarda, fare ve hasat kan euthanize ve / veya ilgi kemik iliği ve / veya diğer hedef organ (lar).
3. Si hazırlayınyayınlanan protokolleri ^6,15 kullanarak adoptively transfer etiketli nötrofil nicel ve nitel analiz için bu dokulardan ngle hücre süspansiyonları.
4. Ölü / canlı canlılığı boyama ve Fc abluka, CD45 (klon 30-F11) ile etiket hücreleri, Ly6G (klon 1A8) ve CD11b'nin (klon M1/70) ve kapı canlı CD45 ⁺ Ly6G ⁺ CD11b ⁺ nötrofiller üzerinde. Ardından Bu kapının Nötrofiller FITC ⁽⁺ CellTracker Yeşil ile etiketlenmiş) veya PE ⁺ (Hücre Takibi Portakal ile etiketlenmiş varsa) olan alıcı fare yerli nötrofiller gibi adoptif transfer etiketli nötrofiller bulunmaktadır.

NOT: Nötrofiller en az 4 saat sonrası transferi için Candida ile enfekte farelerde kan, kemik iliği ve böbrek izlenen olabilir.

Not: PBS içinde% 2 paraformaldehit ile sabitleme olumsuz CellTracker Gr ile etiketlenmiş, nötrofillerin ortalama floresan yoğunluğu etkilemezEn az 48 saat süre ile ya da een CellTracker Turuncu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokol, farelerden elde edilen kemik iliği hücreleri ve ticari olarak temin edilebilen hücre ayırma ortamı Histopaque kullanılarak yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla, bu hücrelerin, nötrofillerin sonraki ayırma hasat için optimize edilmiştir. Nötrofiller, bu yöntemi kullanan alt fonksiyonel çalışmalar, ex vivo çeşitli ve alıcı farelerde adoptif transfer deneyleri için de kullanılabilir izole edilmiştir.

Bulaşmamış 8-12 haftalık C57BL / 6 fare baş?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu olgu, bir yoğunluk gradyan santrifüj yaklaşım kullanılarak yüksek saflıkta ve canlılığı olan farelerin kemik iliğinden nötrofil sayıda izolasyonu için güvenilir, basit, hızlı ve ekonomik bir protokol mevcut. Bu protokol doğru gerçekleştirildiğinde, ~ 6-12 x 10 ⁶ nötrofil enfekte olmamış bir fareden elde edilebilir ve en çok ~ olarak 30-40 x 10 ⁶ nötrofil enfeksiyonu ⁶ sonra bir fareden izole edilebilir. Izole nötrofil% 80-95 saf ve>% 95 yaşayabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Quality Biological Inc	351-027-101
0.2% and 1.6% sodium chloride	JT Baker	3624	Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Molecular Probes	L-23105	Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
			Materials
C57BL/6 mice	Taconic
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml syringes	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 mm cell strainers	BD Falcon	352360
Bactericidal Petri dishes	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)	Biomedical Research Instruments	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments sterilized prior to use
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Refrigerated centrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 °C shaking water bath	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.