Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Summary

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Abstract

Microglia הם התאים דמויי מקרופאג התושבים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), וככזה, יש תפקידים חשובים וקריטי בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים כגון CNS התבגרות בפיתוח, טרשת נפוצה, ופגיעה בחוט השדרה. יכול להיות מופעל microglia וגייס לפעולה על ידי פציעה או גירוי עצבי, כגון פגיעה בaxonal ראתה ב-MS או טראומה המוחית איסכמי כתוצאה משבץ מוחי. חברי immunocompetent אלה של מערכת העצבים המרכזית גם הם חשבו שיש תפקידים בפלסטיות הסינפטית בתנאים שאינם פתולוגיים. אנו מעסיקים פרוטוקולים לmicroglia culturing מן רקמות היילודים ומבוגרים שהמטרה למקסם את המספרים הסלולריים קיימא תוך מזעור משתנים מבלבלים, כגון נוכחות של סוגי תאים במערכת העצבים המרכזית ופסולת אחרים תרבית תאים. אנו משתמשים ברכיבים גדולים ולהבחין בקלות במערכת העצבים המרכזית (לדוגמה: קליפה, פלחי חוט השדרה), מה שהופך את כל התהליך אפשרי לשחזור. השימוש בתא בוגרים הוא חלופה מתאימה לשימוש בmicroglia מוח ילוד, כפי שפתולוגיות רבות למדה בעיקר משפיעות על חוט השדרה לאחר הלידה. מערכות התרבות אלה הן גם שימושיות עבור ישירות בדיקת ההשפעה של תרכובות שיכולים גם לעכב או לקדם את הפעלת microglial. מאז הפעלת microglial יכולה לעצב את התוצאות של מחלה של מערכת העצבים המרכזית למבוגרים, יש צורך במערכות מבחנה שבה יכול להיות מתורבת microglia יילודים ומבוגרים ולמדו.

Introduction

Microglia הם התאים החיסוניים המקומיים של מערכת העצבים המרכזית, המזכירים באופן הדוק ביותר מקרופאגים היקפיים במבנה ותפקוד ^1. זה כבר הוכיח לאחרונה כי תאי microglial לאחר לידה נובעים מאבות מיאלואידית פרימיטיביות ונוצרים לפני היום השמיני של עובר, הפילו את הרעיון הקודם שאבות hematopoietic לאחר לידה הם המקור של microglia במוח הבוגר ^2. הם משחקים תפקידי מפתח במספר מחלות נוירולוגיות ויכולים להגיב במהירות לזיהום או פגיעה על ידי שחרור הפרו ציטוקינים דלקתיים ואנטי דלקתיים ^3. לפיכך microglia להקיף יחידה עצמאית של מערכת העצבים המרכזית שניתן להשפיע להשפיע התקדמות מחלה. פיתוח שיטות חזקות ולשעתק לבודד ותאי microglial ילוד או מבוגר תרבות חשוב למחקרים עתידיים.

Microglia ידוע להיות שחקנים קריטיים במספר פתולוגיות מוחיות. לאחרונה, רולes הם מתעוררים לתאים בהתפתחות מוח הנורמלי ולתפקד כתאי microglia phagocytose עודפים עצביים אב מהרכס משוננת של ההיפוקמפוס ^{1, 4.} Microglia יכול גם לווסת את מספר תנאי נוירולוגיות שמשפיעים על חוט השדרה, כגון טרשת נפוצה, כאב נוירופתי, ופגיעה בחוט השדרה ^5-7. microglia בעמוד השדרה מגיב באופן שונה בהשוואה למוח microglia בתגובה לאותות הפעלה ^{8, 9,} כנראה בשל הבדלים בסביבה המקומית. לכן חשוב להקים מתאים במערכת במבחנה לתרבות וללמוד microglia חוט השדרה. microglia הילוד לייצר באופן משמעותי יותר של תחמוצת חנקן ציטוקינים פרו דלקתית בהשוואה לתאים בוגרים לאחר גירוי במבחנה עם IFN-γ או ^TNF-10,11 נוסף המדגיש את הצורך בשימוש בתאי בוגרים ללמוד microglia בהקשר של מחלות מסוימות.

הפרוטוקול אנחנו מעסיקים במעבדה למ"קmicroglia ילוד lture הוא וריאציה של השיטות האחרונות אשר מנצלים רועד של תרבויות גליה מעורבות במאמץ להסיר את microglia מפני השטח של תא בקבוק התרבות ^12. אנחנו גם מתארים שיטה לתרבות microglia מחוט השדרה למבוגרים העכבר מבוסס על פרוטוקול שתואר לראשונה על ידי ייפ, ואח' ^13. שיטה זו מספקת דרך מהירה לתאים בוגרים תרבות בהשוואה לפרוטוקולים זמינים ¹⁴ אחרים. ההכנה המתקבלת היא 70% microglia; האחוז הנותר מורכב מהאסטרוציטים. למרות טוהר התרבות שלנו הוא נמוך יותר בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו ^13, מערכת התרבות זו היא שימושית לחקר תרבות microglial בתגובה לגירויים הפעלה שונים, כמו גם למחקר של מחלות שבעיקר משפיעים על חוט השדרה ושבו חזק תגובה דלקתית היא תכונה עיקרי.

כל הפרוטוקולים שתוארו כבר אושר על ידי סטוני ברוק Universiטאי IACUC.

Protocol

1. נתיחה (יום 0)

1. לגרום הרדמה לP0-2 גורי עכבר עם היפותרמיה. נגב את ראשיהם של הגורים עם Kimwipe ספוג באתנול 70% כדי לחטא את הרקמה.
2. הסר את הראש עם זוג מספריים, באמצעות 4 גורים בצלחת תרבות 10 ס"מ. מניחים את הראשים בצלחת פטרי שמכילה המאגר של האנק הקר כקרח.
3. לעגן את הראשים באמצעות מלקחיים מעוקלים דרך ארובות העיניים ולהסיר את העור המכסה את הגולגולת עם microforceps ישר בזהירות.
4. הסר את עצמות גולגולת עם microforceps ישר, תוך שימוש בזהירות כדי לא לנקב או נזק הקורטקס. הדרך היעילה ביותר היא להתחיל את ההסרה מתחילה ליד המוח הקטן, הנמצא בבסיסו של הראש, כפי שהאזור זה יהיה מושלך.
5. הסר את המוח עם מרית קטנה, והמקום (4) את המוח בצלחת פטרי שמכילה טרי החיץ קר כקרח של האנק.
6. כל הצעדים מנקודה זו והלאה לנצל microforceps ומבוצעים תחת disseמיקרוסקופ ction. החל בצד הגחוני של המוח, לעגן את הרקמה על ידי מחזיק את המוח הקטן ולעשות שני חתכים קטנים בכל צד של המוח התיכון. היזהר שלא לחתוך את כל הדרך דרך הרקמה, כמו הקורטקס לכסות את המוח התיכון באזור זה.
7. בעדינות להקניט המוח התיכון והמוח הקטן בחתיכה אחת משתי קליפת המוח. שני הקורטקס צריך ליצור צורה קעורה.
8. להפריד בין שני הקורטקס ולכוון את קליפה אחד עם הצד המדיאלי עד לנתיחה נוספת. ההיפוקמפוס יכול להיות קשה להתבונן, אבל הוא ממוקם מול של הנורה חוש הריח שמופיע כגולה קטנה בקצה המחודד של קליפת המוח.
9. הסר את ההיפוקמפוס, שבו יש צורת סהר. להעיף את הקליפה מעל לצפייה בצד הגב.
10. שימוש בנורת חוש הריח כנקודת התחלה, להסיר את כל קרומי המוח ונורת חוש הריח עצמו מקליפת המוח.
11. הקורטקס גזור צריך להיות ממוקם בתוך 15 צינורות חרוטי מ"ל עם 14 מ"ל של colמלוח נאגר של האנק ד על קרח.

2. תרבית תאים (יום 0)

1. 10 מנות בתרבית רקמת ס"מ מראש מעיל עם 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של פולי-D-ליזין (PDL) מדוללים במי autoclaved עבור 3 שעות ב 37 ° C.
2. לשאוב PDL, וצלחות לשטוף פעם עם מים autoclaved. צלחת יבש תחת UV במכסת המנוע בתרבית הרקמה למשך 20 דקות. צעד זה צריך להתבצע רק לפני תהליך הנתיחה.
3. חיצו של האנק לשאוב מצינורות המכילים את קליפת המוח מהמוח של 4 כל אחת, להחיל 4 מ"ל של תמיסת טריפסין / EDTA 1x, triturate רקמה עם P1000 טיפ, וצינורות מקום 37 ° C בחממה במשך 15 דקות.
4. הוסף 4 מ"ל של תקשורת microglial המלאה לכל צינור כדי לעצור את עיכול אנזימטי, לערבב, ומסובב את תכנים בסל"ד 1.5K למשך 5 דקות.
5. לשאוב supernatant וחזור על לשטוף עם 4 מ"ל של מדיה מלאה. תאי Resuspend ב 10 מ"ל של תקשורת microglial המלאה (DMEM עם 10% FBS, 1% פירובט נתרן, 0.08% gentamycin), ולסנן דרך 40 מיקרומסננת תא רשת N.
6. צלחת בצפיפות של 8 לקורטקס 10 מ"ל בצלחת 10 ס"מ תרבות רקמות ומקום בתרבות רקמות חממה ב 37 ° C ו 5% CO ₂ (ראה למבוגרים Microglia פרוטוקול).

(יום 3)

1. שינוי בתקשורת בכל מנות תרבות התאים עם תקשורת microglial מלאה.

(יום 10)

1. הוסף 400 מיקרוליטר של 60 מ"מ לידוקאין בHBSS (לנתק microglia) לתוך מדיום של תרבות צלחות רקמות של 10 ס"מ והדגירה בטמפרטורת חדר (RT) למשך 10-15 דקות.
2. לאסוף את התקשורת / השעיה תא מהצלחת, ולשטוף את צלחת פעם אחת עם החיץ של האנק. לאסוף חיץ לשטוף להתאושש microglia שנותר.
3. הוסף 5 מ"מ EDTA (pH 8.0) להשעית התא לריכוז סופי של 50 מיקרומטר או בדילול 1/100.
4. ספין למטה השעיה תא XG ב 1000 (1,500 סל"ד) במשך 5 דקות ומחדש להשעות ב1 מ"ל DMEM עם 1% FBS.
5. ספירת מספר תאי קיימא (לפי Mi מבוגריםcroglia 3.1/3.2) ותאים מחולקים לצלחות תרבית רקמה בצפיפות הניסוי הרצויה. כ 1x10 ⁶ microglia נקצרים מצלחת 10 ס"מ המכילה את קליפת המוח מגיל 4 מוחות. לimmunofluorescence, צפיפות של 2.5x10 ⁴ תאים לכל coverslip 18 מ"מ מומלצת.
6. אפשר לפחות 24 שעות לתאי microglial לחזור באופן מלא למצבו המסועף, מנוחתם לפני השימוש.

טקסט פרוטוקול: (למבוגרים Microglia)

1. אוסף רקמות

1. צלחות תרבית רקמה מעיל עם פולי-D-ליזין (PDL) עבור 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס או הלילה ב 4 ° C. לשטוף את צלחות פעם אחת עם מים autoclaved מייד לפני השימוש.
2. להרדים את העכבר בחנק CO _2, ויוודא כי המתת חסד היא מוחלטת. יש לנקות את אזור חוט השדרה עם 70% אתנול.
3. באמצעות מספריים לחתוך את העור בחלקו העליון של חוט השדרה, ואז להמשיך לחתוך את חוט השדרה מהאזור T1 לT12. לחתוךשרירים את שנותרו מהצדדים של חוט השדרה.
4. לאט לאט לחתוך את החוליות באמצעות microscissors כמו שאתה בעדינות להחזיק את חוט השדרה עם קצות אצבעותיך. היזהר שלא לנקב את חוט השדרה כרקמה רכה מאוד. לאט לחלץ את חוט השדרה באמצעות microforceps.
5. להטביע את חוט השדרה בצלחת פטרי המכילה HBSS קר כקרח. השימוש במיקרוסקופ אור להסיר את כל קרומי המוח הגלויים באמצעות microforceps
6. חותכים את חוט השדרה למקטעים רוחביים קטנים מספיק כדי לייצר כמה שברים. העובי של שברים לא צריך להיות יותר מ 2 מ"מ על מנת להקל על עיכול יעיל. להעביר את החלקים בעמוד השדרה לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 1 HBSS קר כקרח מ"ל. שמור את הצינור על קרח עד שלב העיכול.

2. עיכול של רקמות

1. HBSS לשאוב מצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל רקמת חוט השדרה. היזהר שלא לשאוב כל פיסת הרקמה.
2. הוסף 1 מ"ל של טריפסין (2.5 גר '/ ליטר מוקרן חזירי טריפסין ו0.2 גר' / ל 'בHBSS EDTA) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. כדי לעצור את העיכול להסיר טריפסין ומוסיף 3 מ"ל של מדיום microglia העיקרי המכיל סרום לעצור עיכול אנזימטי.
4. Pipet למעלה ולמטה כדי לסלק את הרקמה. סנן את ההשעיה התא באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר.

3. ספירת תאים וציפוי

1. מערבבים נפח שווה של השעיה תא ופתרון DAPI.
2. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
3. צלחת בצפיפות בין 5-7x10 ⁵ תאים / מ"ל ב35 x 10 מ"מ צלחות PDL מצופים. ציפוי בצפיפות נמוכה מנע צמיחת תאים גם כאשר תאים בתרבית 12 צלחות גם בו יש שטח קטן יותר בהשוואה ל -35 מ"מ x 10 מנות.

תוצאות

דוגמה של תאי microglial מנוחה והופעלו מוצגת באיור 1. Microglia היה דמיין 24 שעות לאחר ציפוי (איור 1 א) ולהציג מורפולוגיה מסועפת (מנוחה). חשיפה למגיב תחול, lipopolysaccharide (LPS) תוצאות חיידקיים בשינויים במורפולוגיה microglial כמו התאים להיות מופעלת (איור 1).

Discussion

Microglia לווסת את מערכת העצבים המרכזית תפקוד תקין, כמו גם תגובות דלקתיות לפתולוגיות שונות. שיפוץ הסינפטי פונקציונלי על ידי microglia היה מעורב בשמירה על הומאוסטזיס המוח הנורמלי ^15. במהלך מפל neurogenic הם משתתפים באישור של תאים עצביים מהרכס משוננת של ההיפוקמפוס ^{4, 16.} לכ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidocaine, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-Cl
Gentamycin Sulfate	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish	Falcon	353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml			Dilute 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV