Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Resumen

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Resumen

Los neutrófilos son las células efectoras críticas del sistema inmune innato. Ellos son reclutados rápidamente en sitios de inflamación aguda y ejercen efectos protectores o patógenos dependiendo del medio inflamatorio. No obstante, a pesar de la función indispensable de los neutrófilos en la inmunidad, la comprensión detallada de los factores moleculares que median efectos efectoras y inmunopatogénico neutrófilos 'en diferentes enfermedades infecciosas y condiciones inflamatorias que aún falta, en parte debido a su corta vida media, las dificultades con la manipulación de estos las células y la falta de protocolos experimentales fiables para la obtención de un número suficiente de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo y los experimentos de transferencia adoptiva. Por lo tanto, los métodos simples, rápidos, económicos y fiables son muy deseables para la recolección de un número suficiente de los neutrófilos de ratón para evaluar funciones como la fagocitosis, la matanza, la producción de citoquinas, degranulación y la trata. Para ese fin,se presenta un protocolo basado en centrifugación de gradiente de densidad reproducible, que se puede adaptar en cualquier laboratorio para aislar un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y viabilidad. Por otra parte, se presenta un protocolo simple que utiliza colorantes CellTracker para etiquetar los neutrófilos aislados, que pueden entonces ser transferidos de manera adoptiva en ratones receptores y rastreados en varios tejidos durante al menos 4 horas después de la transferencia usando citometría de flujo. El uso de este enfoque, el etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de tipo salvaje y deficiente en el gen con diferentes colorantes CellTracker se puede emplear con éxito para llevar a cabo estudios de repoblación competitivos para evaluar el papel directo de los genes específicos en el tráfico de los neutrófilos de la sangre a los tejidos diana in vivo .

Introducción

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en los seres humanos. Ellos son el principal componente celular del sistema inmune innato y actúan como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Los pacientes con neutropenia adquirida y las inmunodeficiencias primarias que afectan el número de neutrófilos y / o la función de desarrollar infecciones bacterianas y fúngicas invasoras que amenazan la vida, destacando la importancia de estas células en la defensa de acogida ^1. El reconocimiento inmune de patógenos invasores en el sitio de la infección por sus receptores de reconocimiento de patrones resultados análogos en la inducción de una respuesta inmune innata orquestada, lo que conduce a la secreción de factores quimiotácticos que generan un gradiente quimiotáctico capaz de reclutar neutrófilos de la circulación sanguínea en el tejido inflamado ² . Después de neutrófilos entran en el sitio de la infección, que se activan, lo que conduce a la producción de citoquinas y quimioquinas, la absorción de patógeno, y matar a través de mí oxidativo y no oxidativocanismos ^3. Además de su papel bien conocido en la inmunidad innata, los neutrófilos también se ha demostrado recientemente para desempeñar papeles importantes como iniciadores de la respuesta inmune adaptativa eficaces ^4. Por otro lado, además de sus funciones de protección en la inmunidad, los neutrófilos también pueden mediar la lesión tisular e inmunopatología debido a la acumulación excesiva y / o la activación a sitios de inflamación, como se muestra en una variedad de enfermedades infecciosas y autoinmunes ^5-7.

A pesar del papel indispensable de los neutrófilos en el montaje de la respuesta inmune innata eficaces y sus funciones efectoras pleiotrópicos en varias enfermedades infecciosas y afecciones inflamatorias, dificultades técnicas con el manejo de estas células y la falta de protocolos experimentales fiables ha dificultado la investigación con los neutrófilos en las últimas décadas. Por lo tanto, el uso de ensayos reproducibles para el aislamiento de los neutrófilos debería facilitar aún más la investigación sobre los neutrófilos mediada por inmunofunciones de lógica ex vivo e in vivo. Hasta la fecha, varios métodos han sido descritos para el aislamiento de neutrófilos, tales como centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana y la sangre o la médula ósea del ratón ^8,9, enriquecimiento inmunomagnética positivo o negativo de los neutrófilos de la sangre o la médula ósea del ratón ^10,11, y la cosecha de los neutrófilos de la cavidad peritoneal de los ratones después de la inyección intraperitoneal de tioglicolato o otros agentes inflamatorios ^12. Aunque los neutrófilos pueden ser fácilmente aislados en grandes cantidades a partir de sangre humana, este método es subóptima en ratones debido al volumen limitado de sangre de ratón que se opone a aislamiento de neutrófilos suficientes para estudios funcionales o experimentos de transferencia adoptiva ^13. Además, aunque el rendimiento de tioglicolato-suscitó las células de la cavidad peritoneal es mayor en comparación con la de la sangre del ratón, la pureza de los neutrófilos en el lavado peritoneal inflamatoria varía entre60-90%, y los neutrófilos aislados exhiben un fenotipo activado. Por lo tanto, las células recogidas usando este método sólo se puede utilizar para llevar a cabo estudios funcionales de activado, pero no de los neutrófilos no estimulados, como la cavidad peritoneal del ratón tiene pocos neutrófilos en el estado estacionario ^12. En su lugar, la médula ósea es un depósito conveniente para la recolección de un gran número de neutrófilos no estimulados o activados ya sea ^11,14, que luego se pueden utilizar para los estudios funcionales aguas abajo tales como la fagocitosis, la desgranulación y la matanza, o para la transferencia adoptiva en ratones receptores.

Aquí se describe un protocolo simple y rápido (~ 2 h), que proporciona un alto rendimiento (~ 6-12 × 10 ⁶ neutrófilos / ratón no infectado, o hasta 30-40 × 10 ⁶ neutrófilos / ratón infectado) puro de (80 -95%) los neutrófilos con> 95% de viabilidad de la médula ósea. Este método utiliza Histopaque disponibles comercialmente, que son la densidad de separación celular gradientemedios de racionamiento que consisten de Ficoll y diatrizoato de sodio, para separar los neutrófilos desde la médula ósea de los ratones. Este método produce un número significativamente mayor de neutrófilos por ratón en comparación con la sangre o la cavidad peritoneal, que puede ser utilizado para recoger los neutrófilos de ratones, tanto en estado estacionario o después de la infección, y es más fácil a la capa en comparación con el método de centrifugación en gradiente de densidad discontinuo que utiliza gradientes de Percoll que consisten de 55% / 65% / 75% de Percoll en PBS ^9. Además, el tiempo y los recursos necesarios para recoger los neutrófilos puras se redujo significativamente en comparación con el uso de aislamiento de neutrófilos activados por fluorescencia de clasificación de células. También, ya que este método no implica una etapa de enriquecimiento inmunomagnética, es más rentable, y que evita la exposición de las células a la columna magnética y anticuerpos, disminuyendo así la probabilidad de activación de neutrófilos.

Además de realizar estudios funcionales de neutroph aisladoILS ex vivo y la transferencia adoptiva de células en ratones receptores, este protocolo también describe un método para el etiquetado de los neutrófilos aislados utilizando diferentes colorantes CellTracker. Etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de diferentes orígenes genéticos se puede adaptar en los estudios de repoblación competitivos para el seguimiento de los neutrófilos transferidos en los tejidos de los ratones receptores usando citometría de flujo, que puede proporcionar una visión mecanicista sobre el papel directo de los genes específicos en el tráfico de neutrófilos de la sangre en órganos diana inflamadas ^6.

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Protocolo

1. Aislamiento de células de médula ósea de ratón

1. La eutanasia a los ratones que usan el protocolo de cuidado de animales de la institución comité aprobado y rociar la superficie del animal con 70% de etanol.
2. Hacer una incisión de la piel en la mitad del abdomen y quitar la piel de la parte distal del ratón incluyendo la piel que cubre las extremidades inferiores.
3. Cortar los músculos de las extremidades inferiores con unas tijeras y dislocar cuidadosamente el acetábulo de la articulación de la cadera, evitando romper la cabeza del fémur.
4. Quitar los músculos restantes del fémur y de la tibia con un bisturí y tijeras y separar del fémur de la tibia en la rodilla cuidado de las articulaciones ejercicio para no romper los extremos del hueso. Coloque los huesos en una placa de Petri que contiene medio RPMI enfriado con hielo 1640 1X suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina.
5. Continúe con los siguientes pasos bajo una campana de cultivo de tejidos. Tome precauciones adicionales para mantener estrictas técnicas estériles para evitar neutrophiactivación l.
6. Enjuague cada hueso con 70% de etanol (en una placa de Petri) seguido de tres lavados posteriores en PBS enfriado en hielo estéril (dentro de placas de Petri) para enjuagar el etanol a partir de la superficie de los huesos.
7. Dentro de una caja de Petri estéril limpio, cortar las epífisis de los huesos y mantener a un lado.
8. Utilice una aguja de calibre 25 y una jeringa de 12 cc llena con medio RPMI suplementado con 10% de FBS y 2 mM de EDTA, y lavar las células de médula ósea de ambos extremos de los ejes de hueso en un tornillo ml de la tapa del tubo Falcon de 50 equipado con un 100 micras filtrar. Con el fin de eliminar de manera eficiente todas las células, raspar la superficie interna de los huesos usando la aguja de calibre 25.

NOTA: El blanqueo de los huesos indica que las células han sido suficientemente raspado.

NOTA: Utilice aproximadamente 10 ml de medio para eliminar un fémur / la tibia par. Adición de EDTA para el medio es esencial para evitar la aglutinación de las células.

9. Cortar las epífisis óseasen pequeños pedazos 0.5-1 mm ³ con un bisturí y aplastar a través del filtro de 100 micras utilizando la parte de atrás de un 2,5 ml Eppendorf Combitip Plus Biopur punta de pipeta.
10. Centrifugar a 1400 rpm durante 7 min a 4 ° C.
11. Lisar las células rojas de la sangre mediante la resuspensión del sedimento celular en 20 ml de NaCl al 0,2% durante aproximadamente 20 segundos seguido por la adición de 20 ml de 1,6% de NaCl. (Crítica: No exceda 20-30 segundos de lisis hipotónica para evitar la muerte de células de médula ósea se recomienda el uso de NaCl para la lisis hipotónica sobre tampón de lisis ACK ya que este último tiene la posibilidad de activar los neutrófilos.).
12. Centrifugar durante 7 min a 1400 rpm a 4 ° C para recoger las células.
13. Lavar las células con medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 2 mM de EDTA y se centrifuga como en el paso 1,12.
14. El rendimiento de células de médula ósea utilizando este método es aproximadamente un 60-80 millones por no infectada 8-12 semanas de edad C57BL / 6 de ratón.

2. La separación de neutrófilospor centrifugación en gradiente de densidad

1. Contar las células de médula ósea y resuspender en 1 ml de PBS enfriado en hielo estéril.
2. Añadir 3 ml de Histopaque 1119 (densidad, 1,119 g / ml) en un tubo cónico de 15 ml.
3. Superposición de 3 ml de Histopaque 1077 (densidad, 1,077 g / ml) en el 3 ml de Histopaque 1119.

NOTA: Histopaque 1119 y Histopaque 1077 se deben calentar a 18-26 ° C antes de su uso.

Paso Crítico: Preparar gradientes inmediatamente antes de su uso como la preparación de la gradiente de antemano dará lugar a la difusión entre las dos capas y la pureza y la recuperación de neutrófilos subóptima.

Paso Crítico: Superposición de Histopaque 1077 más de 1.119 necesidades que ser hecho lentamente con el fin de evitar la mezcla de las dos densidades, que se oponen a la separación de células durante la centrifugación.

4. Superposición de la suspensión de células de médula ósea en la parte superior de la Histopaque 1077.

Paso Crítico: overlaying la suspensión de células de médula ósea sobre Histopaque 1077 queda mucho por hacer lentamente con el fin de evitar molestar a la interfaz entre las células y Histopaque 1077.

NOTA: La resuspensión células de médula ósea de un ratón no infectado en 1 ml de PBS produce neutrófilos pureza de> 90%. Sin embargo, la puesta en común muchas muestras de médula ósea compromete la pureza de los neutrófilos, por ejemplo, resuspendiendo x 10 ⁶ células 300 en 3 ml de PBS reduce la pureza de neutrófilos a partir de> 90% a ~ 80%. Por lo tanto, los investigadores deben realizar experiencias piloto para identificar las condiciones de conteo / volumen celular ideal para sus experimentos específicos

5. Centrifugar durante 30 min a 2000 rpm a 25 ° C sin freno.

NOTA: La centrifugación del gradiente a temperatura ambiente es crítica y esencial para la separación eficaz de los neutrófilos.

6. Recoger los neutrófilos en la interfaz de la Histopaque 1119 y Histopaque 1077 capas.
7. Lavar los neutrófilos recogidos dos veces con medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina y se centrifuga a 1400 rpm durante 7 min a 4 ° C.
8. Cuente los neutrófilos y determinar su viabilidad.

NOTA: Los neutrófilos son típicamente> 95% viable y> 90% puro según se determina por análisis FACS. El rendimiento típico de neutrófilos desde la médula ósea (es decir, 2 fémur y la tibia 2 huesos) de una no infectada 8-12 semanas de edad C57BL / 6 del ratón es ~ células 6-12.000.000. Este número es sustancialmente mayor cuando se cosechan los neutrófilos desde la médula ósea de los animales infectados. Por lo tanto, ~ 30-40 millones de neutrófilos / ratón se recuperaron cuando se utilizaron ratones infectados por Candida para la cosecha de ⁶ celdas.

3. Etiquetado de los neutrófilos con colorantes CellTracker

1. Resuspender los neutrófilos a 5 x 10 ⁶ células / ml en PBS precalentado a 37 º C.
2. Añadir un tinte CellTracker a una concent definitivaración de 5 mM.

NOTA: CellTracker Green (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein Diacetate) y CellTracker Orange (CMTMR (5 - (y-6)-4-clorometil tetrametilrodamina Amino benzoilo) fue utilizada en este protocolo para etiquetar diferencialmente neutrófilos de tipo salvaje y el gen deficiente ratones.

NOTA: Se prepara una solución madre de 10 mM de CellTracker verde y CellTracker Orange, alícuota y almacenar a -80 ° C hasta el día del experimento.

3. Incubar los neutrófilos con 5 M del colorante CellTracker correspondiente durante 10 min a 37 ° C en un baño de agua con agitación en la oscuridad.
4. Lavar las células dos veces con helado de medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina.

NOTA: un lavado eficaz de las células después es esencial el paso marcado con el colorante CellTracker para evitar la contaminación cruzada de tinte antes de mezclar poblaciones de neutrófilos diferencialmente etiquetados para amortizacionesestudios de repoblación competitivos tream.

4. La transferencia adoptiva de neutrófilos en ratones y análisis de neutrófilos transferidos mediante citometría de flujo

1. Volver a suspender las neutrófilos en PBS enfriado en hielo a una concentración de 25 x 10 ⁶ células / ml e inyectar 200 l de la suspensión en la vena lateral de la cola de manera que 5 x 10 ⁶ neutrófilos se transfieren por ratón. Para los estudios de neutrófilos repoblación competitivos, mezcle los neutrófilos de tipo salvaje y el gen deficiente en una proporción de 1:1 y se inyecta un total de 5 x 10 ⁶ neutrófilos por ratón como arriba.

NOTA: Por lo menos hasta 10 x 10 ⁶ neutrófilos pueden adoptiva transferidos por ratón sin toxicidad evidente inmediato a los animales.

2. En diferentes momentos después de la transferencia adoptiva (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 horas después de la transferencia), la eutanasia a los ratones y la sangre de la cosecha, y / o la médula ósea y / o de otro órgano diana (s) de interés.
3. Preparar sisuspensiones de células NGLE de estos tejidos para el análisis cuantitativo y cualitativo de los neutrófilos transferidas adoptivamente etiquetados utilizando protocolos publicados ^6,15.
4. Tras la tinción vivo / muerto viabilidad y bloqueo Fc, marcar células con CD45 (clon 30-F11), Ly6G (clon 1A8) y CD11b (clon M1/70) y la puerta en vivo ⁺ CD45 ⁺ CD11b ⁺ Ly6G neutrófilos. Los neutrófilos en esta puerta incluyen neutrófilos nativas del ratón receptor, así como los neutrófilos marcados adoptivamente transferidas, que son FITC ⁺ (si etiquetado con CellTracker verde) o PE ⁺ (si etiquetado con la célula Rastreador de naranja).

NOTA: Los neutrófilos pueden ser rastreados en la sangre, la médula ósea y el riñón de los ratones infectados con Candida durante al menos 4 horas después de la transferencia.

NOTA: La fijación con 2% de paraformaldehído en PBS no afecta adversamente a la intensidad de fluorescencia media de los neutrófilos marcados con Gr. CellTrackereen o CellTracker naranja durante al menos 48 horas.

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Resultados

Este protocolo se ha optimizado para la cosecha de células de médula ósea de los ratones y la posterior separación de los neutrófilos de estas células por centrifugación en gradiente de densidad utilizando Histopaque medios de separación de células disponibles comercialmente. Los neutrófilos aislados utilizando este método se puede utilizar para una variedad de estudios de aguas abajo funcional ex vivo y para los experimentos de transferencia adoptiva en ratones receptores.

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Discusión

En este documento se presenta un protocolo fiable, sencillo, rápido y económico para el aislamiento de un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y la viabilidad utilizando un enfoque de centrifugación en gradiente de densidad. Cuando este protocolo se lleva a cabo correctamente, ~ 6-12 × 10 ⁶ neutrófilos pueden ser recuperados de un ratón no infectado y un máximo de ~ 30-40 × 10 ⁶ neutrófilos pueden aislarse a partir de un ratón después de la infec...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Quality Biological Inc	351-027-101
0.2% and 1.6% sodium chloride	JT Baker	3624	Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Molecular Probes	L-23105	Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
			Materials
C57BL/6 mice	Taconic
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml syringes	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 mm cell strainers	BD Falcon	352360
Bactericidal Petri dishes	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)	Biomedical Research Instruments	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments sterilized prior to use
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Refrigerated centrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 °C shaking water bath	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.