الفصل بين أنواع الخلايا المنوية عن طريق STA-PUT سرعة الترسيب

Summary

يسمح أسلوب STA-PUT للفصل بين مجموعات مختلفة من الخلايا المنوية على أساس الحجم والكثافة.

Abstract

الحيوانات المنوية لدى الثدييات هو عملية التمايز المعقدة التي تحدث في مراحل عدة في الأنابيب المنوية من الخصيتين. حاليا، لا يوجد نظام موثوق زراعة الخلايا مما يسمح لتمايز المنوية في المختبر، وتتطلب معظم الدراسات البيولوجية للخلايا المنوية الحصاد الأنسجة من النماذج الحيوانية مثل الماوس والفئران. لأن الخصية يحتوي على العديد من أنواع الخلايا - على حد سواء غير المنوية (ايديغ، سيرتولي، النخاعي، والخلايا الظهارية) والمنوية (أمهات المني، الخلايا المنوية، طلائع منوية الجولة، التكثيف طلائع منوية والحيوانات المنوية) - دراسات الآليات البيولوجية المعنية في الحيوانات المنوية تتطلب العزلة وإثراء هذه أنواع مختلفة من الخلايا. يسمح أسلوب STA-PUT لفصل السكان غير متجانسة من الخلايا - في هذه الحالة، من الخصيتين - من خلال BSA الانحدار الخطي. أنواع الخلايا الفردية الرواسب مع مختلف سرعة الترسيب وفقا لمحجم ليرة لبنانية، والكسور المخصب لأنواع مختلفة من الخلايا التي يمكن جمعها والاستفادة منها في إجراء المزيد من التحليلات. في حين أن طريقة STA-PUT لا يؤدي إلى كسور نقية للغاية من أنواع الخلايا، على سبيل المثال كما يمكن الحصول مع بعض أساليب الخلية والفرز، وأنها لا توفر عائدات أعلى بكثير من مجموع الخلايا في كل جزء
(~ 1 × 10 ⁸ خلايا / نوع من الخلايا المنوية من السكان بدءا من 7-8 × 10 ⁸ خلايا). يتطلب هذا الأسلوب عالية الغلة الأواني الزجاجية المتخصصة فقط ويمكن القيام بها في أي غرفة باردة أو ثلاجة كبيرة، مما يجعلها وسيلة مثالية للمختبرات التي لديها محدودية فرص الحصول على المعدات المتخصصة مثل مضان تنشيط فارز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) أو elutriator.

Introduction

الحيوانات المنوية لدى الثدييات هو عملية التمايز المعقدة التي تحدث في مراحل عدة في الأنابيب المنوية من الخصيتين ^1. لفترة وجيزة، وقف مثل أمهات المني الموجودة بالقرب من ظهارة نبيب الفجوة المنوية وتفرق في الخلايا المنوية، التي تخضع ثم الانقسامات الانتصافي. بعد الانقسام الاختزالي كاملة، وخلايا فرداني الناتجة عن ذلك، أو طلائع منوية الجولة، الخضوع لتكون النطاف، وهي عملية التمايز التي تنطوي على سفك السيتوبلازم والضغط من النواة. طلائع منوية تتطور تدريجيا السوط والخضوع استطالة والتكثيف من نواة، وإنتاج التمطيط ثم التكثيف طلائع منوية، على التوالي. المنتجات النهائية هي الحيوانات المنوية، والتي تم إصدارها في تجويف أنبوب صغير المنوية ومنه إلى البربخ حيث تنضج أخرى.

لأن عملية تكوين الحيوانات المنوية يعتمد على الظروف الهرمونية والجزيئية الخاصة فيالخصيتين، لم يتم حتى الآن وضع نظام موثوق الثقافة في المختبر لكامل عملية تكوين الحيوانات المنوية ^2،3. وقد تم تطوير أساليب لخلق ثقافة "الجرثومية البدائية خلايا تشبه الخلايا" و "الخلايا مثل أرومة النطفة الجولة" فرداني، من الخلايا الجذعية، ولكن هذه الأساليب ليست قادرة على توليد أعداد كبيرة من هذه الخلايا وتفشل في إنتاج الخلايا المنوية في وقت لاحق بعد أنواع ^4،5. لحسن الحظ، وأنواع الخلايا المنوية تختلف اختلافا كبيرا في الحجم، والذي يسمح لنظام التعليق وحيدة الخلية التي تم الحصول عليها من الخصيتين كله أن تكون مفصولة مع التدرج السائل. طريقة STA-PUT، تظاهر هنا، يستخدم الانحدار الخطي BSA والترسيب بسيطة لفصل الخلايا المنوية على أساس الحجم والكتلة ^6-9.

طريقة STA-PUT ديها العديد من المزايا أكثر من غيرها من الأساليب الأكثر استخداما على نطاق واسع لفصل أنواع الخلايا المنوية: نظام مراقبة الأصول الميدانية وتصويل ^10-13. جهاز STA-PUT يتطلب قلذ عدة قطع من الأواني الزجاجية المتخصصة تجميعها في غرفة باردة أو ثلاجة كبيرة. وبالتالي، فمن أقل تكلفة من استخدام فارز الخلية أو elutriator. طريقة STA-PUT ينتج كميات أكبر من الخلايا لكل نوع من الخلايا والخصية مما يمكن الفرز حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية في إطار زمني مشابه، على الرغم من نقاء كل السكان الخلية ليست عالية مثل تلك التي حصلت مع نظام مراقبة الأصول الميدانية ^11. فرز الخلايا باستخدام الخرز المغناطيسي (المغناطيسية الفرز الخلية تفعيلها، MACS) مؤخرا استخدمت بنجاح لتخصيب أمهات المني من السكان الخلية الخصية مختلطة، لكنه غير مناسب حاليا لفصل الخلايا المنوية أو طلائع منوية بسبب الافتقار إلى المعرفة السطحية المناسبة علامات ^14. ميزة إضافية للأسلوب STA-PUT على نظام مراقبة الأصول الميدانية أو MACS هو القدرة على عزل خلايا قابلة للحياة مناسبة لاحقة لأن الثقافة، وعلى النقيض من معظم بروتوكولات نظام مراقبة الأصول الميدانية، أنها لا تتطلب أي الحمض النووي أو أنواع أخرى من تلطيخ. للدراسات التي تتطلب لغلة الدو من أنواع الخلايا المنوية في ~ 90٪ النقاء، وSTA-PUT هو الأسلوب الأمثل.

Protocol

ويشمل البروتوكول STA-PUT ثلاث مراحل: 1) إعداد لأجهزة والكواشف، 2) إعداد تعليق خلية من الخصيتين كله، و 3) التحميل الخليوي، والترسيب، وجمع الكسر. عندما أجريت من قبل فريق من اثنين من الباحثين، وبروتوكول يأخذ ثماني ساعات في المتوسط.

1. إنشاء جهاز STA-PUT (الشكل 1)

*** يجب وضع جهاز STA-PUT في ثلاجة كبيرة 4 درجة مئوية أو غرفة باردة التي يمكن أيضا استيعاب جزء جامع، إذا ويفضل أن طريقة جمع.

1. في الليلة السابقة (أو على الأقل قبل بضع ساعات) إجراء الأسلوب، ويغسل جميع المعدات (وخاصة الأواني الزجاجية والأنابيب) وتعقيم مع الايثانول 70٪. دعونا المعدات جافة تماما قبل تجميع الجهاز كما هو موضح في الشكل 1.
2. تأمين اثنين 2 L اسطوانات (الأرقام 1B و C) وغرفة تحميل الخلية ( الشكل 1A) إلى منصة أعلى وربط جميع مع اثنين من قطع صغيرة من الأنابيب مع المشابك الأنبوب. المشبك أغلقت جميع الأنابيب. ختم صنبور على اسطوانة L أقصى اليمين 2.
3. وضع بقضيب صغير في غرفة تحميل الخلية (الشكل 1A) وبقضيب أكبر في معظم اليسار 2 L اسطوانة (الشكل 1B) التي سوف تحتوي على 2٪ BSA.
4. وضع غرفة الترسيب 2 L على منصة (1D الشكل). وضع يربك المعادن (الشكل 1F) مباشرة على الجزء العلوي من فتحة في الجزء السفلي من الغرفة الترسيب (الشكل 1D). هذا أمر بالغ الأهمية، كما يمنع يربك vortexing لمن السائل وتعطيل التدرج الخلية أثناء جمع الكسر. وضع غطاء على رأس غرفة الترسيب.
5. بعد تطبيق كمية صغيرة جدا من الشحوم فراغ إلى أرض مشتركة الزجاج ثلاثي محبس (الشكل 1G)، المشبك محبس لأسفل حد ذاتهغرفة dimentation، وربط المفاصل الزجاج الأرضي من محبس وغرفة الترسيب.
6. ربط الغرفة خلية التحميل (الشكل 1A) للمخرج حق محبس مع الأنابيب. إغلاق محبس.
7. إرفاق أنابيب تجزئة الخلية إلى منفذ اليسرى من محبس. يضم أنابيب تجزئة قطعة من الأنابيب مع ماصة باستير الزجاج متصلة نهاية مفتوحة. وترد قطعة من أصغر تجويف أنابيب إلى نهاية ضيقة من ماصة الزجاج. ماصة ضيق يحد من تدفق تعليق خلية خلال جمع الكسر. المشبك هذا أنبوب صغير في أسفل جدا.
8. إعداد 2 L كريبس (1X) العازلة يوم من التجربة (الجدول 1). ثم، وإعداد 550 مل 2٪ BSA في 1X كريبس، 550 مل 4٪ BSA في 1X كريبس، و 50 مل 0.5٪ BSA في 1X كريبس. تصفية وتبريد هذه الحلول إلى 4 درجات مئوية.
9. صب الحل BSA 4٪ في L اسطوانة الحق 2 (الشكل 1C) وجيش صرب البوسنة 2٪الحل في ترك L 2 اسطوانة (الشكل 1B). تأكد من عدم وجود فقاعات كبيرة في الأنبوب الذي يربط هذه الاسطوانات.
10. صب العازلة كريبس في غرفة التحميل الخلية وملء الأنابيب التي تربط هذه الغرفة مع غرفة الترسيب، والتأكد من عدم وجود فقاعات كبيرة، وهذه يمكن أن تعكر صفو التدرج. الضغط أو التحريك الأنبوب يساعد بلطف لإزالة الفقاعات. تأكد من أن جميع من المخزن المؤقت كريبس هو في الأنبوب وليس في غرفة الخلية.
11. السماح لكمية صغيرة من العازلة كريبس في التدفق إلى غرفة الترسيب وثم تصفى تقريبا كل المخزن المؤقت في أنابيب تجزئة الخلية من أجل ملء الأنبوب وإزالة أي فقاعات كبيرة.
12. وضع جامع الكسر مباشرة تحت غرفة الترسيب. التأكد من أن جميع الأنابيب جزء في مكان ومغطاة التفاف البلاستيك لمنع التلوث.

2. عزل الخلايا المنوية من الخصية الجامعة

تشريح الخصيتين من الفئران كاليفورنيا 12 الكبار (ويفضل لا يقل عن ثمانية أسابيع من العمر) ووضعت في المخزن كريبس في درجة حرارة الغرفة ليغسل أي مواد الملوثة. هذا البروتوكول يتم شرحها ينطوي على استخدام الفئران المختبرية وأعدم في الامتثال للمبادئ التوجيهية من جامعة اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام بنسلفانيا.

إضافة 45 ملغ كولاجيناز إلى 50 مل العازلة كريبس في أنبوب مخروطي الحق قبل كنت تنوي إضافة الأنابيب المنوية. يسمح هذا الحل لحرارة تصل إلى 33 درجة مئوية لمدة بضع دقائق. تقسيم بالتساوي إلى أنبوبين 50 مل المخروطية.

Decapsulate الخصيتين في لوحة منفصلة تحتوي على 8 مل كريبس العازلة، التخلص من الغلالة البيضاء الغلالة والإفراج عن الأنابيب المنوية. والغلالة البيضاء الغلالة هو الغشاء الرقيق الذي يحيط الأنابيب المنوية. يجب الأنابيب فصل بسهولة من الغلالة البيضاء الغلالة. للقيام بذلك، وجعل شق في الغلالة البيضاء الغلالة، وعقد هذا الغشاء مع بايص من الملقط، ودفع الأنابيب من وبعيدا عن الغشاء مع زوج آخر من الملقط.

إضافة 4 مل كريبس العازلة التي تحتوي على الأنابيب إلى كل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على 25 مل من محلول كولاجيناز واحتضان، والهز، في 33 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. في النهاية، يجب أن يكون على الأنابيب "السباغيتي مثل" المظهر.

تسمح الأنابيب لتسوية ل~ 5 دقائق إلى أسفل الأنبوب. من اجل الخروج من طاف وغسل 2X في 25 مل العازلة كريبس (في درجة حرارة الغرفة)، والسماح للالأنابيب لتستقر في قاع الأنبوب في كل مرة. ترك ~ 5 مل العازلة كريبس في كل أنبوب.

في حين الغسيل، إضافة 30 ملغ التربسين إلى 50 مل العازلة كريبس في أنبوب الصقر الحق قبل كنت تنوي إضافة الأنابيب المنوية. يسمح هذا الحل لحرارة تصل إلى 33 درجة مئوية لمدة بضع دقائق. تقسيم بالتساوي إلى أنبوبين 50 مل المخروطية.

إضافة 25 مل من محلول التربسين إلى كل من أنابيب تحتوي على اثنين من الأنابيب. إضافة 3 ميكروغرام الدناز (1 μg/10ml) إلى كل أنبوب لمنع الخليةق من التثاقل. احتضان، والهز، في 33 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.

استخدام تتحمل ماصة واسعة للتحريض على محلول يحتوي على الأنابيب، pipetting للهم ويخرجون تقريبا 10X. الحل يجب أن تبدأ لتبدو أكثر مثل تعليق خلية واحدة.

احتضان، والهز، في 33 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وإضافية. استخدام ماصة واسعة تتحمل لتفريق الأنابيب في تعليق خلية واحدة، pipetting للهم ويخرجون تقريبا 25X. إذا كنت لا تزال ترى الكثير من الأنابيب أو كتل الخلايا، وتفريق أكثر مع ماصة و / أو إضافة أخرى الدناز 3 ميكروغرام لكل أنبوب (تركيز أولي مزدوج).

تحديد تعليق خلية واحدة من خلال مصفاة الخلية شبكة 100 ميكرون (واحد لكل أنبوب من 30 خلية مل تعليق). الجمع بين الايقاف الخلية وحساب العدد الكلي للخلايا (يجب أن يكون بين 7-8 × 10 ⁸ خلايا). *** لا تقم بتحميل أكثر من 800،000،000 الخلايا على التدرج.

استنادا إلى عدد الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.10، بيليه approprحجم IATE من الخلايا التي تمت تصفيتها في إطار التعاون الإقليمي 450 لمدة 5 دقائق ويغسل مع 30 مل كريبس العازلة. تكرار. وعادة ما *** 22 الخصيتين الغلة أكثر من 800،000،000 الخلايا، ولكن لا يتم تحميل أكثر من هذا العدد من الخلايا.

في resuspend بعناية الخلايا في 25 مل 0.5٪ BSA التي تحتوي على ما بين 2.5 و 5 ميكروغرام الدناز (اعتمادا على درجة التثاقل الخلية) دون خلق الفقاعات. تأكد من أن الخلايا لا تتجمع. تحديد تعليق خلية واحدة من خلال مصفاة الخلية شبكة 100 ميكرون. الخلايا هي الآن جاهزة للتحميل. تخلط جيدا قبل التحميل بواسطة قلب الأنبوب عدة مرات.

3. تحميل الخلية والترسيب

1. تأكد من أن يتم إغلاق محبس، ولكن في الموقف من شأنها أن تسمح لتدفق السائل من الغرفة الخلية (الشكل 1A) في غرفة الترسيب (الشكل 1D).
2. بدوره على حد سواء لوحات بقضيب إلى إعداد منخفض (حوالي 70 دورة في الدقيقة) للسماح القضبان ضجة للتحرك بشكل مستمر، ولكن ببطء.
3. صب تعليق خلية في غرفة الخلية (الشكل 1A) وفتح محبس بحيث تتدفق الخلايا ببطء الى غرفة الترسيب بمعدل 10 مل / دقيقة (الشكل 1D). إغلاق محبس. يمكن تحديد معدل التدفق عن طريق وضع علامة على فترات حجم الغرفة الترسيب.
4. صب 5 مل من محلول 0.5٪ BSA في غرفة الخلية وتصب في غرفة الترسيب بمعدل 10 مل / دقيقة. إغلاق محبس. وهذه الخطوة غسل الخلايا من الغرفة الخلية. تكرار 4X.
5. إعداد التدرج: فتح المشابك بين غرفة الخلية (الشكل 1A) واثنين من اسطوانات 2 L (الشكل 1B و C)، وتبدأ في استنزاف السائل الى غرفة الترسيب بمعدل 40 مل / دقيقة (الشكل 1D) على الفور. ضبط معدل تدفق لذلك يستغرق حوالي 20-30 دقيقة لتحميل التدرج BSA في غرفة الترسيب. رقيقة، وطبقة من الخلايا دون عائق الكذب على رأسوينبغي أن يكون BSA التدرج مرئية. مرة واحدة يتم تحميل معظم BSA، إغلاق محبس وتحويله إلى موقف من شأنها أن تسمح لاستنزاف السائل من غرفة الترسيب في أنبوب تجزئة.
6. إيقاف لوحات ضجة.
7. تسمح للخلايا أن الرواسب لمدة ساعة و 45 دقيقة. لا تخل الجهاز خلال هذه الفترة. أي الانفعالات الميكانيكية يمكن أن تعكر صفو التدرج.

4. تجزئة وتحليل الكسور

*** كما يمكنك تنفيذ الخطوات التالية، يجب الحرص على عدم تعكير صفو التدرج. إذا اختل التدرج BSA، فإن الإجراء لا يعمل!

1. مرة واحدة وقد الرسوبية الخلايا، واستنزاف ببطء 50 مل من غرفة الترسيب في أنبوب مخروطي 50 مل وتوضع جانبا. هذا الكسر عادة ما تحتوي على كتل من الخلايا غير المرغوب فيها والحطام.
2. نعلق الأنبوب جزء إلى جزء جامع. *** ومن الممكن أيضا لجمع الكسور باليد إذا كان جزء كوليالمنشئ غير متوفر.
3. جمع الكسور: ضبط معدل التدفق مع محبس بحيث 10 مل (ملء أنبوب مجموعة واحدة) يتم جمعها كل 45 ثانية.
4. سقف أنابيب جمع جزء وتدور لمدة 5 دقائق في 450 إطار التعاون الإقليمي في 4 درجات مئوية. تخلصي من طاف بلطف، والخلايا resuspend في السائل المتبقي، والحفاظ على الخلايا على الجليد.
5. مرة واحدة يتم جمع جميع الكسور وتحليل مجهريا الكسور لصالح السكان مختلفة من الخلايا. ويمكن التمييز بين أنواع مختلفة من الخلايا استنادا إلى حجم الخلية ومورفولوجيا النووية ^8،15 الشكل 2 يوضح "نتائج ممثلة" عن كسور المجمعة الثلاثة التي يتم إثراء للخلايا (أ) الجسمية والانتصافي وأمهات المني، (ب) طلائع منوية الجولة، و (ج) التمطيط والتكثيف طلائع منوية.
   • اكتب A أمهات المني هي 12-14μm كاليفورنيا. في قطر ولها نواة جولة التي هي متجانسة في تكوينها لونين.
   • نوع B أمهات المني هي 8 9μm كاليفورنيا. في قطر، وقد rounد نوى التي تظهر المغاير أكثر كثافة على طول محيط النووية.
   • الخلايا المنوية قبل مرحلة ترقق الصبغيات هي 7.5 8.2μm كاليفورنيا. في القطر، ويكون السيتوبلازم أقل من النوع (ب) أمهات المني، ولها نوى التي تبدو مماثلة لتلك التي في النوع (ب) أمهات المني.
   • الخلايا المنوية الأولية هي مرحلة ترقق الصبغيات 8-10 ميكرون كاليفورنيا. في قطر ولها نوى التي تبدو مشابهة لتلك الخلايا المنوية قبل مرحلة ترقق الصبغيات، ولكن يبدو للحصول على لونين أكثر كثافة في الغشاء النووي.
   • دور الاقتبال الخلايا المنوية الأولية هي 10-12 ميكرومتر كاليفورنيا. في قطر ولها نوى التي تبدو مشابهة لتلك الخلايا المنوية الأولية مرحلة ترقق الصبغيات.
   • الخلايا المنوية طور التثخن في أي مكان 12-18 ميكرومتر كاليفورنيا. في قطر، وتتألف من حافة رقيقة من السيتوبلازم المحيطة نواة كبيرة. ويمكن رؤية أكثر من لونين كتل كثيفة في النواة.
   • طلائع منوية الجولة هي 10 ميكرومتر كاليفورنيا. في قطر ولها نواة مستديرة مع جسيم نووي المكتظة تلطيخ في الوسط.
   • المتبقيالهيئات هي ~ 6.5 ميكرون في القطر، هي الجولة، وتفتقر إلى النواة.
   • التمطيط والتكثيف طلائع منوية هي مماثلة في الحجم لجولة طلائع منوية، ولكن لديها فريدة من نوعها، على شكل المنجل النواة.
   1. تبدأ مع جزء 15 وتحليل كل خمس كسور يصل إلى 85. عادة، سوف الكسور أقل من 15 تكون مختلطة جدا وملتف، وسوف كسور فوق 85 تحتوي على عدد قليل من أي خلايا قابلة للاستخدام.
   2. لتحليل جزء صغير، واتخاذ 5UL من السائل من أنبوب جمع جزء (مرة واحدة وقد تم معلق الخلايا بعد الطرد المركزي) وإضافة إلى 5UL من 8٪ الفورمالديهايد في المخزن كريبس. تسمح للخلايا ثابتة للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
   3. إضافة 5UL من 0.1٪ تريتون ودابي (5 μ / مل العازلة كريبس) إلى الخلايا الثابتة. تسمح للخلايا للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   4. وضع 10 ميكرولتر من الحل الناتج على شريحة، وتغطي مع انزلاق الغطاء، وتحليل مع المجهر مضان لتحديد نقاء كل جزء.
   5. الجمع بين الكسور التي تتشابه في الحجم والتشكل النووي (انظر "نتائج الممثل") لإنشاء السكان التالية من الخلايا: الخلايا مضاعفا الانتصافي والجسدية، طلائع منوية الجولة، والتكثيف / التمطيط طلائع منوية.

النتائج

نتيجة مثالية من الإجراء STA-PUT هو فصل ملحوظ نسبيا من الخلايا من الخصيتين يعتمد على حجم الخلية وكثافة. في حين أن الخلايا المعزولة من الخصيتين والمترسبة من خلال التدرج BSA، يمكن ملاحظة عدة نطاقات مميزة من الخلايا. أي كتل من الخلايا تميل إلى تنزل الى قاع الانحدار ولن تلوث ال...

Discussion

أولئك الذين يدرسون الحيوانات المنوية الاعتماد على النماذج الحيوانية لعينات الخلايا المنوية، كنظام ثقافة الخلية موثوق بها لا وجود لها حتى الآن طريقة لتوليد كل أنواع الخلايا المنوية ^3. على الرغم من أن الخلايا المنوية يتم جمعها بسهولة من الخصيتين كله، النتائج فق...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternate can be used.
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions	Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
KREBS (10x)	3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20		Autoclave/filter and store at 4 °C for several months.
KREBS (1x)	Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
Collagenase	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsin	Sigma	T9201-1G
DAPI	Preference of researcher
Triton-X100	Preference of researcher
Formaldehyde (~37%)	Preference of researcher
TABLE 2: EQUIPMENT
Equipment	Company	Catalog #	Comments
Complete STA-PUT apparatus	ProScience Glass Shop	STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)	Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.
10 μm mesh filter	Fisherbrand	22363549
Mouse dissection tools	Preference of researcher
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps	Preference of researcher
	Need approximately 100 tubes
Fraction collector	GE Healthcare Life Sciences	Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40	Alternate can be used.
Microscope slides, cover glass	Preference of researcher
Light/Fluorescent Microscope	Preference of researcher