Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Resumen

Nosotros describimos métodos para el aislamiento / cultura eficiente y rápida de la microglia viable desde la corteza cerebral neonatal y adulto de la médula espinal. La disección y placas de microglia cortical se puede lograr dentro de los 90 minutos, con la cosecha microglial posterior que tiene lugar ~ 10 días después de la disección inicial.

Resumen

La microglía son los residentes células similares a los macrófagos del sistema nervioso central (SNC) y, como tal, tienen un papel de importancia crítica en procesos fisiológicos y patológicos tales como la maduración del SNC en desarrollo, la esclerosis múltiple y lesión de la médula espinal. La microglía se puede activar y reclutó a la acción por una lesión o estimulación neuronal, tales como daño axonal visto en la EM o trauma cerebral isquémica resultante de un accidente cerebrovascular. Estos miembros inmunocompetentes del SNC también se cree que tienen papeles en la plasticidad sináptica en condiciones no patológicas. Empleamos protocolos para la microglía cultivo de los tejidos neonatales y adultos que tienen como objetivo maximizar el número de células viables y reducir al mínimo las variables de confusión, tales como la presencia de otros tipos de células del sistema nervioso central y los restos de cultivo celular. Utilizamos componentes del SNC grandes y fácilmente perceptible (por ejemplo, la corteza, los segmentos de la médula espinal), lo que hace que todo el proceso sea factible y reproducible. El uso de célula adultas es una alternativa adecuada para el uso de la microglía del cerebro neonatal, como muchas patologías estudiadas afectan principalmente a la médula espinal después del parto. Estos sistemas de cultivo también son útiles para probar directamente el efecto de los compuestos que pueden inhibir o promover la activación de la microglia. Puesto que la activación microglial puede dar forma a los resultados de la enfermedad en el SNC adulto, hay una necesidad de sistemas in vitro en el que la microglía neonatal y adulto puede cultivar y estudió.

Introducción

La microglía son las células inmunes residentes del SNC, se asemejan más estrechamente macrófagos periféricos en la estructura y la función ^1. Recientemente se ha demostrado que las células microgliales postnatal derivan de progenitores mieloides primitivas y se generan antes de que el octavo día de la embriogénesis, volteando la noción anterior de que los progenitores hematopoyéticos postnatales son la fuente de la microglia en el cerebro adulto ^2. Juegan un papel clave en varias enfermedades neurológicas y pueden responder rápidamente a una infección o lesión mediante la liberación de citoquinas pro-inflamatorias o anti-inflamatoria ^3. Por lo tanto microglia abarca una unidad independiente en el SNC que pueden ser manipulados para afectar la progresión de la enfermedad. El desarrollo de métodos robustos y reproducibles para aislar y cultivar células microgliales neonatal o adulto es importante para futuros estudios.

La microglía son conocidos por ser jugadores críticos en una serie de patologías cerebrales. Más recientemente, rolES están surgiendo para las células en el desarrollo del cerebro y la función normal como microglia fagocitan el exceso de células progenitoras neurales de la circunvolución dentada del hipocampo ^{1, 4.} Microglía también puede modular varias condiciones neurológicas que afectan la columna vertebral, como la esclerosis múltiple, dolor neuropático, y lesiones de la médula espinal ^5-7. Microglía de la médula espinal reaccionan de manera diferente en comparación con el cerebro microglia en respuesta a señales de activación ^{8, 9,} probablemente debido a las diferencias en el medio ambiente local. Por lo tanto, es importante establecer un adecuado sistema in vitro para estudiar la cultura y la microglía la médula espinal. Neonatal microglia producen significativamente más de la óxido nítrico citoquina pro-inflamatoria en comparación con las células adultas después de la estimulación in vitro con IFN-γ o TNF-un ^10,11 más destacando la necesidad de utilizar células adultas para estudiar la microglía en el contexto de ciertas enfermedades.

El protocolo que utilizamos en el laboratorio para culture neonatal microglia es una variación de los métodos recientes que utilizan agitación de cultivos gliales mixtos en un esfuerzo para eliminar la microglía de la superficie del frasco de cultivo celular ^12. También describimos un método para la cultura de la microglia ratón adulto médula espinal sobre la base de un protocolo descrito por primera vez por Yip, et al ^13. Este método proporciona una manera más rápida de las células adultas de cultivo en comparación con otros protocolos disponibles ^14. La preparación resultante es 70% microglía; el porcentaje restante se compone de los astrocitos. Aunque la pureza de nuestra cultura es más baja en comparación con otros métodos publicados ^13, este sistema de cultivo es útil para explorar la cultura microglial en respuesta a diversos estímulos de activación, así como para el estudio de enfermedades que afectan principalmente a la médula espinal y en el que una fuerte respuesta inflamatoria es una característica principal.

Todos los protocolos descritos han sido aprobados por la Stony Brook University IACUC.

Protocolo

1. Disección (día 0)

1. Inducir la anestesia que p0-2 crías de ratón con la hipotermia. Limpie las cabezas de los cachorros con un Kimwipe empapado en etanol al 70% para desinfectar el tejido.
2. Retire las cabezas con un par de tijeras, con 4 crías por 10 cm placa de cultivo. Coloque las cabezas en una placa de Petri que contiene tampón de helado Hank.
3. Anclar los cabezales con pinzas curvas a través de las cuencas de los ojos y retirar con cuidado la piel que cubre el cráneo con microforceps rectas.
4. Retirar los huesos del cráneo con microforceps rectas, teniendo cuidado para no romper o dañar la corteza. La manera más efectiva es para comenzar la extracción de partida cerca del cerebelo, que se encuentra en la base de la cabeza, como se descartará esta región.
5. Retire el cerebro con una pequeña espátula, y colocar los (4) cerebros en una placa de petri fresco que contiene tampón de Hank enfriada en hielo.
6. Todos los pasos de este punto en utilizar microforceps y se realizan bajo un Dissemicroscopio cción. Empezando por el lado ventral del cerebro, anclar el tejido mediante la celebración de el cerebelo y hacer dos pequeñas incisiones a cada lado del cerebro medio. Tenga cuidado de no cortar todo el camino a través del tejido, como las cortezas cubren el cerebro medio en esta región.
7. Suavemente se burlan de el mesencéfalo y el cerebelo de una pieza de las dos cortezas. Los dos cortezas deben formar una forma cóncava.
8. Separe las dos cortezas y orientar una sola corteza con el lado medial para su posterior disección. El hipocampo puede ser difícil de observar, pero está situado enfrente del bulbo olfatorio, que aparece como un pequeño nódulo en la punta de la corteza.
9. Retire el hipocampo, que tiene una forma de media luna. Voltear la corteza a ver el lado dorsal.
10. Usando el bulbo olfatorio como punto de partida, eliminar todas las meninges y el propio bulbo olfatorio de la corteza.
11. Las cortezas disecados deben ser colocados en tubos cónicos de 15 ml con 14 ml de colsolución salina tamponada de Hank d en hielo.

2. Cell Culture (Día 0)

1. Pre-capa 10 cm placas de cultivo de tejido con 5 mg / ml de poli-D-lisina (PDL) diluido en agua tratada en autoclave durante 3 horas a 37 ° C.
2. Aspirar PDL, y las placas de lavado una vez con agua tratada en autoclave. Se seca la placa bajo la UV en la campana de cultivo de tejido durante 20 min. Este paso debe realizarse justo antes del proceso de disección.
3. Aspirar el tampón de Hank a partir de tubos que contienen las cortezas de 4 cerebros cada uno, se aplican 4 ml de solución de 1x tripsina / EDTA, se tritura el tejido con p1000 de la punta, y los tubos en lugar de 37 ° C incubadora durante 15 min.
4. Añadir 4 ml de medios completos microglial por tubo para detener la digestión enzimática, la mezcla, y girar hacia abajo contenidos en 1.5K rpm durante 5 min.
5. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado con 4 ml de medio completo. Resuspender las células en 10 ml de medio microgliales completo (DMEM con 10% de SFB, 1% de piruvato de sodio, 0,08% gentamicina), y filtrar con un 40 micron filtro de células de malla.
6. Placa con una densidad de 8 cortezas por 10 ml de una placa de cultivo de 10 cm de tejido y colocar en un incubador de cultivo de tejidos a 37 º C y _CO2 al 5% (ver protocolo Microglia adulto).

(Día 3)

1. Cambie los medios en todos los platos de cultivo celular con medios microgliales completos.

(Día 10)

1. Añadir 400 microlitros de 60 mM de lidocaína en HBSS (para separar la microglía) en el medio de las placas de cultivo de tejidos de 10 cm y se incuba a temperatura ambiente (RT) durante 10-15 min.
2. Recoge los medios de comunicación / suspensión de células de la placa, y lavar la placa una vez con tampón de Hank. Recoger el tampón de lavado para recuperar microglia restante.
3. Añadir 5 mM de EDTA (pH 8,0) a la suspensión celular a una concentración final de 50 mM o a una dilución 1/100.
4. Centrifugar la suspensión celular a 1000 xg (1.500 rpm) durante 5 minutos y volver a suspender en 1 ml de DMEM con FBS al 1%.
5. Contar el número de células viables (según Mi Adultocroglia 3.1/3.2) y las células se dividieron en placas de cultivo de tejidos en la densidad experimental deseado. Aproximadamente 1x10 ⁶ microglia se recolectan de una placa de 10 cm que contiene la corteza del cerebro 4. Por inmunofluorescencia, se recomienda una densidad de 2.5x10 ⁴ células por 18 mm cubreobjetos.
6. Permitir al menos 24 horas para las células microgliales para volver completamente a su, ramificado estado de reposo antes de su uso.

El texto del Protocolo: (Microglia adulto)

1. Colección de tejidos

1. Placas de cultivo de tejidos de capa con poli-D-lisina (PDL) durante 3 horas a 37 ° C o durante la noche a 4 ° C. Lavar las placas una vez con agua tratada en autoclave inmediatamente antes de su uso.
2. La eutanasia ratón por asfixia de CO ₂ y de cerciorarse de que la eutanasia se ha completado. Limpiar el área de la médula espinal con etanol al 70%.
3. El uso de un par de tijeras corta la piel en la parte superior de la médula espinal, a continuación, proceder al corte de la médula espinal a cabo región de T1 a T12. Cortarel músculo restante fuera de los lados de la médula espinal.
4. Reducir lentamente las vértebras usando micro tijeras mientras sostiene suavemente la médula espinal con los dedos. Sea no se tiene cuidado a la punción de la médula espinal como el tejido es muy suave. Extraer lentamente la médula espinal utilizando microforceps.
5. Sumergir la médula espinal en una placa de Petri que contiene HBSS enfriado con hielo. El uso de un microscopio de luz eliminar todos meninges visibles utilizando microforceps
6. Cortar la médula espinal en los segmentos transversales suficientemente pequeños como para generar varios fragmentos. El espesor de los fragmentos no debe ser más de 2 mm con el fin de facilitar la digestión eficiente. Transferencia de las piezas de la médula espinal a un tubo cónico de 15 ml que contiene 1 ml de HBSS enfriado con hielo. Mantenga el tubo en hielo hasta la etapa de digestión.

2. La digestión del tejido

1. Aspirar HBSS de tubo cónico de 15 ml que contiene tejido de la médula espinal. Tenga cuidado de no aspirar cualquier pedazo de tejido.
2. Añadir 1 ml de tripsina (2.5 g / L de tripsina porcina irradiada y 0,2 g / l de EDTA en HBSS) y se incuba a 37 ° C durante 30 min.
3. Para detener la digestión eliminar la tripsina y añadir 3 ml de medio de microglia primario que contiene suero para detener la digestión enzimática.
4. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para sacar el tejido. Se filtra la suspensión celular usando un filtro de células de 40 micras.

3. Recuento celular y Recubrimiento

1. Mezclar un volumen igual de suspensión de células y la solución de DAPI.
2. Contar las células usando un hemocitómetro.
3. Placa a una densidad entre 5-7x10 ⁵ células / ml en PDL recubiertos 35 x 10 mm platos. Revestimiento a una densidad más baja impidió el crecimiento celular incluso cuando las células se cultivaron en placas de 12 pocillos que tienen un área más pequeña en comparación con 35 platos de 10 mm x.

Resultados

Un ejemplo de las células microgliales en reposo y activados se muestra en la Figura 1. La microglía se visualizaron 24 h después de la siembra (Figura 1a) y exhiben morfología ramificada (en reposo). La exposición al reactivo de cebado, lipopolisacárido (LPS) bacterianos en los resultados de los cambios en la morfología microglial como las células se activan (Figura 1b).

Un ejemplo de recuento de las células para la deposici?...

Discusión

La microglía modular SNC funcionamiento normal, así como las respuestas inflamatorias a diversas patologías. Funcional remodelación sináptica por la microglía se ha implicado en el mantenimiento de la homeostasis normal del cerebro ^15. Durante la cascada neurogénica que participan en el aclaramiento de las células progenitoras neurales de la circunvolución dentada del hipocampo ^{4, 16.} Por lo tanto, es necesario desarrollar un sistema de cultivo en el que para estudiar la microglía neonata...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidocaine, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-Cl
Gentamycin Sulfate	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish	Falcon	353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml			Dilute 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV