Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

Riepilogo

Si descrive un protocollo per l'isolamento e la purificazione di neutrofili dal midollo osseo di topo per centrifugazione in gradiente di densità e di etichettatura neutrofili utilizzando coloranti CellTracker. Questo rappresenta un metodo semplice e veloce, riproducibile ed economico per ottenere un gran numero di neutrofili per studi funzionali a valle o di trasferimento ed inseguimento esperimenti adottive.

Abstract

Neutrofili sono cellule critiche effettrici del sistema immunitario innato. Sono rapidamente reclutati ai siti di infiammazione acuta e esercitano effetti protettivi o patogeni seconda del milieu infiammatorio. Tuttavia, nonostante il ruolo indispensabile dei neutrofili nel sistema immunitario, la comprensione dettagliata dei fattori molecolari che mediano gli effetti effettrici e immunopatogenici neutrofili 'in diverse malattie infettive e le condizioni infiammatorie che ancora manca, in parte a causa della loro breve emivita, le difficoltà con la gestione di questi celle e la mancanza di protocolli sperimentali affidabili per ottenere un numero sufficiente di neutrofili per studi funzionali a valle e gli esperimenti di trasferimento adottivo. Pertanto, metodi semplici, veloci, economici e affidabili sono altamente desiderabile per la raccolta di un numero sufficiente di neutrofili del mouse per valutare funzioni quali la fagocitosi, l'uccisione, la produzione di citochine, degranulazione e il traffico. A tal fine,vi presentiamo un protocollo riproducibile gradiente di densità centrifugazione a base, che può essere adattato in qualsiasi laboratorio per isolare un gran numero di neutrofili dal midollo osseo di topi con elevata purezza e vitalità. Inoltre, vi presentiamo un semplice protocollo che utilizza coloranti CellTracker per etichettare i neutrofili isolati, che possono poi essere trasferiti adoptively in topi riceventi e monitorati in diversi tessuti per almeno 4 ore post-trasferimento in citometria a flusso. Usando questo approccio, l'etichettatura differenziale dei neutrofili da topi wild-type e gene-deficienti con diversi coloranti CellTracker può essere impiegato con successo per eseguire studi di ripopolamento della concorrenza per valutare il ruolo diretto di geni specifici nel traffico di neutrofili dal sangue nei tessuti bersaglio in vivo .

Introduzione

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nell'uomo. Essi sono la principale componente cellulare del sistema immunitario innato e ad agire come una prima linea di difesa contro l'invasione dei microrganismi. I pazienti con neutropenia acquisita e immunodeficienze primarie che interessano i numeri dei neutrofili e / o funzione di sviluppare infezioni invasive potenzialmente letali batteriche e fungine, mettendo in evidenza l'importanza di queste cellule in serie della difesa ^1. Riconoscimento immune di patogeni nel sito dell'infezione dai loro cognate di riconoscimento di recettori risultati nella induzione di una risposta immunitaria innata orchestrato, che porta alla secrezione di fattori chemiotattici che generano un gradiente chemiotattico capace di reclutare neutrofili dal sangue nel tessuto infiammato ² . Dopo neutrofili entrano nel sito dell'infezione, diventano attivate, che porta a citochine e chemochine, assorbimento patogeno, e uccidendo via ossidativa e non ossidativa mechanisms ^3. Oltre al loro ruolo ben riconosciuto nella immunità innata, i neutrofili sono stati anche recentemente dimostrato di svolgere ruoli importanti come iniziatori di efficaci risposte immunitarie adattative ^4. D'altra parte, a prescindere dai loro ruoli protettivi nell'immunità, neutrofili possono anche mediare il danno tissutale e immunopatologia causa di un eccessivo accumulo e / o l'attivazione ai siti di infiammazione, come mostrato in una varietà di malattie infettive e autoimmuni ^5-7.

Nonostante il ruolo indispensabile dei neutrofili nel montaggio efficaci risposte immunitarie innate e le loro funzioni effettrici pleiotropici in diverse malattie infettive e le condizioni infiammatorie, difficoltà tecniche con la gestione di queste cellule e la mancanza di protocolli sperimentali affidabili ha ostacolato la ricerca con neutrofili nel corso degli ultimi decenni. Pertanto, l'uso di test riproducibili per l'isolamento dei neutrofili dovrebbe facilitare ulteriormente la ricerca sui mediato dai neutrofili immunologicigica funzioni ex vivo e in vivo. Ad oggi, diversi metodi sono stati descritti per l'isolamento dei neutrofili come la densità centrifugazione in gradiente di sangue umano e mouse o midollo osseo ^8,9, arricchimento immunomagnetico positivo o negativo di neutrofili dal sangue o midollo osseo del mouse ^10,11, e raccolta di neutrofili dalla cavità peritoneale di topi dopo iniezione intraperitoneale di tioglicolato o altri agenti infiammatori ^12. Sebbene neutrofili possono essere facilmente isolati in gran numero da sangue umano, questo metodo è subottimale nei topi a causa delle ridotte dimensioni di sangue topo che preclude l'isolamento dei neutrofili sufficienti per studi funzionali o esperimenti trasferimento adottivo ^13. Inoltre, anche se la resa di tioglicolato-suscitato cellule dalla cavità peritoneale è maggiore rispetto a quella del sangue topo, la purezza dei neutrofili nel lavaggio peritoneale infiammatoria varia tra60-90%, ed i neutrofili isolati esibiscono un fenotipo attivato. Così, le cellule raccolte mediante questo metodo può essere utilizzato solo per l'esecuzione di studi funzionali di attivazione, ma non di neutrofili non stimolati, come la cavità peritoneale del mouse ha pochi neutrofili alla stato stazionario ^12. Invece, il midollo osseo è un serbatoio per la raccolta conveniente tantissimi sia non stimolate o attivati ​​neutrofili ^11,14, che possono poi essere utilizzati per studi funzionali valle come fagocitosi, uccisione e degranulazione, o per il trasferimento adottivo in topi riceventi.

Qui descriviamo un semplice e veloce (circa 2 ore) il protocollo, che prevede un alto rendimento (~ 6-12 × 10 ⁶ neutrofili / topo infetto, o fino a 30-40 × 10 ⁶ neutrofili / topo infetto) di puro (80 -95%) con neutrofili> 95% della vitalità dal midollo osseo. Questo metodo utilizza commercialmente disponibile Histopaque, che sono cellule gradiente di densità sepasupporti razione composto da Ficoll e diatrizoato sodio, per separare i neutrofili dal midollo osseo di topi. Questo metodo fornisce significativamente più grande numero di neutrofili per topo rispetto al sangue o cavità peritoneale, può essere utilizzata per raccogliere neutrofili da topi sia in stato stazionario o dopo l'infezione, ed è più facile strato rispetto al metodo di centrifugazione in gradiente di densità che utilizza discontinuo gradienti percoll composto da 55% / 65% / 75% Percoll in PBS ^9. Inoltre, il tempo e le risorse necessarie per raccogliere i neutrofili puri sono significativamente diminuiti rispetto all'isolamento dei neutrofili mediante Fluorescence-Activated cella Ordinamento. Inoltre, poiché questo metodo non comporta un passaggio di arricchimento immunomagnetico, è più conveniente, ed evita l'esposizione delle cellule a colonna magnetica e anticorpi, diminuendo così la probabilità di attivazione dei neutrofili.

Oltre a eseguire studi funzionali di neutroph isolatoils ex vivo e il trasferimento adottivo di cellule in topi riceventi, questo protocollo descrive anche un metodo per l'etichettatura dei neutrofili isolati utilizzando diversi coloranti CellTracker. Etichettatura differenziale dei neutrofili da topi di vari background genetico può essere adattato in studi ripopolamento competitivi per il monitoraggio dei neutrofili trasferiti nei tessuti di topi riceventi tramite citometria a flusso, che può fornire la comprensione meccanicistica sul ruolo diretto di geni specifici nel traffico di neutrofili dal sangue in bersaglio organi infiammati ^6.

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Protocollo

1. Isolamento del midollo osseo di topo cellule

1. Euthanize topo, utilizzando il protocollo di cura degli animali dell'istituzione comitato-approvato e spruzzare la superficie degli animali con il 70% di etanolo.
2. Fare una incisione della pelle nella metà addome e togliere la pelle dalla parte distale del topo compresa la pelle che copre le estremità inferiori.
3. Tagliare i muscoli delle estremità inferiori con le forbici e dislocare attentamente dell'acetabolo dall'articolazione dell'anca, evitando di rompere la testa del femore.
4. Togliere i muscoli rimanenti dal femore e tibia con un bisturi e forbici e separare il femore dalla tibia al ginocchio cura esercizio congiunto per non rompere le estremità delle ossa. Posizionare le ossa in una capsula di Petri contenente ghiacciata RPMI 1640 supplementato con 1X 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina.
5. Procedere con i seguenti passi sotto una cappa di coltura di tessuti. Prendere precauzioni extra per mantenere severe tecniche sterili per evitare neutrophil attivazione.
6. Lavare ogni osso con etanolo al 70% (entro una capsula Petri) seguito da tre successivi lavaggi in ghiacciata PBS sterile (entro piastre Petri) per risciacquare l'etanolo dalla superficie delle ossa.
7. All'interno di un piatto pulito sterile Petri, tagliare le epifisi delle ossa e tenerli da parte.
8. Utilizzare un ago calibro 25 e una siringa 12 cc riempito con RPMI supplementato con 10% FBS e 2 mM EDTA, e lavare le cellule del midollo osseo da entrambe le estremità degli alberi su un osso ml vite tubo superiore 50 Falcon equipaggiato di 100 pm filtrare. Al fine di rimuovere efficacemente tutte le cellule, raschiare la superficie interna delle ossa utilizzando l'ago calibro 25.

NOTA: imbiancamento delle ossa indica che le cellule sono state sufficientemente raschiate.

Nota: utilizzare circa 10 ml di mezzi per irrigare un femore / tibia coppia. Aggiunta di EDTA al mezzo è essenziale per evitare grumi delle cellule.

9. Tagliare le epifisi delle ossain piccoli 0,5-1 mm ³ pezzi con un bisturi e sfondare il filtro 100 micron con il back-end di un 2,5 ml Eppendorf Biopur Combitip plus punta della pipetta.
10. Centrifugare a 1400 rpm per 7 minuti a 4 ° C.
11. Lisare i globuli rossi da risospendere il pellet cellulare in 20 ml di NaCl 0,2% per circa 20 secondi, seguita da aggiunta di 20 ml di 1,6% NaCl. (Critico: non superare il 20-30 sec di lisi ipotonica per evitare la morte delle cellule del midollo osseo si raccomanda l'uso di ipotonica di NaCl per lisi più buffer di lisi ACK perché quest'ultimo ha la possibilità di attivare i neutrofili.).
12. Centrifugare per 7 min a 1400 rpm a 4 ° C per raccogliere le cellule.
13. Lavare le cellule con 1X RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e 2 mM EDTA e centrifugare come al punto 1.12.
14. La resa di cellule del midollo osseo che utilizzano questo metodo è circa 60-80 milioni di euro non infetto 8-12 settimane di età C57BL / 6 del mouse.

2. Separazione dei neutrofilidalla centrifugazione in gradiente di densità

1. Contare le cellule del midollo osseo e risospendere in 1 ml di ghiacciata PBS sterile.
2. Aggiungere 3 ml di Histopaque 1119 (densità 1,119 g / ml) in una provetta conica da 15 ml.
3. Sovrapposizione 3 ml di Histopaque 1077 (densità, 1,077 g / ml) sulla 3 ml di Histopaque 1119.

NOTA: Histopaque il 1119 e il 1077 Histopaque deve essere portata a 18-26 ° C prima dell'uso.

Fase critica: Preparare gradienti immediatamente prima dell'uso come preparare il gradiente in anticipo comporterà diffusione tra i due strati e non ottimale purezza neutrofili e recupero.

Critical Passo: Sovrapposizione Histopaque 1077 oltre 1119 deve essere fatto lentamente in modo da evitare di mescolare le due densità, che impedisca la separazione delle cellule durante la centrifugazione.

4. Sovrapporre il midollo osseo sospensione cellulare in cima alla Histopaque 1077.

Critical Passo: OVERLaying midollo osseo sospensione cellulare sopra Histopaque 1077 deve essere fatto lentamente per evitare di disturbare l'interfaccia tra le cellule e HISTOPAQUE 1077.

NOTA: La risospensione cellule di midollo osseo da un mouse non infetti in 1 ml di PBS produce purezza neutrofili> 90%. Tuttavia, pool molti campioni di midollo osseo compromette purezza neutrofili, per esempio, risospendere 300 x 10 ⁶ cellule in 3 ml di PBS riduce purezza neutrofili da> 90% a ~ 80%. Pertanto, gli investigatori dovrebbero eseguire esperimenti pilota per identificare il conteggio / volume delle cellule condizioni ideali per le loro specifiche esperienze

5. Centrifugare per 30 min a 2000 rpm a 25 ° C senza freno.

NOTA: La centrifugazione del gradiente a temperatura ambiente è fondamentale ed essenziale per una efficace separazione dei neutrofili.

6. Raccogliere i neutrofili a livello di interfaccia del Histopaque il 1119 e il 1077 Histopaque strati.
7. Lavare i neutrofili raccolti due volte con RPMI 1640 supplementato con 10 1X% FBS e 1% di penicillina / streptomicina e centrifugare a 1400 rpm per 7 minuti a 4 ° C.
8. Contare i neutrofili e determinare la loro vitalità.

NOTA: I neutrofili sono tipicamente> 95% vitali e> 90% puro, come determinato mediante analisi FACS. La resa tipica di neutrofili dal midollo osseo (cioè 2 femore e tibia ossa 2) di una non infetta 8-12 settimane di età C57BL / 6 mouse è ~ 6-12.000.000 cellule. Questo numero è notevolmente maggiore quando i neutrofili sono raccolte dal midollo osseo di animali infetti. Quindi, ~ 30-40 milioni di neutrofili / topo sono stati recuperati quando i topi con infezione da Candida sono stati utilizzati per la raccolta di cellule ^6.

3. Etichettatura dei neutrofili utilizzando coloranti CellTracker

1. Risospendere le neutrofili a 5 x 10 ⁶ cellule / ml in PBS preriscaldato a 37 ° C.
2. Aggiungi un colorante CellTracker ad un concent finalerazione di 5 micron.

NOTA: CellTracker Verde (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein Diacetato) e CellTracker Orange (CMTMR (5 - (e-6)-4-Chloromethyl benzoile Tetramethylrhodamine Amino) è stato utilizzato in questo protocollo per etichettare in modo differenziale neutrofili da wild-type e gene-carente topi.

NOTA: Preparare una soluzione stock di 10 mM di CellTracker Verde e CellTracker Arancione, aliquota, e conservare a -80 ° C fino a quando il giorno dell'esperimento.

3. Incubare neutrofili con 5 pM del colorante CellTracker corrispondente per 10 min a 37 ° C in un bagno d'acqua nel buio.
4. Lavare le cellule due volte con ghiacciata RPMI 1640 supplementato con 1X 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina.

NOTA: Un lavaggio efficace delle cellule dopo il passo di etichettatura con il colorante CellTracker è essenziale per evitare la contaminazione incrociata colorante prima della miscelazione popolazioni neutrofili differenzialmente etichettati per bassitream studi ripopolamento competitivi.

4. Trasferimento adottivo di neutrofili in Mouse e analisi dei neutrofili trasferiti mediante citometria a flusso

1. Neutrofili Risospendere in PBS freddo ad una concentrazione di 25 x 10 ⁶ cellule / ml e iniettare 200 microlitri della sospensione nella vena caudale laterale in modo che 5 x 10 ⁶ neutrofili sono trasferiti per topo. Per gli studi di neutrofili ripopolamento competitivi, mescolare neutrofili wild-type e gene-carente in un rapporto di 1:1 e iniettare un totale di 5 x 10 ⁶ neutrofili per topo come sopra.

NOTA: almeno fino a 10 x 10 ⁶ neutrofili possono essere adoptively trasferiti per il mouse senza evidente tossicità immediate agli animali.

2. In tempi diversi dopo trasferimento adottivo (ad esempio 1, 2, 3 o 4 ore post-transfer), eutanasia topi e sangue raccolto, e / o midollo osseo e / o di altro organo bersaglio (s) di interesse.
3. Preparare SIsospensioni cellulari NGLE di questi tessuti per l'analisi quantitativa e qualitativa dei neutrofili etichettati adoptively trasferiti utilizzando pubblicato protocolli ^6,15.
4. Seguendo vivo / morto colorazione viabilità e blocco Fc, etichettare le cellule con CD45 (clone 30-F11), Ly6G (clone 1A8) e CD11b (M1/70 clone) e porta sul vivo CD45 ⁺ Ly6G ⁺ CD11b ⁺ neutrofili. I neutrofili in questo cancello includono neutrofili nativi del mouse destinatario, nonché i neutrofili etichettati adoptively trasferiti, che sono ⁺ FITC (se etichettato con CellTracker verde) o PE ⁺ (se etichettato con Cell Tracker arancione).

NOTA: I neutrofili possono essere rintracciati nel sangue, midollo osseo e rene di topi Candida-infettati per almeno 4 ore post-trasferimento.

NOTA: Fissaggio con 2% paraformaldeide in PBS non alterino la media intensità di fluorescenza dei neutrofili etichettati con CellTracker Green o CellTracker Arancione per almeno 48 ore.

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Risultati

Questo protocollo è ottimizzato per la raccolta di cellule di midollo osseo di topo e la successiva separazione di neutrofili dal queste cellule mediante centrifugazione in gradiente di densità utilizzando commercialmente disponibili mezzi di separazione cellulare HISTOPAQUE. Neutrofili isolati usando questo metodo può essere utilizzato per una varietà di valle studi ex vivo e funzionale per esperimenti trasferimento adottivo in topi riceventi.

La resa tipica di raccolta delle c...

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Discussione

Qui vi presentiamo un semplice protocollo affidabile, veloce ed economico per l'isolamento di un gran numero di neutrofili dal midollo osseo di topi con elevata purezza e vitalità utilizzando un approccio di centrifugazione in gradiente di densità. Quando questo protocollo è eseguita correttamente, ~ 6-12 × 10 ⁶ neutrofili possono essere recuperati da un mouse non infetto e fino a ~ 30-40 × 10 ⁶ neutrofili possono essere isolati da un topo dopo l'infezione ^6. I neutrofili is...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Quality Biological Inc	351-027-101
0.2% and 1.6% sodium chloride	JT Baker	3624	Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Molecular Probes	L-23105	Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
			Materials
C57BL/6 mice	Taconic
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml syringes	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 mm cell strainers	BD Falcon	352360
Bactericidal Petri dishes	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)	Biomedical Research Instruments	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments sterilized prior to use
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Refrigerated centrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 °C shaking water bath	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.