Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Resumo

Descreve-se um protocolo para o isolamento e purificação de neutrófilos de medula óssea do rato por centrifugação de gradiente de densidade e de neutrófilos para rotulagem com corantes CellTracker. Isso representa um método simples, rápido, reprodutível e econômica para a obtenção de um grande número de neutrófilos para estudos funcionais a jusante ou de transferência e controle de experimentos adotivos.

Resumo

Os neutrófilos são células efetoras críticos do sistema imune inato. Eles são rapidamente recrutados em locais de inflamação aguda e exercem efeitos protectores ou patogénicos, dependendo do meio inflamatório. No entanto, apesar de o papel indispensável dos neutrófilos na imunidade, a compreensão detalhada dos fatores moleculares que medeiam efeitos efetoras e imunopatogênico 'neutrófilos em diferentes doenças infecciosas e inflamatórias ainda está faltando, em parte por causa de sua meia-vida curta, as dificuldades com a manipulação destes células ea falta de protocolos experimentais confiáveis ​​para a obtenção de um número suficiente de neutrófilos para estudos funcionais jusante e experimentos de transferência adotiva. Portanto, os métodos simples, rápido, econômico e confiável são altamente desejáveis ​​para a colheita de um número suficiente de neutrófilos de rato para avaliar funções, tais como fagocitose, morte, produção de citocinas, degranulação e tráfico. Para esse fim,apresentamos um protocolo de gradiente de densidade reprodutíveis baseado centrifugação, que pode ser adaptada em qualquer laboratório para isolar um grande número de neutrófilos na medula óssea de ratinhos com elevado grau de pureza e viabilidade. Além disso, apresenta-se um protocolo simples, que utiliza tintas, CellTracker para rotular os neutrófilos isolados, que podem então ser transferidos adoptivamente para ratinhos receptores e rastreadas em vários tecidos, pelo menos, quatro horas após a transferência usando citometria de fluxo. Utilizando esta abordagem, a rotulagem diferencial de neutrófilos de ratinhos de tipo selvagem e o gene deficiente, com diferentes corantes CellTracker pode ser empregue com sucesso para realizar estudos de repovoamento competitivo para avaliar o papel directo de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue para os tecidos alvo in vivo .

Introdução

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos. Eles são o principal componente celular do sistema imune inato e agir como uma primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Pacientes com neutropenia adquirida e imunodeficiências primárias que afetam os números de neutrófilos e / ou função desenvolver infecções bacterianas e fúngicas invasoras que ameaçam a vida, destacando a importância dessas células na defesa do hospedeiro ^1. O reconhecimento imunológico dos patogénios invasores no local da infecção pelo seu padrão de reconhecimento de receptores de cognato resulta na indução de uma resposta imune inata orquestrada, o que leva à secreção de quimioatractivos que geram um gradiente quimiotáctica capaz de recrutamento de neutrófilos a partir da corrente sanguínea para o tecido inflamado ² . Depois de introduzir os neutrófilos no local da infecção, eles tornam-se activados, que conduz à produção de citocinas e quimiocinas, absorção de agente patogénico, e me matar através oxidativo e não-oxidativochanisms ^3. Além de seu papel bem reconhecida na imunidade inata, os neutrófilos têm também sido mostrado recentemente a desempenhar papéis importantes como iniciadores da resposta imune adaptativa eficaz ^4. Por outro lado, para além do seu papel na imunidade de protecção, os neutrófilos podem também mediar lesão tecidual e imunopatologia devido à acumulação excessiva e / ou activação em locais de inflamação, como se mostra em uma variedade de doenças infecciosas e auto-imunes ^5-7.

Apesar de o papel indispensável de neutrófilos em montagem respostas imune inata eficazes e suas funções efetoras pleiotrópicos em várias doenças infecciosas e inflamatórias, dificuldades técnicas com a manipulação dessas células ea falta de protocolos experimentais de confiança tem dificultado a pesquisa com neutrófilos nas últimas décadas. Portanto, a utilização de ensaios reprodutíveis para o isolamento dos neutrófilos devem facilitar a investigação sobre neutrófilos mediada imunológicasfunções gica ex vivo e in vivo. Até à data, vários métodos têm sido descritos para o isolamento de neutrófilos, tais como a centrifugação do gradiente de densidade de sangue humano e de rato, ou medula óssea ^8,9, enriquecimento imunomagnética positiva ou negativa dos neutrófilos do sangue ou da medula óssea do rato ^10,11, e colhendo de neutrófilos da cavidade peritoneal de ratinhos a seguir à injecção intraperitoneal de tioglicolato ou outros agentes inflamatórios ^12. Apesar de neutrófilos pode ser facilmente isolado em grande número a partir do sangue humano, este método é de qualidade inferior em ratos devido ao volume limitado de sangue de rato que impede o isolamento de neutrófilos suficientes para estudos funcionais ou experimentos de transferência adotivos ^13. Além disso, embora o rendimento de tioglicolato-induziu as células da cavidade peritoneal é maior comparada com a de rato no sangue, a pureza dos neutrófilos na lavagem peritoneal inflamatória varia entre60-90%, e os neutrófilos isolados apresentam um fenótipo activado. Assim, as células recolhidas utilizando este método só pode ser utilizado para a realização de estudos funcionais activados, mas não de neutrófilos não estimulados, como a cavidade peritoneal do rato tem alguns neutrófilos no estado estacionário ^12. Em vez disso, a medula óssea é um reservatório conveniente para colheita de grandes números de neutrófilos, quer não estimuladas ou ativadas ^11,14, que podem então ser utilizadas para estudos funcionais a jusante, tais como fagocitose, matando e desgranulação, ou por transferência adoptiva em ratinhos receptores.

Aqui nós descrevemos um método simples e rápido (~ 2 horas) protocolo, o que proporciona um alto rendimento (~ 6-12 × 10 ⁶ neutrófilos / mouse não infectado, ou até 30-40 × 10 ⁶ neutrófilos / mouse infectados) de puro (80 -95%) neutrófilos com> 95% de viabilidade a partir da medula óssea. Este método utiliza Histopaque disponíveis comercialmente, que são a densidade de célula separada gradientemeios ração consistindo de Ficoll e diatrizoato de sódio, para separar os neutrófilos a partir da medula óssea de ratinhos. Este método produz números significativamente maiores de neutrófilos por ratinho em comparação com o sangue ou da cavidade abdominal, que pode ser utilizado para recolher os neutrófilos a partir de ratos, tanto no estado estacionário, ou após a infecção, e que é mais fácil a camada de comparação com o método de centrifugação em gradiente de densidade descontínuo que utiliza gradientes de Percoll consistem em 55% / 65% / 75% de Percoll em PBS ^9. Além disso, o tempo e os recursos necessários para recolher neutrófilos puras são significativamente diminuída comparada com o isolamento dos neutrófilos utilizando separação de células activada por fluorescência. Além disso, porque este método não envolve uma etapa de enriquecimento imunomagnética, é mais rentável, e evita a exposição das células à coluna magnética e anticorpos, diminuindo assim a probabilidade de activação de neutrófilos.

Além de realizar estudos funcionais de neutroph isoladoils ex vivo e transferência adoptiva de células em ratinhos receptores, este protocolo também descreve um método para a marcação de neutrófilos isolados, utilizando diferentes corantes CellTracker. Rotulagem diferencial de neutrófilos de ratos de diferentes origens genéticas pode ser adaptado em estudos de repovoamento competitivos para acompanhar os neutrófilos transferidos em tecidos de camundongos destinatário usando citometria de fluxo, o que pode fornecer uma visão mecanicista sobre o papel direto de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue em órgãos-alvo inflamadas ^6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Isolamento de rato Células da Medula Óssea

1. Eutanásia camundongos usando o protocolo cuidados com os animais da instituição comitê-aprovado e pulverizar a superfície animal com etanol 70%.
2. Realizar uma incisão da pele, em meados dos abdómen e remover a pele a partir da parte distal do rato, incluindo a pele que cobre as extremidades inferiores.
3. Cortar os músculos dos membros inferiores usando tesoura e deslocar cuidadosamente o acetábulo do quadril, evitando quebrar a cabeça do fêmur.
4. Remova os músculos remanescentes do fêmur e da tíbia utilizando um bisturi e tesoura e separar o fêmur da tíbia no joelho cuidado exercitar para não quebrar as extremidades ósseas. Colocar os ossos numa placa de Petri contendo gelada 1X RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina.
5. Prossiga com as seguintes etapas sob uma capa de cultura de tecidos. Tome precauções extras para manter técnicas estéreis rigorosas para evitar neutrophiativação l.
6. Lavar cada osso com etanol a 70% (dentro de uma placa de Petri), seguido de três lavagens subsequentes em PBS gelado (estéril dentro de placas de Petri) para enxaguar o etanol a partir da superfície dos ossos.
7. Dentro de uma placa de Petri estéril limpo, cortar as epífises dos ossos e mantê-los de lado.
8. Utilize uma agulha de calibre 25 e uma seringa de 12 cc cheio com meio RPMI suplementado com 10% de FBS e 2 mM de EDTA, e lave as células da medula óssea a partir de ambas as extremidades dos veios de osso em um ml de tampa de rosca tubo Falcon de 50 equipado com um 100 um filtrar. De modo a remover de forma eficiente todas as células, raspar a superfície interior dos ossos utilizando a agulha de calibre 25.

NOTA: O branqueamento dos ossos indica que as células tenham sido suficientemente raspada.

NOTA: Use aproximadamente 10 ml de mídia para liberar um fêmur / par tíbia. Adição de EDTA para o meio é essencial para prevenir a aglutinação das células.

9. Corte as epífises ósseasem pequenos 0,5-1 mm ³ peças com um bisturi e esmagá-los através do filtro 100 mM utilizando o back-end de um 2,5 ml Eppendorf Combitip Além disso Biopur ponteira.
10. Centrifugar a 1400 rpm durante 7 minutos a 4 ° C.
11. Lisar as células vermelhas do sangue por ressuspensão do sedimento celular em 20 ml de 0,2% de NaCl por aproximadamente 20 seg, seguido pela adição de 20 ml de 1,6% de NaCl. (Crítica: Não exceda 20-30 seg de lise hipotônica para evitar a morte de células de medula óssea O uso de NaCl para a lise hipotônica é recomendado em tampão de lise ACK porque este último tem o potencial de ativar os neutrófilos.).
12. Centrifugar durante 7 min a 1400 rpm a 4 ° C para recolher as células.
13. Lavar as células com meio RPMI 1640 suplementado com 1X SBF a 10% e EDTA 2 mM e centrifugar tal como no passo 1.12.
14. O rendimento de células da medula óssea, utilizando este método é cerca de 60-80 milhões por não infectado 8-12 semanas de idade C57BL / 6 mouse.

2. Separação de Neutrófilospor Gradiente de Densidade Centrifugação

1. Contar as células da medula óssea e ressuspender em 1 ml de PBS gelado estéril.
2. Adiciona-se 3 ml de Histopaque 1119 (densidade 1,119 g / ml) num tubo cónico de 15 ml.
3. Sobreposição de 3 ml de Histopaque 1077 (densidade 1,077 g / ml), em 3 ml de Histopaque 1119.

NOTA: Histopaque Histopaque 1119 e 1077 deve ser aquecida até 18-26 ° C antes da utilização.

Passo Crítica: Preparar gradientes imediatamente antes da utilização como preparação do gradiente com antecedência irá resultar em difusão entre as duas camadas e de pureza e recuperação de neutrófilos subóptima.

Passo Crítica: Sobreposição sobre Histopaque 1077 1119 precisa ser feito lentamente, a fim de evitar a mistura dos dois densidades, que não permita a separação de células, durante a centrifugação.

4. Sobrepor a suspensão de células de medula óssea no topo do Histopaque 1077.

Passo Crítico: Sobrecargaaying a suspensão de células de medula óssea sobre Histopaque 1077 precisa ser feito lentamente, a fim de evitar perturbar a interface entre as células e Histopaque 1077.

NOTA: Ressuspender as células da medula óssea de um rato infectado em 1 ml de PBS produz pureza dos neutrófilos de> 90%. No entanto, reunindo muitas amostras de medula óssea compromete a pureza dos neutrófilos, por exemplo, ressuspensão 300 x 10 ⁶ células em 3 ml de PBS, reduz a pureza dos neutrófilos a partir de> 90% para ~ 80%. Portanto, os investigadores devem realizar experiências-piloto para identificar a contagem / volume condições celulares ideais para seus experimentos específicos

5. Centrifugar durante 30 minutos a 2000 rpm a 25 ° C sem travagem.

NOTA: A centrifugação do gradiente à temperatura ambiente é fundamental e essencial para uma separação efectiva das neutrófilos.

6. Recolher os neutrófilos na interface do Histopaque 1119 e 1077 Histopaque camadas.
7. Lavar os neutrófilos colhidos duas vezes com RPMI 1640 suplementado com 1X SBF a 10% e 1% de penicilina / estreptomicina e centrifugar a 1400 rpm durante 7 minutos a 4 ° C.
8. Conte os neutrófilos e determinar sua viabilidade.

NOTA: Os neutrófilos são tipicamente> 95% viáveis ​​e> 90% de pureza tal como determinado por análise FACS. O rendimento típico de neutrófilos na medula óssea (isto é, 2 fémur e os ossos da tíbia 2) de uma não infectada 8-12 semanas de idade C57BL / 6 de rato é de ~ 6-12 milhões de células. Este número é substancialmente maior quando os neutrófilos são colhidas a partir da medula óssea de animais infectados. Assim, ~ 30-40000000 neutrófilos / mouse foram recuperados quando os ratos Candida infectados foram utilizados para a colheita de ⁶ células.

3. Rotulagem de neutrófilos utilizando corantes CellTracker

1. Ressuspender as neutrófilos a 5 x 10 ⁶ células / ml em PBS pré-aquecido a 37 ° C.
2. Adicionar um corante CellTracker numa concent definitivoração de 5 mM.

NOTA: CellTracker Verde (CMFDA (diacetato de 5-Chloromethylfluorescein) e CellTracker laranja (CMTMR (5 - (e-6)-4-clorometil tetrametilrodamina Amino benzoíla) foi utilizado neste protocolo para rotular diferencialmente os neutrófilos a partir de tipo selvagem e o gene deficiente ratinhos.

NOTA: Prepare uma solução estoque de 10 mM de Green CellTracker e CellTracker Orange, alíquotas e armazenar a -80 ° C até o dia do experimento.

3. Incubar neutrófilos com 5 uM do corante CellTracker correspondente durante 10 min a 37 ° C num banho de água com agitação no escuro.
4. Lave as células duas vezes com meio RPMI gelado 1X 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina.

NOTA: lavagem eficiente das células após o passo de marcação com o corante CellTracker é essencial para evitar a contaminação cruzada de corante antes de misturar populações de neutrófilos diferencialmente etiquetadas para Downstream estudos repovoamento competitivos.

4. Transferência adotiva de neutrófilos em camundongos e análise de neutrófilos transferidos por citometria de fluxo

1. Neutrófilos Ressuspender em PBS arrefecido com gelo, a uma concentração de 25 x 10 ⁶ células / ml e injectar 200 ul da suspensão para dentro da veia lateral da cauda de modo que 5 x 10 ⁶ neutrófilos são transferidos por ratinho. Para os estudos de neutrófilos de repovoamento competitivo, mistura neutrófilos de tipo selvagem e o gene deficiente em uma proporção de 1:1 e injectar um total de 5 x 10 ⁶ por ratinho neutrófilos como acima.

NOTA: pelo menos até 10 x 10 ⁶ de neutrófilos podem ser adoptivamente transferidos por ratinho sem toxicidade imediatamente óbvio para os animais.

2. Em diferentes momentos após a transferência adoptiva (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 horas após a transferência), eutanásia ratos e colheita de sangue e / ou medula óssea e / ou outros órgãos alvo (s) de interesse.
3. Prepare siAs suspensões de células ngle destes tecidos para análise quantitativa e qualitativa dos neutrófilos marcados adoptivamente transferidos utilizando protocolos publicados ^6,15.
4. Após vivo / morto a coloração de viabilidade e bloqueio Fc, as células de etiqueta com CD45 (clone 30-F11), Ly6G (clone 1A8) e CD11b (clone M1/70) e portão vivo na CD45 ^{+ +} CD11b ⁺ Ly6G neutrófilos. Os neutrófilos neste portão incluem neutrófilos nativas do ratinho receptor, bem como os neutrófilos marcados transferidas adoptivamente, que são ⁺ FITC (se marcado com CellTracker verde) ou PE ⁺ (se marcado com células Rastreio de laranja).

NOTA: Os neutrófilos podem ser rastreadas no sangue, medula óssea e do rim de ratinhos infectados com Cândida por pelo menos 4 horas após a transferência.

NOTA: A fixação com paraformaldeído a 2% em PBS, não afecta negativamente a intensidade de fluorescência média dos neutrófilos marcados com Gr CellTrackereen ou CellTracker laranja por pelo menos 48 horas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Este protocolo é otimizado para a colheita de células da medula óssea de camundongos e posterior separação de neutrófilos a partir dessas células por centrifugação em gradiente de densidade, utilizando meios de separação Histopaque celulares disponíveis no mercado. Os neutrófilos isolados utilizando este método pode ser usado para uma variedade de estudos funcionais a jusante ex vivo e para experiências de transferência adoptiva em ratinhos receptores.

O rendimento t...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Apresentamos aqui um protocolo seguro, simples, rápido e económico para o isolamento de grandes números de neutrófilos na medula óssea de ratinhos com elevado grau de pureza e viabilidade usando uma abordagem de centrifugação em gradiente de densidade. Quando este protocolo é realizado correctamente, ~ 6-12 x 10 ⁶ neutrófilos pode ser recuperado a partir de um rato não infectado e tantos como ~ 30-40 x 10 ⁶ neutrófilos podem ser isolados a partir de um rato após a infecção, ^6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Quality Biological Inc	351-027-101
0.2% and 1.6% sodium chloride	JT Baker	3624	Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Molecular Probes	L-23105	Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
			Materials
C57BL/6 mice	Taconic
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml syringes	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 mm cell strainers	BD Falcon	352360
Bactericidal Petri dishes	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)	Biomedical Research Instruments	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments sterilized prior to use
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Refrigerated centrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 °C shaking water bath	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.