الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Summary

ونحن الخطوط العريضة لطرق فعالة وسريعة العزلة / ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة قابلة للحياة من القشرة الدماغية حديثي الولادة والحبل الشوكي الكبار. تشريح والطلاء من الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية يمكن إنجازه في غضون 90 دقيقة، مع موسم الحصاد دبقية اللاحقة التي تجري ~ 10 يوما بعد تشريح الأولي.

Abstract

الخلايا الدبقية الصغيرة هي المقيم الخلايا الشبيهة بلعم من الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وعلى هذا النحو، لهما أدوار بالغة الأهمية في العمليات الفسيولوجية والمرضية مثل CNS نضوج في التنمية، والتصلب المتعدد، وإصابات الحبل الشوكي. ويمكن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتجنيدهم للعمل بسبب الاصابة العصبية أو التحفيز، مثل تلف المحاور ينظر في مرض التصلب العصبي المتعدد أو الصدمة الدماغ الدماغية الناجمة عن السكتة الدماغية. ويعتقد أن هذه الأعضاء مناعيا من الجهاز العصبي المركزي أيضا أن يكون الأدوار في اللدونة متشابك في ظل ظروف غير مرضية. نحن توظيف بروتوكولات لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة حديثي الولادة والكبار والتي تهدف إلى تحقيق أقصى قدر من أرقام الهواتف المحمولة قابلة للحياة مع التقليل من المتغيرات التباس، مثل وجود CNS الأخرى أنواع الخلايا والحطام خلية ثقافة. نحن نستخدم مكونات الجهاز العصبي المركزي كبير وملحوظ بسهولة (مثل القشرة، شرائح الحبل الشوكي)، مما يجعل العملية برمتها مجدية وقابلة للتكرار. استخدام الخلايا الكبارS هو البديل المناسب لاستخدام الأطفال حديثي الولادة الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ، كما درس العديد من الأمراض تؤثر في الأساس على الحبل الشوكي بعد الولادة. هذه الأنظمة الثقافة هي أيضا مفيدة لاختبار تأثير مباشرة من المركبات التي قد تمنع أو إما تعزيز التنشيط دبقية. منذ تفعيل دبقية صغيرة يمكن أن تشكل نتائج مرض في الجهاز العصبي المركزي الكبار، وهناك حاجة لفي نظم المختبر في الخلايا الدبقية الصغيرة التي حديثي الولادة والكبار يمكن تربيتها ودراستها.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي، تشبه بشكل وثيق الضامة الطرفية في البنية والوظيفة ^1. وقد ثبت مؤخرا أن الخلايا دبقية بعد الولادة مستمدة من الأسلاف النخاعي بدائية ويتم إنشاؤها قبل اليوم الثامن من مرحلة التطور الجنيني، تقلب فكرة سابقة أن الأسلاف المكونة للدم بعد الولادة هي مصدر الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ بالغ ^2. أنها تلعب دورا رئيسيا في العديد من الأمراض العصبية ويمكن أن تستجيب بسرعة للعدوى أو إصابة عن طريق الإفراج عن السيتوكينات الموالية للالتهابات أو المضادة للالتهابات ^3. وهكذا الخلايا الدبقية الصغيرة تشمل وحدة قائمة بذاتها في الجهاز العصبي المركزي التي يمكن التلاعب بها لتؤثر على تطور المرض. تطوير أساليب قوية وقابلة للتكرار لعزل وثقافة الأطفال حديثي الولادة أو الكبار خلايا دبقية المهم أن الدراسات المستقبلية.

ومن المعروف الخلايا الدبقية الصغيرة ليكونوا لاعبين الحرجة في عدد من الحالات المرضية في الدماغ. وفي الآونة الأخيرة، رولES آخذة في الظهور للخلايا في نمو الدماغ العادي وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة يبلعم فائض الخلايا العصبية السلف من التلفيف المسنن من الحصين ^{1 و 4.} الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أيضا أن تعدل العديد من الحالات العصبية التي تؤثر على الحبل الشوكي، مثل MS، ألم الأعصاب، وإصابات الحبل الشوكي ^5-7. الخلايا الدبقية الصغيرة الحبل الشوكي تتفاعل بشكل مختلف مقارنة مع الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ استجابة لإشارات التنشيط ^{8، 9،} ربما بسبب وجود خلافات في البيئة المحلية. وبالتالي فإنه من المهم لإنشاء المناسبة في نظام المختبر للثقافة ودراسة الخلايا الدبقية الصغيرة الحبل الشوكي. الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة إنتاج أكثر بكثير من الموالية للالتهابات خلوى أكسيد النيتريك مقارنة مع الخلايا البالغة بعد في التحفيز المختبر مع الإنترفيرون γ أو TNF-A ^10،11 مزيد من تسليط الضوء على الحاجة إلى استخدام خلايا بالغة لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق بعض الأمراض.

بروتوكول نستخدمها في المختبر لCUlture الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة هو الاختلاف من الأساليب الحديثة التي تستخدم اهتزاز الثقافات الدبقية المختلطة في محاولة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة من سطح خلية ثقافة قارورة ^12. نحن أيضا تصف طريقة لثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة من البالغين الماوس الحبل الشوكي على أساس بروتوكول وصف لأول مرة من قبل ييب، وآخرون ^13. يوفر هذا الأسلوب وسيلة أسرع لخلايا بالغة ثقافة مقارنة البروتوكولات الأخرى المتاحة ^14. إعداد الناتج هو 70٪ الخلايا الدبقية الصغيرة، وتتكون النسبة الباقية من الخلايا النجمية. على الرغم من أن نقاء ثقافتنا هو أقل بالمقارنة مع غيرها من وسائل نشر ^13، وهذا النظام الثقافة هي مفيدة لإستكشاف دبقية في استجابة الثقافة لمختلف المحفزات تفعيل وكذلك لدراسة الأمراض التي تؤثر بشكل رئيسي في النخاع الشوكي والتي قوية استجابة التهابية هو السمة الرئيسية.

وقد تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي وصفها ستوني بروك اجلامعاتتاي IACUC.

Protocol

1. تشريح (يوم 0)

1. لحث على التخدير لP0-2 الجراء الفأر مع انخفاض حرارة الجسم. مسح رؤوس الجراء مع Kimwipe غارقة في الايثانول 70٪ لتطهير الأنسجة.
2. إزالة الرؤوس مع زوج من مقص، وذلك باستخدام 4 الجراء في 10 سم لوحة الثقافة. وضع رؤساء في طبق بتري تحتوي العازلة الجليد الباردة هانك.
3. ترسيخ رؤساء باستخدام ملقط المنحني من خلال تجويف العين وإزالة بعناية الجلد الذي يغطي الجمجمة مع microforceps مستقيم.
4. إزالة العظام في الجمجمة مع microforceps على التوالي، وذلك باستخدام الحذر لعدم ثقب أو تلف القشور. الطريقة الأكثر فعالية هو لبدء إزالة بدءا بالقرب من المخيخ، والذي يقع عند قاعدة الرأس، كما سيتم تجاهل هذه المنطقة.
5. إزالة الدماغ مع ملعقة صغيرة، ووضع (4) العقول في طبق بتري الطازجة التي تحتوي على المخزن المؤقت هانك الجليد الباردة.
6. جميع الخطوات من هذه النقطة على الاستفادة microforceps ويتم تنفيذها تحت ديسيهالمجهر كشن. تبدأ على الجانب البطني من الدماغ، ومرساة الأنسجة من خلال عقد المخيخ وجعل اثنين من الشقوق الصغيرة على جانبي الدماغ المتوسط. يجب الحرص على عدم قطع كل الطريق من خلال الأنسجة، كما تغطي القشور الدماغ المتوسط ​​في هذه المنطقة.
7. ندف بلطف المخ الأوسط والمخيخ في قطعة واحدة من القشور اثنين. ينبغي للقشرات اثنين تشكيل شكل مقعر.
8. فصل القشور اثنين وتوجيه القشرة واحدة مع الجانب الإنسي فوق لمزيد من تشريح. الحصين يمكن أن يكون صعبا للاحتفال، ولكن يقع مقابل من البصلة الشمية الذي يظهر على شكل عقيدات صغيرة على نهاية مدببة من القشرة.
9. إزالة الحصين، الذي يحتوي على شكل الهلال. الوجه القشرة أكثر لعرض الجانب الظهري.
10. باستخدام البصلة الشمية كنقطة انطلاق، وإزالة جميع السحايا والبصلة الشمية نفسها من القشرة.
11. يجب وضع قشرات تشريح في أنابيب مخروطية 15 مل مع 14 مل من العقيدد ملحي هانك مخزنة على الجليد.

2. الثقافة الخلية (يوم 0)

1. ما قبل معطف 10 سم الأنسجة أطباق الثقافة مع 5 ميكروغرام / مل من بولي-D-يسين (PDL) المخفف في الماء تعقيمها لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية.
2. نضح PDL، وألواح يغسل مرة واحدة مع الماء تعقيمها. لوحة الجافة تحت الأشعة فوق البنفسجية في نسيج الثقافة هود لمدة 20 دقيقة. هذه الخطوة يجب أن يؤديها قبيل عملية تشريح.
3. العازلة نضح هانك من الأنابيب التي تحتوي على القشور من 4 أدمغة كل، وتطبيق 4 مل من 1X التربسين / EDTA الحل، يسحن الأنسجة مع P1000 طرف، وأنابيب مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
4. إضافة 4 مل من وسائل الاعلام دبقية كاملة في أنبوب لوقف عملية الهضم الأنزيمية، ومزيج، وتدور باستمرار في محتويات دورة في الدقيقة 1.5K لمدة 5 دقائق.
5. نضح طاف وتكرار غسل مع 4 مل من وسائل الإعلام كاملة. Resuspend الخلايا في 10 مل من وسائل الإعلام دبقية كاملة (DMEM مع FBS 10٪، 1٪ البيروفات الصوديوم، 0.08٪ جنتاميسين)، ومرشح من خلال 40 الصغرىن شبكة مصفاة الخلية.
6. لوحة في مناطق ذات كثافة من 8 القشور لكل 10 مل في 10 سم نسيج لوحة الثقافة والمكان في نسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ (انظر الخلايا الدبقية الصغيرة بروتوكول الكبار).

(يوم 3)

1. تغيير وسائل الإعلام في جميع الأطباق ثقافة الخلية مع وسائل الاعلام دبقية كاملة.

(اليوم 10)

1. إضافة 400 ميكرولتر من 60 ملم في HBSS يدوكائين (لفصل الخلايا الدبقية الصغيرة) في المتوسط ​​من 10 سم لوحات زراعة الأنسجة واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10-15 دقيقة.
2. جمع وسائل الإعلام / التعليق خلية من لوحة، ويغسل مرة واحدة مع لوحة العازلة هانك. جمع غسل العازلة لاسترداد ما تبقى الخلايا الدبقية الصغيرة.
3. إضافة 5 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة) إلى تعليق خلية إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر أو في 1/100 التخفيف.
4. تدور باستمرار تعليق خلية في 1،000 x ج (1،500 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق في 1 مل DMEM مع FBS 1٪.
5. عد عدد الخلايا قابلة للحياة (وفقا مي الكبارcroglia 3.1/3.2) والخلايا الانقسام في لوحات زراعة الأنسجة في كثافة التجريبية المطلوب. ويتم حصاد ما يقرب من 1X10 ⁶ الخلايا الدبقية الصغيرة من سم لوحة تحتوي على 10 القشور من 4 العقول. لالمناعي، فمن المستحسن كثافة 2.5x10 ⁴ خلايا لكل 18 مم ساترة.
6. سماح لا تقل عن 24 ساعة لخلايا دبقية للعودة بالكامل إلى متشعبة، دولتهم يستريح قبل استخدامها.

نص البروتوكول: (الكبار الخلايا الدبقية الصغيرة)

1. مجموعة الأنسجة

1. الأنسجة معطف لوحات ثقافة مع بولي-D-يسين (PDL) لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تغسل الصحون مرة واحدة مع الماء تعقيمها مباشرة قبل الاستعمال.
2. الموت ببطء الماوس عن طريق CO ₂ الخنق والتأكد من أن القتل الرحيم كاملة. تنظيف منطقة الحبل الشوكي مع الايثانول 70٪.
3. باستخدام زوج من مقص قطع الجلد على الجزء العلوي من النخاع الشوكي، ثم انتقل إلى قطع الحبل الشوكي خارج المنطقة من T1 إلى T12. قطعما تبقى العضلات الخروج من الجانبين من الحبل الشوكي.
4. خفض ببطء فقرات باستخدام microscissors كما كنت عقد بلطف النخاع الشوكي مع أطراف أصابعك. يجب الحرص على عدم ثقب النخاع الشوكي والأنسجة لينة جدا. استخراج ببطء النخاع الشوكي باستخدام microforceps.
5. غمر الحبل الشوكي في طبق بتري تحتوي HBSS الجليد الباردة. باستخدام مجهر الضوء إزالة جميع السحايا مرئية باستخدام microforceps
6. قطع الحبل الشوكي إلى أجزاء مستعرضة صغيرة بما يكفي لتوليد عدة شظايا. سمك شظايا لا ينبغي أن يكون أكثر من 2 ملم من أجل تسهيل عملية الهضم كفاءة. نقل القطع الحبل الشوكي إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 1 مل HBSS الجليد الباردة. الحفاظ على أنبوب على الجليد حتى الخطوة الهضم.

2. هضم الأنسجة

1. نضح HBSS من أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على أنسجة الحبل الشوكي. يجب الحرص على عدم نضح أي قطعة من النسيج.
2. إضافة 1 مل من التربسين (2.5 ز / L المشع الخنزيري التربسين و 0.2 غرام / لتر EDTA في HBSS)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. لوقف عملية الهضم وإزالة التربسين وإضافة 3 مل من الابتدائية المتوسطة الخلايا الدبقية الصغيرة التي تحتوي على مصل لوقف عملية الهضم الأنزيمية.
4. الماصة صعودا وهبوطا لإزاحة الأنسجة. تعليق تصفية الخلية باستخدام 40 ميكرومتر مصفاة الخلية.

3. عد الخلايا وتصفيح

1. مزيج حجم مساو من تعليق خلية وحل دابي.
2. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
3. لوحة في مناطق ذات كثافة بين 5 7x10 ⁵ خلية / مل في PDL المغلفة 35 × 10 ملم الأطباق. الطلاء في مناطق ذات كثافة أقل منع نمو الخلايا حتى عندما تم زراعة الخلايا في 12 لوحات جيدة والتي لها مساحة أصغر مقارنة مع 35 × 10 ملم الأطباق.

النتائج

ويرد مثال من خلايا دبقية يستريح والمفعلين يمكنهم في الشكل 1. تم تصور والخلايا الدبقية الصغيرة 24 ساعة بعد الطلاء (الشكل 1A) ويحمل متشعبة مورفولوجيا (يستريح). التعرض للكاشف فتيلة، عديد السكاريد الشحمي البكتيرية (LPS) يؤدي إلى إحداث تغييرات في التشكل د?...

Discussion

الخلايا الدبقية الصغيرة تعدل CNS السير العادي فضلا عن الاستجابات الالتهابية لمختلف الأمراض. وقد تورط إعادة عرض متشابك وظيفية من قبل الخلايا الدبقية الصغيرة في الحفاظ على التوازن الطبيعي للدماغ ^15. خلال تتالي العصبية يشاركون في إزالة الخلايا العصبية السلف من الت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidocaine, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-Cl
Gentamycin Sulfate	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish	Falcon	353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml			Dilute 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV