Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Riepilogo

Noi descriviamo i metodi per l'efficiente e rapido isolamento / cultura della microglia praticabile dalla corteccia cerebrale neonatale e midollo spinale adulto. La dissezione e la placcatura di microglia corticale può essere realizzato entro 90 minuti, con la conseguente raccolta microglia in atto ~ 10 giorni dopo la dissezione iniziale.

Abstract

Microglia sono i residenti i macrofagi del sistema nervoso centrale (SNC) e, come tali, hanno ruoli criticamente importanti in processi fisiologici e patologici quali CNS maturazione in sviluppo, sclerosi multipla, e lesioni del midollo spinale. Microglia può essere attivato e reclutato per azione da lesioni o la stimolazione neuronale, come il danno assonale visto in MS o di un trauma cerebrale ischemico derivanti da ictus. Questi membri immunocompetenti del SNC sono anche pensato di avere un ruolo nella plasticità sinaptica in condizioni non patologiche. Impieghiamo protocolli per coltura microglia dai tessuti neonatali e adulti che mirano a massimizzare il numero di cellule vitali minimizzando variabili confondenti, quali la presenza di altri tipi di cellule del SNC e coltura detriti cellulari. Utilizziamo grandi e facilmente individuabile componenti del sistema nervoso centrale (ad esempio corteccia, segmenti del midollo spinale), che rende l'intero processo fattibile e riproducibile. L'uso di cellula adultas è una valida alternativa all'uso di microglia cerebrale neonatale, come molte patologie indagate interessano principalmente l'postnatale midollo spinale. Questi sistemi di coltura sono anche utile per testare direttamente l'effetto di composti che possono sia inibire o promuovere attivazione della microglia. Dal attivazione della microglia può plasmare gli esiti delle malattie del sistema nervoso centrale adulto, vi è la necessità per i sistemi in vitro in cui microglia neonatale e adulta può essere coltivato e studiato.

Introduzione

Microglia sono le cellule immunitarie residenti del SNC, maggiormente somiglianti macrofagi periferici per struttura e funzione ^1. E 'stato recentemente dimostrato che le cellule microgliali postnatali derivano da progenitori mieloidi primitivi e sono generati prima dell'ottavo giorno di embriogenesi, rovesciando il concetto precedente che postnatali progenitori emopoietici sono la fonte della microglia nel cervello adulto ^2. Essi giocano un ruolo chiave in diverse malattie neurologiche e possono rispondere rapidamente alle infezioni o lesioni attraverso il rilascio di citochine pro-infiammatorie e anti-infiammatori ^3. Così microglia comprendono una unità autonoma nel SNC che possono essere manipolati per influenzare la progressione della malattia. Lo sviluppo di metodi robusti e riproducibili per isolare e coltivare le cellule microgliali neonatali o adulto è importante per gli studi futuri.

Microglia sono noti per essere giocatori critici in un certo numero di patologie cerebrali. Più di recente, roles stanno emergendo per le cellule nel normale sviluppo del cervello e la funzione come microglia fagocitare eccesso di cellule progenitrici neurali del giro dentato dell'ippocampo ^{1, 4.} Microglia può anche modulare le diverse condizioni neurologiche che colpiscono il midollo spinale, come MS, dolore neuropatico, e le lesioni del midollo spinale ^5-7. Microglia midollo spinale reagiscono in modo diverso rispetto al cervello microglia in risposta ai segnali di attivazione ^{8, 9,} probabilmente a causa delle differenze nell'ambiente locale. Quindi è importante stabilire un adeguato sistema in vitro per studiare la cultura e microglia midollo spinale. Microglia neonatali producono significativamente maggiore della citochina pro-infiammatoria ossido di azoto rispetto a cellule adulte dopo stimolazione in vitro con IFN-γ o TNF-a ^10,11 un'ulteriore evidenziando la necessità di utilizzare cellule adulte per studiare microglia nel contesto di alcune malattie.

Il protocollo impieghiamo in laboratorio per culture microglia neonatale è una variazione di metodi recenti che utilizzano agitazione di colture gliali miste nel tentativo di rimuovere la microglia dalla superficie del pallone di coltura cellulare ^12. Noi descriviamo anche un metodo per cultura microglia dal midollo spinale adulto topo basata su un protocollo prima descritto da Yip, et al ^13. Questo metodo fornisce un modo più rapido per le cellule adulte della cultura rispetto ad altri protocolli disponibili ^14. La preparazione risultante è del 70% microglia; la percentuale rimanente è costituita da astrociti. Sebbene la purezza della nostra cultura è più basso rispetto ad altri metodi pubblicati ^13, questo sistema di coltura è utile per esplorare la microglia in coltura risposta a vari stimoli attivanti e anche per lo studio di malattie che colpiscono principalmente il midollo spinale e in cui una forte risposta infiammatoria è una caratteristica principale.

Tutti i protocolli descritti sono stati approvati dalla Stony Brook University IACUC.

Protocollo

1. Dissection (giorno 0)

1. Indurre l'anestesia per p0-2 cuccioli di topo con ipotermia. Pulire le teste dei cuccioli con un Kimwipe imbevuto di etanolo al 70% per disinfettare il tessuto.
2. Togliere le teste con un paio di forbici, con 4 cuccioli per 10 cm piastra di coltura. Mettere le teste in una capsula di Petri contenente tampone di ghiaccio-freddo Hank.
3. Ancorare le testine utilizzando pinze curve attraverso le orbite e rimuovere con attenzione la pelle che ricopre il cranio con microforceps dritte.
4. Togliere le ossa craniche con microforceps rette, prestando attenzione a non forare o danneggiare la corteccia. Il modo più efficace è quello di iniziare la rimozione partire vicino il cervelletto, che si trova alla base della testa, come sarà scartata questa regione.
5. Togliere il cervello con una spatolina, e posizionare le (4) cervelli in una capsula di Petri contenente tampone fresco di ghiaccio freddo Hank.
6. Tutti i passi da questo punto in poi utilizzano microforceps e vengono eseguite sotto una diffuction microscopio. Partendo dal lato ventrale del cervello, ancorare il tessuto tenendo il cervelletto e fare due piccole incisioni ai lati del mesencefalo. Fare attenzione a non tagliare tutto il percorso attraverso il tessuto, come le cortecce coprono il mesencefalo in questa regione.
7. Stuzzicare delicatamente il mesencefalo e cervelletto in un pezzo da due cortecce. Le due cortecce dovrebbero formare una forma concava.
8. Separare le due cortecce e orientare una sola corteccia con il lato mediale per ulteriore dissezione. L'ippocampo può essere difficile da osservare, ma si trova di fronte del bulbo olfattivo che appare come un piccolo nodulo sull'estremità appuntita della corteccia.
9. Rimuovere l'ippocampo, che ha una forma di mezzaluna. Capovolgere la corteccia sopra per vedere il lato dorsale.
10. Utilizzando il bulbo olfattivo come punto di partenza, rimuovere tutte le meningi e il bulbo olfattivo stesso dalla corteccia.
11. Le cortecce sezionati devono essere collocati in provette coniche da 15 ml con 14 ml di Colsoluzione fisiologica tamponata di d Hank su ghiaccio.

2. Colture Cellulari (giorno 0)

1. Pre-coat 10 centimetri di tessuto piastre di coltura con 5 pg / ml di poli-D-lisina (PDL) diluito in acqua autoclavato per 3 ore a 37 ° C.
2. Aspirare Pdl, e piatti lavare una volta con acqua sterilizzata. Monodisco a secco sotto l'UV nella cappa coltura tissutale per 20 min. Questa operazione deve essere eseguita appena prima del processo di dissezione.
3. Tampone di Hank aspirato dalle provette contenenti le cortecce da 4 cervelli ciascuno, applicare 4 ml di soluzione 1x tripsina / EDTA, triturare tessuto con p1000 punta, e posto i tubi nel 37 ° C incubatore per 15 min.
4. Aggiungere 4 ml di mezzi completi microgliali per tubo per fermare la digestione enzimatica, mescolare e centrifugare contenuto a 1.5K rpm per 5 min.
5. Aspirare il surnatante e ripetere lavata con 4 ml di mezzi completi. Risospendere le cellule in 10 ml di mezzi microgliali completi (DMEM con 10% FBS, 1% sodio piruvato, 0.08% gentamicina) e filtrare attraverso un 40 micron colino cellula maglia.
6. Piastra ad una densità di 8 cortecce per 10 ml in una piastra di coltura 10 cm tissutale e posto in una coltura tissutale incubatore a 37 ° C e 5% di CO ₂ (Cfr. adulto protocollo Microglia).

(Giorno 3)

1. Modifica dei media in tutti i piatti di coltura di cellule microgliali con mezzi completi.

(Giorno 10)

1. Aggiungere 400 microlitri di 60 mm lidocaina in HBSS (per staccare microglia) in media di 10 cm di piastre di coltura di tessuto e incubare a temperatura ambiente (RT) per 10-15 min.
2. Raccogliere i media / sospensione di cellule dalla piastra, e lavare la piastra una volta con tampone di Hank. Raccogliere il tampone di lavaggio per recuperare rimanendo microglia.
3. Aggiungere 5 mM EDTA (pH 8,0) alla sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 50 mM o ad una diluizione 1/100.
4. Spin down sospensione cellulare a 1.000 xg (1.500 rpm) per 5 min e risospendere in 1 ml di DMEM con 1% FBS.
5. Contare il numero di cellule vitali (come per Adulto Microglia 3.1/3.2) e celle divise in piastre di coltura di tessuti a densità sperimentale desiderato. Circa 1x10 ⁶ cellule microgliali vengono raccolte da una piastra di 10 cm contenente le cortecce da 4 cervelli. Per immunofluorescenza, si raccomanda una densità di 2.5x10 ⁴ cellule per 18 millimetri coprioggetto.
6. Lasciare almeno 24 ore per le cellule microgliali per tornare pienamente alla loro ramificata, stato di riposo prima dell'uso.

Protocollo Testo: (Adult microglia)

1. Collezione tessuti

1. Cappotto tessuto piastre di coltura con poli-D-lisina (PDL) per 3 ore a 37 ° C o per una notte a 4 ° C. Lavare le piastre una volta con acqua autoclavata immediatamente prima dell'uso.
2. Euthanize topo da CO ₂ asfissia e di accertare che l'eutanasia è completa. Pulire la zona del midollo spinale con il 70% di etanolo.
3. Usando un paio di forbici tagliare la pelle sulla parte superiore del midollo spinale; quindi procedere a tagliare il midollo spinale dalla regione T1 a T12. Tagliareil muscolo rimanenti fuori dei lati del midollo spinale.
4. Tagliare lentamente il vertebre utilizzando microscissors come si tiene delicatamente il midollo spinale con la punta delle dita. Siate attenti a non forare il midollo spinale come il tessuto è molto morbido. Lentamente estrarre il midollo spinale usando microforceps.
5. Immergere il midollo spinale in una capsula di Petri contenente HBSS ghiacciate. Utilizzando un microscopio ottico rimuovere tutti meningi visibili utilizzando microforceps
6. Tagliate il midollo spinale in segmenti trasversali sufficientemente piccole per generare diversi frammenti. Lo spessore dei frammenti non deve essere superiore a 2 mm, per facilitare la digestione efficiente. Trasferire i pezzi del midollo spinale di un tubo da 15 ml contenente 1 ml HBSS ghiacciate. Tenere il tubo in ghiaccio fino alla fase di digestione.

2. Digestione del Tissue

1. Aspirare HBSS da 15 ml tubo conico contenente tessuto del midollo spinale. Fare attenzione a non aspirare qualsiasi pezzo di tessuto.
2. Aggiungere 1 ml di tripsina (2.5 g / L irradiati suina tripsina e in HBSS 0,2 g / L EDTA) e incubare a 37 ° C per 30 min.
3. Per fermare la digestione rimuovere la tripsina e aggiungere 3 ml di mezzo microglia primaria che contiene siero di arrestare la digestione enzimatica.
4. Pipettare su e giù per rimuovere il tessuto. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un colino cella 40 micron.

3. Conta delle cellule e placcatura

1. Mescolare uguale volume di sospensione cellulare e la soluzione DAPI.
2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
3. Piastra ad una densità compresa tra 5-7x10 ⁵ cellule / ml nel PDL rivestite 35 x 10 piatti mm. Placcatura a una densità minore di prevenire la crescita cellulare anche quando le cellule sono state coltivate in piastre da 12 aventi un'area più piccola rispetto a 35 x 10 piatti mm.

Risultati

Un esempio di cellule microgliali riposo che attivate è mostrato in Figura 1. La microglia sono state visualizzate 24 ore dopo la placcatura (Figura 1a) e presentano ramificate (a riposo) morfologia. Esposizione al reagente adescamento, batteriche lipopolisaccaridi (LPS) provoca cambiamenti nella morfologia della microglia esempio le cellule diventano attivato (Figura 1b).

Un esempio di contare le cellule per la placcatura è mostrato...

Discussione

Microglia modulare CNS normale funzionamento così come le risposte infiammatorie a diverse patologie. Funzionale rimodellamento sinaptico da microglia è stata implicata nel mantenimento dell'omeostasi normale del cervello ^15. Durante la cascata neurogena partecipano alla liquidazione di cellule progenitrici neurali del giro dentato dell'ippocampo ^{4, 16.} Pertanto, è necessario sviluppare un sistema di coltura in cui studiare microglia neonatale e adulto, che coprirà la vasta fascia di sv...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidocaine, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-Cl
Gentamycin Sulfate	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish	Falcon	353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml			Dilute 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV