Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Zusammenfassung

Wir skizzieren Methoden für die effiziente und schnelle Isolierung / Kultur lebensfähiger Mikroglia aus dem Neugeborenen Hirnrinde und erwachsenen Rückenmark. Die Präparation und Beschichtung der kortikalen Mikroglia kann innerhalb von 90 Minuten erreicht werden, mit der anschließenden Mikroglia Ernte stattfindet ~ 10 Tage nach der ersten Sektion.

Zusammenfassung

Mikroglia sind die ansässigen Makrophagen-ähnlichen Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) und als solche haben kritisch wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen wie CNS Reifung in der Entwicklung, Multiple Sklerose und Rückenmarksverletzungen. Mikrogliazellen aktiviert und rekrutiert zum Handeln durch neuronale Verletzungen oder Stimulation, wie axonalen Schäden in MS oder ischämischer Hirn-Trauma von Schlaganfällen gesehen. Diese immunkompetenten Mitglieder des ZNS sind auch gedacht, um Rollen in synaptische Plastizität unter nicht-pathologischen Bedingungen haben. Wir beschäftigen Protokolle für die Kultivierung Mikroglia von den Neugeborenen und Erwachsenen Gewebe, die das Ziel, die Anzahl lebender Zellen zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der Störvariablen, wie das Vorhandensein von anderen ZNS Zelltypen und Zellkultur Trümmer sind. Wir nutzen große und leicht erkennbare CNS Komponenten (zB Cortex, Rückenmark Segmente), die den gesamten Prozess durchführbar und reproduzierbar macht. Die Verwendung von adulten Zelles ist eine geeignete Alternative zur Verwendung von neonatalen Gehirn Mikroglia, da viele Erkrankungen betreffen hauptsächlich untersuchten die postnatale Rückenmark. Diese Kultur Systeme eignen sich auch zur direkten Prüfung der Wirkung von Verbindungen, die entweder hemmen oder fördern Mikroglia-Aktivierung kann. Da Mikroglia-Aktivierung kann die Ergebnisse der Krankheit in adulten ZNS gestalten, gibt es einen Bedarf für in-vitro-Systemen in der Neugeborenen und Erwachsenen Mikroglia gezüchtet und untersucht werden können.

Einleitung

Mikroglia sind die Immunzellen Bewohner des ZNS, am ähnlichsten peripheren Makrophagen in Struktur und Funktion ^1. Es wurde kürzlich gezeigt, dass postnatale Mikrogliazellen von primitiven myeloischen Vorläuferzellen ableiten und vor dem achten Tag der Embryogenese erzeugt, Hochkantstellen die bisherige Vorstellung, dass postnatale hämatopoetischen Vorläuferzellen die Quelle der Mikroglia im adulten Gehirn ² sind. Sie spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen neurologischen Erkrankungen und können schnell zu Infektionen oder Verletzungen reagieren durch Freisetzung pro-inflammatorische oder anti-inflammatorische Zytokine ^3. So Mikroglia umfassen ein Standgerät im ZNS, die manipuliert, um den Krankheitsverlauf beeinflussen kann. Die Entwicklung von soliden und reproduzierbare Methoden zur Isolierung und Kultur Neugeborenen oder Erwachsenen Mikrogliazellen ist wichtig, um zukünftige Studien.

Mikroglia sind bekanntermaßen kritisch Spieler in einer Reihe von Hirnerkrankungen sein. In jüngerer Zeit roles sind für die Zellen in normale Entwicklung des Gehirns und fungieren als Mikroglia Phagozytose überschüssige neuronale Vorläuferzellen aus dem Gyrus dentatus des Hippocampus ^{1, 4} entstehen. Mikroglia modulieren können auch mehrere neurologischen Erkrankungen, die das Rückenmark betreffen, wie z. B. MS, neuropathische Schmerzen und Verletzungen des Rückenmarks ^5-7. Rückenmark Mikroglia reagieren unterschiedlich gegenüber Gehirn Mikroglia in Reaktion auf Ansteuersignale ^{8, 9,} vermutlich aufgrund der Unterschiede in der lokalen Umgebung. Daher ist es wichtig, eine geeignete in vitro System, um Kultur und studieren Rückenmark Mikroglia. Neonatal Mikroglia produzieren deutlich mehr von der pro-inflammatorische Zytokin Stickstoffmonoxid im Vergleich zu erwachsenen Zellen nach in vitro Stimulation mit IFN-γ oder TNF-a ^10,11 weiter hervorgehoben wird, dass adulte Zellen verwenden, um Mikroglia im Rahmen von bestimmten Krankheiten zu studieren.

Das Protokoll beschäftigen wir im Labor auf culture Neugeborenen Mikroglia ist eine Variante des letzten Methoden Schütteln gemischt Gliakulturen in dem Bemühen, die Mikroglia der Oberfläche der Zellkulturflasche ¹² entfernen zu nutzen. Wir beschreiben auch ein Verfahren zur Kultur von Mikroglia der adulten Maus Rückenmark über ein Protokoll zuerst von Yip et al ¹³ beschrieben ist. Diese Methode bietet einen schnelleren Weg zur Kultur adulter Zellen im Vergleich zu anderen verfügbaren Protokolle ^14. Das erhaltene Präparat beträgt 70% Mikroglia, die restlichen Prozentsatz wird von Astrozyten zusammen. Obwohl die Reinheit der Kultur ist niedriger im Vergleich zu anderen veröffentlichten Verfahren ¹³ ist dieses Kultursystem zur Erkundung der Mikroglia in Kultur als Antwort auf verschiedene aktivierende Stimuli sowie zur Untersuchung von Krankheiten, die hauptsächlich im Bereich des Rückenmarks und nützlich, in denen ein starker Entzündungsreaktion ist ein Hauptmerkmal.

Alle beschriebenen Protokolle wurden von der Stony Brook Universi genehmigtty IACUC.

Protokoll

1. Dissection (Tag 0)

1. Induce Anästhesie p0-2 Maus Welpen mit Unterkühlung. Wischen Sie die Köpfe der Welpen mit einem Kimwipe in 70% Ethanol getränkt, um das Gewebe zu desinfizieren.
2. Entfernen Sie die Köpfe mit einer Schere, mit 4 Welpen pro 10 cm Kulturschale. Legen Sie die Köpfe in einer Petrischale mit eiskaltem Hanks Puffer.
3. Verankern Sie die Köpfe mit einer gebogenen Pinzette durch die Augenhöhlen und entfernen Sie vorsichtig die Haut über den Schädel mit geraden microforceps.
4. Entfernen Sie die Schädelknochen mit geraden microforceps, mit Vorsicht, nicht gewaltsam öffnen oder Schäden an den Rinden. Der effektivste Weg ist, um die Entfernung beginnend in der Nähe des Kleinhirns, die an der Basis des Kopfes befindet, da diese Region verworfen beginnen.
5. Entfernen Sie das Gehirn mit einem kleinen Spatel, und legen Sie die (4) Gehirne in einer frischen Petrischale mit eiskaltem Hanks Puffer.
6. Alle Schritte ab diesem Zeitpunkt nutzen microforceps und werden unter einer disse durchgeführtktion Mikroskop. Beginnend an der ventralen Seite des Gehirns, das Gewebe zu verankern, indem das Kleinhirn und sich zwei kleine Einschnitte an beiden Seiten der Mittelhirn. Achten Sie darauf, den ganzen Weg durch das Gewebe schneiden, da die Rinden der Mittelhirn in dieser Region zu decken.
7. Sanft necken die Mittelhirn und Kleinhirn in einem Stück aus den beiden Rinden. Die beiden sollten Kortex bilden eine konkave Form.
8. Trennen Sie die beiden Kortex und orientieren einem einzigen Cortex mit der medialen Seite für weitere Präparation. Der Hippocampus kann schwierig sein, zu beobachten, aber es befindet sich gegenüber dem Riechkolben, die als kleine Knoten an dem spitzen Ende des Kortex erscheint.
9. Entfernen Sie den Hippocampus, die einen Halbmond-Form hat. Klappen Sie den Cortex über die Rückenseite anzuzeigen.
10. Mit dem Riechkolben als Ausgangspunkt, entfernen Sie alle Hirnhäute und der Riechkolben sich von der Rinde.
11. Die seziert cortices sollte in 15 ml konische Röhrchen mit 14 ml col platziert werdend Hanks Salzlösung auf Eis.

2. Cell Culture (Tag 0)

1. Pre-Mantel 10 cm Zellkulturschalen mit 5 pg / ml Poly-D-Lysin (PDL) in autoklaviertes Wasser für 3 Stunden verdünnt bei 37 ° C
2. Saugen PDL, und waschen Platten einmal mit Wasser autoklaviert. Dry Platte unter der UV in der Gewebekultur Haube für 20 min. Dieser Schritt sollte kurz vor der Zerlegung durchgeführt werden.
3. Aspirate Hanks Puffer aus Röhrchen mit den Rinden von 4 Gehirne jeweils gelten 4 ml 1x Trypsin / EDTA-Lösung, verreiben Gewebe mit p1000 Spitze und Ort Röhren in 37 ° C Inkubator für 15 min.
4. 4 ml komplette Mikroglia Medien pro Röhre, um die enzymatische Verdauung, mix, stoppen und Spin-down Inhalte bei 15K rpm für 5 min.
5. Saugen Sie den Überstand und wiederholen Wäsche mit 4 ml komplette Medien. Die Zellen in 10 ml komplettem Mikroglia Medien (DMEM mit 10% FBS, 1% Natriumpyruvat, 0,08% Gentamycin), und durch ein 40 micron Masche Sieb.
6. Platte mit einer Dichte von 8 Kortex pro 10 ml in einem 10 cm Gewebekulturplatte und Ort in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C und 5% CO ₂ (siehe Adult Mikroglia-Protokoll).

(Tag 3)

1. Ändern Medien in allen Zellkulturschalen mit kompletter Mikroglia Medien.

(Tag 10)

1. In 400 Mikroliter 60 mM Lidocain in HBSS (Mikroglia zu lösen) in Medium der 10-cm-Zellkulturplatten und Inkubation bei Raumtemperatur (RT) für 10-15 min.
2. Sammeln Sie die Medien / Zellsuspension von der Platte, und waschen Sie die Platte einmal mit Hanks-Puffer. Sammeln Sie die restlichen Waschpuffer Mikroglia erholen.
3. In 5 mM EDTA (pH 8,0) zu der Zellsuspension in einer Endkonzentration von 50 pM oder bei einer Verdünnung 1/100.
4. Spin down Zellsuspension bei 1.000 xg (1500 rpm) für 5 min und in 1 ml DMEM resuspendieren mit 1% FBS.
5. Graf Zahl der lebensfähigen Zellen (als Erwachsener pro Microglia 3.1/3.2) und Split-Zellen in Zellkulturplatten an der gewünschten experimentellen Dichte. Etwa 1x10 ⁶ Mikroglia sind aus einer 10 cm Platte mit den Rinden von 4 Gehirne geerntet. Für Immunfluoreszenz wird eine Dichte von 2.5x10 ⁴ Zellen pro 18 mm Deckglas empfohlen.
6. Lassen Sie mindestens 24 Stunden für die Mikroglia-Zellen vollständig auf ihre verzweigten, ruhenden Zustand vor zu bedienen.

Protokoll Text: (Adult Mikroglia)

1. Gewebeentnahme

1. Coat Zellkulturplatten mit Poly-D-Lysin (PDL) für 3 Stunden bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° C. Waschen der Platten einmal mit autoklaviertem Wasser unmittelbar vor der Verwendung.
2. Euthanize Maus durch CO ₂ Ersticken und festzustellen, dass die Sterbehilfe abgeschlossen ist. Reinigen des Rückenmarks mit 70% Ethanol.
3. Mit einer Schere schneiden Sie die Haut an der Spitze des Rückenmarks, dann fahren Sie mit dem Rückenmark ausgeschnitten aus Region T1 bis T12. Schneidendie restlichen Muskeln aus der Seiten des Rückenmarks.
4. Langsam senken die Wirbel mit Mikroschere wie halten Sie sanft das Rückenmark mit den Fingerspitzen. Achten Sie darauf, Punktion des Rückenmarks, während das Gewebe ist sehr weich. Langsam extrahieren das Rückenmark mit microforceps.
5. Tauchen Sie das Rückenmark in einer Petrischale mit eiskaltem HBSS. Mit einem Lichtmikroskop entfernen alle sichtbaren Hirnhäute mit microforceps
6. Schneiden Sie das Rückenmark in transversale Segmente klein genug, um mehrere Fragmente zu erzeugen. Die Dicke der Fragmente sollte nicht mehr als 2 mm, um eine effiziente Verdauung zu erleichtern. Übertragen Sie die Rückenmark Stücke zu 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml eiskaltem HBSS. Halten Sie das Röhrchen auf Eis, bis die Verdauung Schritt.

2. Verdauung von Tissue

1. Saugen HBSS von 15 ml konischen Röhrchen mit Gewebe des Rückenmarks. Achten Sie darauf, jedes Stück Gewebe anzusaugen.
2. 1 ml Trypsin (2.5 g / L bestrahlten Schweine Trypsin und 0.2 g / L EDTA in HBSS) und bei 37 ° C inkubiert für 30 min.
3. So stoppen Sie die Verdauung entfernen Trypsin und 3 ml der primären Mikroglia Medium, das Serum, um die enzymatische Verdauung stoppen enthält.
4. Pipettieren nach oben und unten, um das Gewebe zu entfernen. Filtern Sie die Zellsuspension mit einer 40 um Zellsieb.

3. Zellzählung und Oberflächen

1. Mix gleichen Volumen Zellsuspension und DAPI-Lösung.
2. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
3. Platte mit einer Dichte zwischen 5-7x10 ⁵ Zellen / ml in PDL beschichteten 35 x 10 mm-Schalen. Überzug mit einer niedrigeren Dichte verhindert das Zellwachstum auch wenn Zellen wurden in 12-Well-Platten, die eine kleinere Fläche haben im Vergleich zu 35 x 10 mm-Schalen kultiviert.

Ergebnisse

Ein Beispiel von ruhenden und aktivierten Mikrogliazellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Mikroglia wurden visualisiert 24 Stunden nach der Beschichtung (Abbildung 1a) und weisen verzweigte (Ruhe) Morphologie. Die Exposition gegenüber der Grundierung Reagenz geworden bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) zu Veränderungen in Mikroglia Morphologie der Zellen aktiviert (Abbildung 1b).

Ein Beispiel für das Zählen der Zellen, für di...

Diskussion

Mikroglia modulieren CNS normale Funktionieren sowie Entzündungsreaktionen zu verschiedenen Pathologien. Functional synaptischen Umbau von Mikroglia in der Aufrechterhaltung des normalen Gehirn Homöostase ¹⁵ in Verbindung gebracht. Während der neurogenen Kaskade sie beteiligen sich an der Clearance von neuralen Vorläuferzellen aus dem Gyrus dentatus des Hippocampus ^{4, 16.} Daher ist es notwendig, eine Kultur, bei dem Neugeborenen und Erwachsenen Mikroglia, die die große Schwade der Entwicklung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidocaine, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-Cl
Gentamycin Sulfate	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish	Falcon	353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml			Dilute 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV