JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы опишем протокол для выделения и очистки нейтрофилов из костного мозга мыши центрифугированием в градиенте плотности и нейтрофилов мечение с применением CellTracker красителей. Это представляет собой простой, быстрый, воспроизводимые и экономичный способ получения большого количества нейтрофилов для последующих функциональных исследований или экспериментов приемных передачи и отслеживания.

Аннотация

Нейтрофилы являются критическими эффекторные клетки врожденной иммунной системы. Они быстро набраны на участках острое воспаление и оказывают защитное или патогенных эффектов в зависимости от воспалительной среде. Тем не менее, несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в иммунитете, детальное понимание молекулярных факторов, которые обеспечивают нейтрофилов и эффекторные immunopathogenic эффектов в различных инфекционных заболеваний и воспалительных заболеваний по-прежнему отсутствует, отчасти потому, что их короткий период полураспада, трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов для получения достаточного количества нейтрофилов ниже по течению функциональных исследований и экспериментов приемных передачи. Таким образом, простой, быстрый, экономичный и надежный методы являются очень желательными для сбора достаточного количества нейтрофилов мыши для оценки функции, такие как фагоцитоз, убийства, продукция цитокинов, дегрануляцию и торговли людьми. С этой целью,Мы представляем воспроизводимый центрифугирования в градиенте плотности на основе протокола, который может быть адаптирован в любой лаборатории изолировать большое количество нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой степенью чистоты и жизнеспособности. Кроме того, предложен простой протокол, который использует CellTracker красителей для обозначения изолированных нейтрофилов, которые затем могут быть адаптивно переносили в мышей-реципиентов и отслеживаться в некоторых тканях, по крайней мере, 4 ч после передачи с использованием проточной цитометрии. Используя этот подход, дифференциальные маркировки нейтрофилов из дикого типа и генов-дефицитных мышей с различными красителями CellTracker может быть успешно использован для выполнения конкурентоспособных исследований репопуляцию для оценки непосредственную роль определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в ткани-мишени в естественных условиях .

Введение

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов у людей. Они являются основным клеточным компонентом врожденной иммунной системы и выступают в качестве первой линии защиты от вторжения микроорганизмов. Пациенты с приобретенными нейтропения и первичных иммунодефицитов, которые влияют нейтрофилов номера и / или функции развиваются угрожающие жизни инвазивных бактериальных и грибковых инфекций, подчеркнув важность этих клеток в иммунной защиты 1. Иммунный признание вторжения патогенных микроорганизмов на инфекцию сайта, их родственными распознавания рецепторами приводит к индукции организованной врожденный иммунный ответ, что приводит к секреции хемоаттрактанты которые генерируют градиента хемотаксических способны вербовку нейтрофилов из крови в воспаленную ткань 2 . После нейтрофилов ввести инфекцию сайт, они активизируются, что приводит к цитокинов и хемокинов, патоген поглощение, и убивают через окислительную и неокислительный меняchanisms 3. Кроме того, их хорошо узнаваемая роль во врожденном иммунитете, нейтрофилы также недавно было показано, играют важную роль в качестве инициаторов эффективной адаптивного иммунного ответа 4. С другой стороны, помимо их роли в защитный иммунитет, нейтрофилы могут также посредником повреждение тканей и иммунопатологии из-за чрезмерного накопления и / или активации на участках воспаления, как показано в различных инфекционных и аутоиммунных заболеваний 5-7.

Несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в монтаже эффективной врожденного иммунного ответа и их плейотропную эффекторных функций многих инфекционных заболеваний и воспалительных состояний, технические трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов препятствовал исследование с нейтрофилов в течение последних десятилетий. Таким образом, использование воспроизводимых анализов для выделения нейтрофилов должно облегчить дальнейшее исследование нейтрофилов-опосредованного immunoloческие функции бывших естественных условиях и в естественных условиях. На сегодняшний день несколько методов были описаны для выделения нейтрофилов, такие как центрифугирование в градиенте плотности крови человека и мыши крови или костного мозга 8,9, положительный или отрицательный иммуномагнитного обогащение нейтрофилов из крови мыши или костного мозга 10,11, и сбор нейтрофилов из брюшной полости мышей после внутрибрюшинной инъекции тиогликолята или других противовоспалительных агентов 12. Хотя нейтрофилов может быть легко выделено в больших количествах из крови человека, этот метод является оптимальным у мышей из-за ограниченного объема крови мышей, что исключает выделение достаточного нейтрофилов для функциональных исследований или приемные экспериментов передачи 13. Кроме того, хотя выход тиогликолята-вызывали клетки из брюшной полости больше по сравнению с крови мышей, чистота нейтрофилов в воспалительном перитонеального лаважа изменяется между60-90%, а изолированный нейтрофилы проявляют активированный фенотип. Таким образом, клетки собирали с использованием этого метода может быть использован только для выполнения функциональных исследований активированных но не стимулированных нейтрофилов, как мышь брюшную полость имеет несколько нейтрофилов в стационарном состоянии 12. Вместо этого, костный мозг является удобным резервуар для сбора большого количества или стимулированных или активированный 11,14 нейтрофилы, которые затем могут быть использованы для последующих функциональных исследований, таких как фагоцитоз, убийства и дегрануляции или для приемных передачи в получатель мышей.

Здесь мы описываем простой и быстрый (~ 2 ч) протокол, который обеспечивает высокий выход (~ 6-12 × 10 6 нейтрофилов / неинфицированных мышей, или до 30-40 × 10 6 нейтрофилов / инфицированные мыши) чистого (80 -95%) нейтрофилов> 95% жизнеспособность из костного мозга. Этот метод использует коммерчески доступные Histopaque, которые в градиенте плотности ячейки отдельнорацион сред, состоящих из Ficoll и натрий диатризоат, отделить нейтрофилов из костного мозга мышей. Этот метод дает значительно большее количество нейтрофилов на мышь по сравнению с полостью крови или перитонеального, он может быть использован для сбора нейтрофилов у мышей и в стационарном состоянии или после инфекции и легче слое по сравнению с центрифугирование в градиенте плотности метод, который использует прерывистый перколлом градиенты, состоящий из 55% / 65% / 75% Percoll в PBS 9. Кроме того, время и ресурсы, необходимые для сбора чистой нейтрофилов значительно снизился по сравнению с выделения нейтрофилов с помощью флуоресцентной-Активированный сортировки клеток. Кроме того, поскольку этот способ не включать иммуномагнитного шаг обогащения, это более экономически эффективным, и это позволяет избежать воздействия на клетки магнитного колонку и антитела, таким образом уменьшая вероятность активации нейтрофилов.

В дополнение к выполнению функциональных исследований изолированной neutrophшек исключая виво и приемных передачи клеток в мышей-реципиентов, этот протокол также описывает способ маркировки изолированных нейтрофилов с использованием различных красителей CellTracker. Дифференциальный маркировки нейтрофилов у мышей различных генетических фоны могут быть адаптированы в конкурентных исследований репопуляцию для отслеживания переданных нейтрофилов в тканях мышей-реципиентов с использованием проточной цитометрии, которые могут обеспечить механистической представление о непосредственной роли определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в целевые воспаленных органов 6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Выделение клеток костного мозга мыши

  1. Усыпить мышей с использованием уход за животными учреждения Комитета, утвержденных протоколом и распылить животного поверхность с 70% этанола.
  2. Сделайте надрез кожи в середине живота и удалить кожу от дистальной части мыши в том числе кожного покрова нижних конечностей.
  3. Отрежьте от мышц нижних конечностей с помощью ножниц и тщательно вывихнуть вертлужной впадины от тазобедренного сустава, в то время как избежать нарушения бедренной кости головы.
  4. Удалите оставшиеся мышцы бедра и голени с помощью скальпеля и ножниц и отделите от бедренной кости голени в коленном суставе работы следите, чтобы не нарушить концами кости. Поместите кости в чашку Петри, содержащую ледяную RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина.
  5. Переходим к следующему шагу под капот культуры ткани. Принять дополнительные меры предосторожности для поддержания строгих стерильных методов, чтобы избежать neutrophiL активации.
  6. Промыть каждую кость с 70% этанола (в чашке Петри), а затем трех последующих промывок в ледяной стерильной PBS (в чашках Петри), чтобы смыть этанола с поверхности костей.
  7. Внутри чистые стерильные чашки Петри, отрезать эпифизов костей и держать их в сторону.
  8. Использование игла 25-и 12 мл шприц с RPMI с добавлением 10% FBS и 2 мМ ЭДТА, и промыть клетки костного мозга с обоих концов кости валов на 50 мл с завинчивающейся крышкой трубки сокола оснащена 100 мкм процедить. Для того чтобы эффективно удалить все клетки, очистить внутреннюю поверхность кости использованием 25-иглы.

Примечание: Бланширование костей показывает, что клетки были достаточно соскабливают.

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте примерно 10 мл среды для промывки бедра / голени пары. Добавление ЭДТА в среду важно предотвратить слипание клеток.

  1. Разрежьте эпифизов костейв небольших 0,5-1 мм 3 шт с помощью скальпеля и разбить их через 100 мкм фильтр, используя заднюю часть 2,5 мл Eppendorf Combitip Plus Biopur пипетки.
  2. Центрифуга при 1400 оборотов в минуту в течение 7 минут при 4 ° C.
  3. Лизируйте эритроцитов путем ресуспендирования осадка клеток в 20 мл 0,2% NaCl в течение приблизительно 20 сек с последующим добавлением 20 мл 1,6% NaCl. (Критический: не превышает 20-30 сек гипотонического лизиса, чтобы избежать клеток костного мозга смерти использование гипотонических NaCl для лизиса рекомендуется вместо ACK буфера лизирующие поскольку последний имеет потенциал, чтобы активировать нейтрофилы.).
  4. Центрифуга в течение 7 минут при 1400 оборотов в минуту при 4 ° С дл сбора клеток.
  5. Мытье клеток RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 2 мМ ЭДТА и центрифугируют, как в пункте 1.12.
  6. Выход клеток костного мозга с помощью этого метода составляет примерно 60-80 млн. долл. США в неинфицированных 8-12 недельных C57BL / 6 мыши.

2. Разделение нейтрофилыцентрифугированием в градиенте плотности

  1. Граф клеток костного мозга и ресуспендируют в 1 мл ледяной стерильной PBS.
  2. Добавьте 3 мл Histopaque 1119 (плотность 1,119 г / мл) в 15 мл коническую трубку.
  3. Наложение 3 мл Histopaque 1077 (плотность 1,077 г / мл) в 3 мл Histopaque 1119.

Примечание: Histopaque 1119 и 1077 Histopaque следует нагревают до 18-26 ° С перед использованием.

Важнейший шаг: Подготовка градиенты непосредственно перед использованием в качестве подготовки градиент заранее приведет к диффузии между двумя слоями и субоптимальные нейтрофилов чистотой и выходом.

Важнейший шаг: Наложение Histopaque 1077 по 1119 должно быть сделано медленно, чтобы избежать смешивания двух плотностей, которая исключает разделения клеток во время центрифугирования.

  1. Перекрытие клетки костного мозга подвески на верхней части Histopaque 1077.

Важнейший шаг: OverlАйинг клетки костного мозга надстройка над Histopaque 1077 должно быть сделано медленно, чтобы не потревожить интерфейс между клетками и Histopaque 1077.

Примечание: ресуспендирования клеток костного мозга от неинфицированных мышей в 1 мл PBS дает нейтрофилов чистоту> 90%. Однако объединение многие образцы костного мозга компрометирует нейтрофилов чистоты, например, суспендированием 300 × 10 6 клеток в 3 мл PBS нейтрофилов снижает чистоту от> 90% до ~ 80%. Таким образом, следователи должны выполнить пилотные эксперименты для определения идеального клеток / объем условия для их конкретных экспериментов

  1. Центрифуга течение 30 минут при 2000 оборотов в минуту при 25 ° С без тормоза.

Примечание: центрифугирование градиента при комнатной температуре является критическим и необходимы для эффективного разделения нейтрофилов.

  1. Собирают нейтрофилов на границе Histopaque 1119 и 1077 Histopaque слоев.
  2. Промыть собранных нейтрофилов дважды средой RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина и центрифуге при 1400 оборотов в минуту в течение 7 минут при 4 ° C.
  3. Подсчитайте нейтрофилов и определения их жизнеспособности.

Примечание: Нейтрофилы обычно> 95% жизнеспособных и> 90% чистоты, как определено с помощью анализа FACS. Типичный выход нейтрофилов из костного мозга (например, 2 бедра и голени 2 костей) из неинфицированных 8-12 недельной мыши C57BL / 6 составляет ~ 6-12 миллионов клеток. Это число существенно больше, когда нейтрофилы собирают из костного мозга зараженных животных. Следовательно, ~ 30-40 миллионов нейтрофилов / мышь были восстановлены, когда Candida-инфицированных мышей использовали для сбора клеток 6.

3. Маркировка нейтрофилы Использование CellTracker Красители

  1. Ресуспендируйте нейтрофилов в 5 х 10 6 клеток / мл в PBS, предварительно нагретой при 37 ° С.
  2. Добавить CellTracker красителя в конечной концентрациирацион 5 мкм.

ПРИМЕЧАНИЕ: CellTracker Зеленый (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Диацетат) и CellTracker Оранжевый (CMTMR (5 - (а-6)-4-амино Chloromethyl бензоила тетраметилродамина) была использована в данном протоколе к дифференциально маркировать нейтрофилов из дикого типа и генов-дефицитных мышами.

ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда Подготовка исходного раствора 10 мМ CellTracker зеленый и оранжевый CellTracker, аликвоты и хранят при температуре -80 ° C до дня эксперимента.

  1. Инкубируют нейтрофилов с 5 мкМ соответствующего красителя CellTracker течение 10 мин при 37 ° С при встряхивании на водяной бане в темноте.
  2. Мытье клетки дважды с ледяной RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина.

ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная промывка клеток после маркировки шаг с CellTracker красителя необходимо, чтобы избежать красителя перекрестного загрязнения перед смешиванием дифференциально меченных популяции нейтрофилов для паденияTream конкурентоспособных исследований заселение.

4. Приемные Передача нейтрофилов у мышей и анализа передаваемой нейтрофилов с использованием проточной цитометрии

  1. Ресуспендируют нейтрофилов в охлажденном льдом PBS при концентрации 25 × 10 6 клеток / мл и вводят 200 мкл суспензии в латеральную хвостовую вену так, что 5 × 10 6 нейтрофилов передаются на мышь. Конкурентные исследования нейтрофилов заселение, смешивать дикого типа и ген-дефицитных нейтрофилов в соотношении 1:1 и вводят в общей сложности 5 × 10 6 нейтрофилов на мышь, как описано выше.

ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, до 10 х 10 6 нейтрофилов может быть восприимчиво переданы на мышь без явного немедленного Токсичность по отношению к животным.

  1. В разное время после приемных передачи (например, 1, 2, 3 или 4 часа после передачи), усыпить мышей и урожай крови и / или костного мозга и / или другие органы-мишени (ы) интересов.
  2. Подготовьте сиngle клеточные суспензии из этих тканей для количественного и качественного анализа восприимчиво переданы помечены нейтрофилов с использованием опубликованных протоколов 6,15.
  3. После живой / мертвый окрашивания жизнеспособность и блокады Fc, этикетки клеток с CD45 (клон 30-F11), Ly6G (клон 1A8) и CD11b (клон М1/70) и ворота на живых CD45 + Ly6G CD11b + + нейтрофилов. Нейтрофилы в этом затвор включает родной нейтрофилов получателем мыши, а также восприимчиво переданы помечены нейтрофилы, которые FITC + (если помечены CellTracker зеленый) или PE + (если помечены сотовых Отслеживание оранжевый).

Примечание: Нейтрофилы могут быть отслежены в крови, костного мозга и почек Candida-инфицированных мышей в течение 4 ч после перевода.

Примечание: Фиксация 2% параформальдегидом в PBS, не оказывает отрицательного влияния средней интенсивности флуоресценции нейтрофилов помечен CellTracker Grееп или CellTracker оранжевой течение как минимум 48 часов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Этот протокол оптимизирован для сбора клеток костного мозга у мышей и последующее разделение нейтрофилов из этих клеток центрифугированием в градиенте плотности с использованием коммерчески доступных Histopaque раздела сред клетки. Нейтрофилы выделяли, используя этот метод может быть и?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы приводим надежный, простой, быстрый и экономичный протокол для выделения большого количества нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой чистотой и выживаемость с помощью центрифугирования в градиенте плотности подхода. Когда этот протокол выполняется правильно, ~ 6-12 × 10

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.

Благодарности

Эта работа была поддержана отделом очной исследований Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), Национального института здоровья (NIH), США.

Все Мышей содержали в американской ассоциации по аккредитации лабораторий Animal Care аккредитованных вивария при Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) и размещены в соответствии с процедурами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных под эгидой протоколом, утвержденным уходу и использованию животных комитета NIAID.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
 Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPESCellgro10-041-CV 
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)GemCell100500 
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)GIBCO15140 
0.5 M EDTAQuality Biological Inc351-027-101 
0.2% and 1.6% sodium chlorideJT Baker3624Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077Sigma10771Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119Sigma11191Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and MagnesiumCellgro210-40-CV 
Ethyl Alcohol (200 proof)The Warner Graham Company64-17-5 
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)InvitrogenC-7025Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)InvitrogenC-2927Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)eBioscience170451-82 
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)BD Pharmingen551461 
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)BD Pharmingen560599 
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)eBioscience47-0112-82 
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain KitMolecular ProbesL-23105Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma67-68-5 
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBSUSB Corporation19943 
 Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
 Materials
C57BL/6 miceTaconic 
15 ml centrifuge tubesCorning430053 
50 ml centrifuge tubesBD Falcon352070 
25 ml serological pipettesCelltreat229225B 
10 ml serological pipettesCelltreat229210B 
5 ml serological pipettesCelltreat229205B 
Pasteur pipettes (3 ml)BD Falcon357575 
12 ml syringesKendall monoject512878 
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)BD305122 
100 mm cell strainersBD Falcon352360 
Bactericidal Petri dishesBD Falcon351029 
Combitips Plus BiopurEppendorf2249608-5 
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)Biomedical Research Instruments10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000Instruments sterilized prior to use
 Equipment
Tissue culture hoodThe Baker CompanySG403 
Refrigerated centrifugeThermo Fischer Scientific75004521 
37 °C shaking water bathThermo Fischer Scientific3166721 
 Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.

Ссылки

  1. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  2. Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
  4. Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
  5. Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  6. Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  7. Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
  8. Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  9. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  10. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  11. Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314(2011).
  12. Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
  13. Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
  14. Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
  15. Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
  16. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
  17. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  18. Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
  19. Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658(2012).
  20. Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
  21. Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
  22. Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
  23. Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

77CellTracker

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены