Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы

Резюме

Приведем схему методов для эффективного и быстрого выделения / культуре жизнеспособных микроглии из головного мозга новорожденных и взрослых спинного мозга. Вскрытие и покрытие корковых микроглии может быть достигнуто в течение 90 минут, с последующим микроглии урожая происходят ~ 10 дней после первого вскрытия.

Аннотация

Микроглии являются резидентами макрофаг-подобные клетки центральной нервной системы (ЦНС) и, таким образом, имеют критически важную роль в физиологических и патологических процессах, таких как ЦНС созревания в развитии, рассеянный склероз и травмы спинного мозга. Микроглии может быть активирована и работу к действию повреждение нейронов или стимуляции, такие как повреждением аксонов увидеть в MS или ишемический мозговой травмы в результате инсульта. Эти иммунокомпетентных членов ЦНС также думают, играют роль в синаптической пластичности, не связанных с патологическими состояниями. Мы используем протоколы для культивирования микроглии от новорожденных и взрослых тканей, которые направлены максимального количества жизнеспособных клеток при минимальных искажающих факторов, таких, как наличие других типов клетки ЦНС и мусора клеточной культуры. Мы используем большой и легко заметных ЦНС компонентов (например, мозга, сегментов спинного мозга), что делает весь процесс возможно и воспроизводимым. Использование взрослой клеткис является подходящей альтернативой использованию новорожденных микроглии мозга, так как многие патологии изучали главным образом влияют на постнатальный спинного мозга. Эти культуры системы также могут быть использованы для непосредственного тестирования эффекта соединений, которые могут быть либо ингибировать или стимулировать активацию микроглии. После активации микроглии может формировать результаты заболевание у взрослого ЦНС, существует необходимость в пробирке систем, в которых новорожденных и взрослых микроглии можно культивировать и изучены.

Введение

Микроглии резидентом иммунных клетках ЦНС, наиболее близкие по периферийным макрофагов в структуре и функции ^1. Недавно было показано, что клетки микроглии послеродовой вытекают из примитивных предшественников миелоидного и генерируется до восьмой день эмбриогенеза, переворачивая предыдущие понятия, что послеродовая кроветворные предшественники являются источником микроглии в мозге взрослого ^2. Они играют ключевую роль в нескольких неврологических заболеваний и может быстро реагировать на инфекцию или травму, выпустив провоспалительных или противовоспалительных цитокинов ^3. Таким образом микроглии охватывают автономное устройство в ЦНС, что можно манипулировать, чтобы влиять на прогрессирование заболевания. Разработка надежных и воспроизводимых методов, чтобы изолировать и культуре неонатальных или взрослого клетки микроглии важно будущих исследований.

Микроглии, как известно, критический игроков в ряде патологий мозга. Совсем недавно ролы появляются на клетки в нормальное развитие и функционирование мозга как микроглии фагоцитируют избыток предшественников нервных клеток с зубчатой ​​извилине гиппокампа ^{1, 4.} Микроглии может также модулировать несколько неврологических заболеваний, которые влияют на спинного мозга, таких как MS, невропатическая боль и травмы спинного мозга ^5-7. Спинной микроглии шнур реагируют по-разному по сравнению с мозгом микроглии в ответ на активацию сигналов ^{8, 9,} вероятно, связано с различиями в местной окружающей среде. Таким образом, важно создать соответствующий в системе пробирке культуру и изучать спинной микроглии мозга. Новорожденных микроглии производства значительно большего из провоспалительных цитокинов оксида азота по сравнению с клетками взрослого после экстракорпорального стимуляции IFN-γ и ^TNF-10,11 дальнейшее выделение необходимости использовать взрослые клетки микроглии изучать в контексте тех или иных заболеваний.

Протокол мы используем в лаборатории для Culture новорожденных микроглии является разновидностью современных методов, которые используют встряхивания смешанного глиальных культур, с тем, чтобы удалить микроглии с поверхности колбы культуры клеток ^12. Мы также описывают способ для культуры микроглии от взрослой мыши спинного мозга на основе протокола впервые описан Yip и др. ^13. Этот метод обеспечивает более быстрый способ, чтобы культура клеток взрослого по сравнению с другими доступными протоколы ^14. Полученный препарат на 70% микроглии, а оставшуюся часть состоит из астроцитов. Хотя чистота нашей культуры ниже по сравнению с другими опубликованными методами ^13, эта культура система полезна для изучения микроглии в культуре ответ на различные стимулы активирующий а также для изучения заболеваний, которые поражают главным образом в спинном мозге и в котором сильное воспалительная реакция является основной функцией.

Все протоколы, описанные были одобрены Stony Brook UniversiTY IACUC.

протокол

1. Вскрытие (День 0)

1. Анестезии в P0-2 мыши щенков с гипотермией. Протрите главы щенков Kimwipe пропитанной 70% этанолом для дезинфекции тканей.
2. Удалите головы с ножницами, используя 4 щенков на 10 см пластины культуры. Поместите голову в чашку Петри, содержащую буфер ледяной Хэнка.
3. Якорь глав использованием изогнутых щипцов через глазницы и осторожно удалите кожа, покрывающая череп с прямыми microforceps.
4. Удалить кости черепа с прямыми microforceps, используя осторожностью Не прокола или повреждения коры. Наиболее эффективный способ, чтобы начать удаление начиная возле мозжечке, который расположен у основания головы, так как эта область будет отброшен.
5. Снимите мозга с небольшим шпателем, и поместить (4) мозги в свежем чашку Петри, содержащую буфер ледяной Хэнка.
6. Все шаги, с этого момента использовать microforceps и выполняются под Disseие микроскопом. Начиная с брюшной стороны головного мозга, закрепить ткань, удерживая мозжечка и сделать две небольшие разрезы по обе стороны от среднего мозга. Будьте осторожны, чтобы не порезать на всем пути через ткань, так как кора мозга покрытия в этом регионе.
7. Аккуратно дразнить среднего мозга и мозжечка в одной части из двух коры. Два коре должны формировать вогнутую форму.
8. Отделите одну кору и ориентировать одну кору с медиальной стороны на дальнейшее рассечение. Гиппокамп может быть трудно наблюдать, но она расположена противоположно обонятельную луковицу, которая появляется как небольшой узелок на заостренный конец коры.
9. Удалить гиппокампа, который имеет серповидную форму. Переверните коры более, чтобы посмотреть в спинной стороне.
10. Использование обонятельной луковицы в качестве отправной точки, удалить все мозговые оболочки и обонятельной луковицы себя от коры.
11. Расчлененный коры должны быть помещены в 15 мл конические пробирки с 14 мл Colбуфером D Хэнка солевой на льду.

2. Культура клеток (День 0)

1. Предварительное покрытие 10 см культуре ткани блюда с 5 мкг / мл поли-D-лизин (PDL), разбавленный водой в автоклаве в течение 3 часов при 37 ° С.
2. Аспирируйте PDL, и мыть пластины один раз автоклавного воды. Сухие пластины под воздействием УФ в капот культуры ткани в течение 20 мин. Этот шаг должен быть выполнен только до вскрытия процесса.
3. Буфер Аспирируйте Хэнка из пробирки, содержащие от 4 коре мозга каждый, применяют 4 мл 1x трипсин / ЭДТА, растирают ткани с p1000 наконечник, и место труб в 37 ° С в инкубаторе в течение 15 мин.
4. Добавить 4 мл полной микроглии СМИ на пробирку, чтобы остановить ферментативного расщепления, перемешать, и спином вниз содержимого при 1.5K мин в течение 5 мин.
5. Супернатант и повторить мытье с 4 мл полной среды. Ресуспендируют клеток в 10 мл полной среды микроглии (DMEM с 10% FBS, 1% пирувата натрия, 0,08% гентамицина) и фильтруют через 40 микроN ячейки сетки фильтра.
6. Пластина при плотности 8 коре на 10 мл в 10 см ткани планшет для культивирования и место в культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO ₂ (см. взрослых микроглии протокол).

(День 3)

1. Изменить СМИ во всех клеточных культур блюда с полным микроглии СМИ.

(10 день)

1. Добавить 400 мкл 60 мМ лидокаина в HBSS (для отсоединения микроглии) в среде 10 см пластины тканевой культуры и инкубируют при комнатной температуре (RT) в течение 10-15 мин.
2. Сбор средств массовой информации / суспензии клеток с пластинки, и промыть пластины один раз буфером Хэнка. Соберите промывочного буфера для восстановления оставшихся микроглии.
3. Добавляют 5 мМ ЭДТА (рН 8,0) к клеточной суспензии до конечной концентрации 50 мкМ или в разведение 1/100.
4. Спин вниз клеточной суспензии на 1000 мкг (1500 оборотов в минуту) в течение 5 мин и повторно суспендировать в 1 мл DMEM с 1% FBS.
5. Граф число жизнеспособных клеток (как за взрослого Миcroglia 3.1/3.2) и разбить ячейку на тканевую культуру, в нужной экспериментальной плотности. Приблизительно 1.10 ⁶ микроглии собирают из 10 см пластины, содержащей мозга из 4 мозгов. Для иммунофлюоресценции, плотность 2.5x10 ⁴ клеток на 18 мм покровным рекомендуется.
6. Позвольте по крайней мере 24 часов для клетки микроглии, чтобы полностью вернуться в свои разветвленные, состояние покоя перед использованием.

Протокол Текст: (Взрослый микроглии)

1. Коллекция тканей

1. Coat планшетах для культуры тканей с поли-D-лизин (PDL) в течение 3 ч при 37 ° С или в течение ночи при 4 ° С. Промыть пластины один раз автоклавного воду непосредственно перед использованием.
2. Усыпить мыши, CO ₂ удушья и выяснить, что эвтаназия является полным. Очистите спинной области шнур с 70% этанола.
3. С помощью ножниц порезать кожу в верхней части спинного мозга, после чего перейдите сократить спинного мозга из области T1 до T12. ВырезатьОстальные мышцы от боковых сторон спинного мозга.
4. Медленно сократить позвонков использованием microscissors, как вы аккуратно провести спинного мозга кончиками пальцев. Будьте осторожны, чтобы не проколоть спинного мозга, ткань очень мягкая. Медленно извлечь спинного мозга использованием microforceps.
5. Погрузите спинного мозга в чашке Петри содержащие ледяной HBSS. С помощью светового микроскопа удаление всех видимых мозговых оболочек использованием microforceps
6. Разрежьте спинного мозга в поперечном сегментах достаточно малы, чтобы создать несколько фрагментов. Толщина фрагменты не должно быть более чем на 2 мм, чтобы способствовать эффективному пищеварению. Передача части спинного шнур в 15 мл коническую трубку с 1 мл ледяного HBSS. Держите трубку на льду до пищеварения шаг.

2. Переваривание тканей

1. Аспирируйте ССРХ от 15 мл коническую трубку с ткани спинного мозга. Будьте осторожны, чтобы не аспирации любой кусок ткани.
2. Добавить 1 мл трипсина (2.5 г / л облученных свиной трипсин и 0,2 г / л EDTA в HBSS), и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин.
3. Чтобы остановить пищеварения удалить трипсина и добавляют 3 мл основной среды микроглии, которая содержит сыворотку, чтобы остановить ферментативного расщепления.
4. Внесите вверх и вниз, чтобы сместить ткани. Фильтр клеточной суспензии использованием 40 мкм ячейки фильтра.

3. Подсчет клеток и покрытия

1. Смешайте равные объемы клеточной суспензии и раствор DAPI.
2. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
3. Пластина с плотностью в пределах от 5-7x10 ⁵ клеток / мл в PDL покрытием 35 х 10 мм чашках. Покрытие по более низкой плотности предотвратить рост клеток, даже когда клетки культивировали в 12-луночных планшетах, которые имеют меньшую площадь по сравнению с 35 х 10 мм чашках.

Результаты

Пример покоящихся и активированных клеток микроглии показано на рисунке 1. Микроглии визуализировали 24 часа после нанесения покрытия (рис. 1а) и обладают разветвленной (в состоянии покоя) морфологии. Воздействие грунтовки реагент, бактериальный липополисахарид (LPS...

Обсуждение

Микроглии модулировать нормальное функционирование ЦНС, а также воспалительные реакции к различным патологиям. Функциональные синаптической ремоделирования микроглии был вовлечен в поддержание нормального гомеостаза мозга ^15. Во время нейрогенного каскада они участвуют в офо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidocaine, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-Cl
Gentamycin Sulfate	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish	Falcon	353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml			Dilute 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV