Разделение сперматогенного Типы клеток с использованием STA-PUT скорости осаждения

Резюме

Способ STA-PUT позволяет для разделения различных популяций клеток сперматогенных в зависимости от размера и плотности.

Аннотация

Млекопитающих сперматогенез представляет собой сложный процесс дифференциации, что происходит в несколько этапов в семенных канальцах яичек. В настоящее время нет надежной системы культуры клеток позволяет сперматогенного дифференциации в пробирке, и большинство биологические исследования сперматогенных клеток требуют урожай тканей от животных моделях, таких как мыши и крысы. Потому что яичко содержит многочисленные типы клеток - как не-сперматогенеза (Лейдига, Сертоли, миелоидных и эпителиальные клетки) и сперматогенеза (сперматогенов сперматоциты, круглые сперматиды, конденсации сперматиды и сперматозоиды) - изучение биологических механизмов, участвующих в сперматогенеза требуют изоляции и обогащение этих различных типов клеток. Метод СТА-PUT позволяет для разделения гетерогенной популяции клеток - в данном случае, от яичек - через линейным градиентом BSA. Отдельные типы клеток осадок с разной скоростью осаждения в соответствии с серазмер LL, и фракции, обогащенные для различных типов клеток могут быть собраны и использованы в дальнейших анализов. Хотя способ STA-PUT не приводит к чрезвычайно чистых фракций из типов клеток, например, как могут быть получены с определенными методами сортировки клеток, он обеспечивает значительно более высокий выход общего числа клеток в каждой фракции
(~ 1 х 10 ⁸ клеток / сперматогенеза тип клеток из исходного населения 7-8 х 10 ⁸ клеток). Этот метод высокая доходность требует только специализированные изделия из стекла и может быть выполнена в любом холодном помещении или большой холодильник, что делает его идеальным методом для лабораторий, которые имеют ограниченный доступ к специализированным оборудованием вроде активацией флуоресценции сортировщика клеток (FACS) или элюент.

Введение

Млекопитающих сперматогенез представляет собой сложный процесс дифференциации, что происходит в несколько этапов в семенных канальцах яичек ^1. Вкратце, стволовых как сперматогоний, что проживание вблизи эпителия семенных канальцев разделяй и дифференцироваться в сперматоцитах, которые затем подвергаются мейоза дивизий. После мейоза завершена, в результате гаплоидные клетки, или круглые сперматиды, пройти спермиогенеза, процесс дифференциации, которая включает пролитие цитоплазме и уплотнения ядра. Сперматид постепенно развивать жгутик и пройти удлинение и конденсацию ядра, производя удлинения, а затем конденсационных сперматиды соответственно. Конечные продукты являются сперматозоиды, которые выделяются в просвет семенных канальцев и в конечном счете в придатке яичка, где они созревают дальше.

Поскольку процесс сперматогенеза полагается на специальных гормональных и молекулярных условий вяички, надежная система культуры в пробирке в течение всего процесса сперматогенеза до сих пор не разработана ^2,3. Культура методы были разработаны для создания "ячейки-подобные клетки примордиальных зародышевых" и гаплоидных, "круглые сперматид-подобные клетки" из стволовых клеток, но эти методы еще не в состоянии генерировать большое количество этих клеток и не дают позже сперматогенеза ячейку типы ^4,5. К счастью, сперматогенного типы клеток существенно отличаются по размеру, что позволяет суспензии одноклеточных, полученной из цельного яичек быть разделены с жидким градиента. Метод СТА-PUT, продемонстрировали здесь, использует линейный градиент BSA и простой осаждение отделить сперматогенного клетки в зависимости от размера и массы ^6-9.

Метод СТА-PUT имеет ряд преимуществ перед другими двумя наиболее широко используемых методов для отделения сперматогенного типов клеток: FACS и отмучивание ^10-13. СТА-PUT аппарат требует ОНЛу несколько частей специализированной посуды собраны в холодном помещении или большой холодильник. Таким образом, это дешевле, чем с использованием клеточного сортера или элюент. Способ STA-PUT дает более высокое количество клеток каждого типа клеток и семенниках, чем могут быть отсортированы по FACS в сопоставимой времени, хотя чистота каждой клеточной популяции не так высока, как полученные с FACS ^11. Сотовый сортировки с использованием магнитных шариков (магнитный Активированный сортировки клеток, MACS) недавно был успешно применен для обогащения сперматогониев из смешанного яичек клеточной популяции, в настоящий момент неподходящим для разделения сперматоциты или сперматиды из-за незнания соответствующей поверхностных маркеров ^14. Дополнительным преимуществом способа STA-PUT над FACS или MACS является возможность изолировать жизнеспособных клеток, подходящих для последующей культуры, потому что, в отличие от большинства протоколов FACS, он не требует никакого ДНК или другие типы окрашивания. Для исследований, требующих лArge выходы сперматогенных типов клеток при ~ 90%-ной чистоты, СТА-PUT является идеальным методом.

протокол

Протокол СТА-PUT состоит из трех этапов: 1) создание аппарата и реагентов, 2) Получение клеточной суспензии из цельных яичек, и 3) загрузка сотовый, осаждение и сбор фракции. Когда выполняется командой двух исследователей, протокол занимает восемь часов в среднем.

1. Настройка СТА-PUT Аппарат (рис. 1)

*** STA-PUT аппарат должен быть помещен в 4 ° C большим холодильником или холодной комнате, что также может вместить коллектор фракций, если это метод сбора является предпочтительным.

1. В ночь перед (или по крайней мере за несколько часов до) выполнения метода, мыть все оборудование (особенно изделия из стекла и труб) и стерилизовать 70% этанолом. Пусть оборудования полностью высохнуть перед сборкой аппарата, как показано на рисунке 1.
2. С помощью двух цилиндров 2 л (фиг.1В и С) и нагрузка сотовой ячейки в камере ( рис. 1А) на верхнюю площадку и подключить все с двух маленьких кусочков труб с трубными зажимами. Зажмите все трубы закрыт. Уплотнение носик на самый правый 2 л цилиндра.
3. Нанесите небольшое мешалкой в клетки загрузочной камеры (рис. 1А) и больший мешалкой в самый левый 2 л цилиндра (рис. 1В), который будет содержать 2% BSA.
4. Поместите 2 л оседания камеру на платформе (рис. 1D). Поместите металлическую перегородку (рис. 1F) непосредственно на верхней части отверстие в нижней части камеры осаждения (рис. 1D). Это очень важно, так как перегородка предотвращает вихревание жидкости и нарушению клеточной градиента во время сбора фракции. Поместите крышку на верхней части отстойника камеры.
5. После применения очень небольшое количество вакуумной смазки на притертой сустава трехходовым краном (рис. 1G), зажать кран на дно себеdimentation камера, соединяющая матового стекла суставы краном и оседания камеры.
6. Подключите мобильный загрузкой камеру (рис. 1А) к правому выходе из крана с трубопровода. Закройте кран.
7. Прикрепите трубку сотового фракционирования к левому гнезду краном. Трубка фракционирование включает в себя кусок трубы со стеклянной пипетки Пастера, подключенного к открытому концу. Кусок трубы меньшего отверстия прикреплен к узкому концу стеклянной пипетки. Узкий пипетка ограничивает поток суспензии клеток во фракции сбора. Зажмите эту маленькую трубку в самом низу.
8. Подготовьте 2 L Krebs (1x) буфер день эксперимента (табл. 1). Затем готовят 550 мл 2% BSA в 1X Кребса, 550 мл 4% BSA в 1X Кребса и 50 мл 0,5% BSA в 1X Кребса. Фильтрует и охлаждает эти решения до 4 ° С
9. Налейте 4% раствор BSA в правом 2 л цилиндра (рис. 1в) и 2% BSAраствор в левом L 2 цилиндра (фиг. 1В). Убедитесь, что нет никаких больших пузырьков в трубке, которая соединяет эти цилиндры.
10. Налейте Кребса буфера в ячейки загрузочной камеры и заполнить трубопровод, соединяющий эту камеру с оседания камеры, убедившись, что нет никаких большие пузыри, так как они могут нарушить градиент. Сжатие или щелкая трубки мягко помогает удалить пузыри. Убедитесь, что все буфере Кребса в трубе, а не в клеточной камере.
11. Разрешить небольшое количество буфера Кребса поступать в оседания камере, а затем слить почти все буфера в трубку сотового фракционирования в того, чтобы заполнить трубу и удалить любые большие пузыри.
12. Поместите коллектор фракций непосредственно под оседания камеры. Убедитесь в том, что все фракции трубы находятся на месте и покрыты полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить загрязнение.

2. Изоляция сперматогенного клеток из цельной семенников

Проанализируйте яички от ок 12 взрослых мышей (предпочтительно по меньшей мере восемь недель) и место в буфера Кребса при комнатной температуре, чтобы смыть любую загрязняющий материал. Этот протокол, демонстрируется предполагает использование лабораторных мышей и был казнен в соответствии с руководящими принципами университета комитета Институциональная уходу и использованию животных Пенсильвании.

Добавить 45 мг коллагеназы до 50 мл буфера Кребса в конической трубе прямо перед вы намерены добавить семенных канальцев. Разрешить этот раствор нагреть до 33 ° С в течение нескольких минут. Сплит равномерно на две 50 мл конические пробирки.

Decapsulate яички в отдельной тарелке, содержащей 8 мл буфера Кребса, отбрасывая белочной оболочки и выпуская семенных канальцев. Белочная оболочка является тонкая мембрана, которая окружает семенных канальцев. Трубки должны легко отделяться от белочной оболочки. Чтобы сделать это, сделать надрез в белочной оболочки, удерживайте эту мембрану с пайр от щипцов, и нажмите канальцы из и от мембраны с другой парой щипцов.

Добавить 4 мл буфера Кребса, содержащий канальцы в каждой коническую пробирку, содержащую 25 мл раствора коллагеназы и инкубируют, встряхивании при 33 ° С в течение 10 мин. В конце концов, трубочки должен иметь "спагетти-как" внешний вид.

Позвольте трубочки согласиться на ~ 5 мин на дне пробирки. Излей супернатант и мыть 2 раза в 25 мл буфера Кребса (при комнатной температуре), что позволяет канальцы оседают на дне пробирки каждый раз. Оставьте ~ 5 мл буфера Кребса в каждую пробирку.

В то время как мойка, добавить 30 мг трипсина до 50 мл буфера Кребса в трубки сокола прямо перед вы намерены добавить семенных канальцев. Разрешить этот раствор нагреть до 33 ° С в течение нескольких минут. Сплит равномерно на две 50 мл конические пробирки.

Добавить 25 мл раствора трипсина на каждой из двух пробирок, содержащих канальцы. Добавить 3 мкг ДНКазу (1 μg/10ml) в каждую пробирку, чтобы предотвратить ячейкус от слипания. Выдержите, дрожь, при 33 ° С в течение 10 мин.

С помощью пипетки широким отверстием для перемешивания раствора, содержащего канальцы, пипетки их в и примерно в 10 раз. Решение должно начать выглядеть как суспензии отдельных клеток.

Выдержите, встряхивании при 33 ° С в течение еще 10 мин. Используйте широким отверстием пипетки для разгона канальцы в суспензии отдельных клеток, пипетки их в и около 25x. Если вы все еще видите много канальцев или клеточных сгустков, разогнать больше с пипетки и / или добавить еще один 3 мкг ДНКазу в каждую пробирку (двойной начальная концентрация).

Фильтр одноклеточной суспензии через сито 100 мкм клеток фильтр (один для каждой трубки 30 мл клеточной суспензии). Объедините клеточные суспензии и подсчитать общее число клеток (должно быть между 7-8 х 10 ⁸ клеток). *** НЕ загружайте более 800 миллионов клеток на градиента.

На основании количества клеток, полученной на стадии 2,10, гранулы с approprIate объем отфильтрованных клеток при 450 RCF в течение 5 мин и промывают 30 мл буфера Кребса. Повторите. *** Обычно 22 яички даст больше 800 миллионов клеток, но не загружайте более этого числа клеток.

Тщательно ресуспендирования клеток в 25 мл 0,5% BSA, содержащем от 2,5 до 5 мкг ДНКазы (в зависимости от степени клеточной слипания) без создания пузырьков. Убедитесь, что клетки не глыба. Фильтр одноклеточной суспензии через сито 100 мкм клеток фильтра. Клетки Теперь все готово для загрузки. Хорошо перемешать Перед загрузкой переворачивая пробирку несколько раз.

3. Сотовый Погрузка и Седиментация

1. Убедитесь, что запорный кран закрыт, но в положении, которое позволит жидкость течь из клеточной камере (рис. 1А) в камере осаждения (рис. 1D).
2. Поверните оба мешалкой пластины на низком уровне (около 70 оборотов в минуту), чтобы позволить размешивать бары двигаться непрерывно, но медленно.
3. Налейте клеточной суспензии в клеточной камере (рис. 1А) и открыть кран, так что клетки протекать медленно в камере осаждения со скоростью 10 мл / мин (рис. 1D). Закройте кран. Расход может быть определена путем маркировки интервалы громкости на оседания камеры.
4. Налейте 5 мл 0,5% раствора БСА в клеточной камере и стекать в камере осаждения со скоростью 10 мл / мин. Закройте кран. Этот шаг будет промыть клетки из клеток камеры. Повторите 4 раза.
5. Подготовка градиент: Открыть зажимы между клеткой камеры (рис. 1А) и двух цилиндров 2 L (фиг. 1B и С), и начать вытекать жидкость в камере осаждения со скоростью 40 мл / мин (рис. 1D) немедленно. Отрегулируйте расход таким образом, занимает приблизительно 20-30 минут, чтобы загрузить градиент BSA в оседания камеры. Тонкий, спокойно слой клеток, лежащих на верхней частиBSA градиент должен быть виден. После того, как большая часть BSA загружается, закройте кран и включите его в положение, которое позволит жидкости вытечь из отстойника камеры в фракционирования трубки.
6. Выключите ажиотаж пластины.
7. Разрешить клетки осадок в течение одного часа и 45 минут. НЕ БЕСПОКОИТЬ аппарат в это время. Любое механическое перемешивание может нарушить градиент.

4. Фракционирование и анализ фракций

*** Как вы выполните следующие действия, будьте осторожны, чтобы не нарушить градиент. Если градиент БСА нарушается, процедура не будет работать!

1. Как только клетки осаждали медленно сливать 50 мл от оседания камеры в 50 мл коническую трубку и отложите в сторону. Эта фракция, как правило, содержит нежелательные скопления клеток и мусора.
2. Прикрепите фракции трубку к коллектор фракций. *** Можно также собрать фракции вручную, если доля Коллет е р не доступен.
3. Сбор фракций: Отрегулируйте расход с краном так, чтобы 10 мл (заполнение одной коллекции трубку) собирают в 45 сек.
4. Трубки закрывают крышками Сбор фракций и спин в течение 5 мин при 450 RCF при 4 ° С. Слейте супернатант осторожно, ресуспендирования клеток в оставшейся жидкости, и сохранить клетки на льду.
5. После того как все фракции собирают, микроскопически анализ фракций на различных клеточных популяций. Различные типы клеток можно отличить на основе размера клеток и ядерной морфологии ^8,15. Рисунок 2 иллюстрирует репрезентативные результаты "" для трех объединенных фракций, обогащенных для (а) и соматических клеток и мейоза сперматогониев, (б) круглых сперматидах и (в) удлинения и конденсации сперматиды.
   • Тип A сперматогоний являются 12-14 мкм ок. в диаметре и имеют круглые ядра, которые являются однородными в хроматина композиции.
   • Тип B сперматогониев являются 8-9μm ок. в диаметре и Rounг ядер, которые показывают более плотную гетерохроматина вдоль периферии ядра.
   • Предварительно leptotene сперматоциты являются 7,5-8.2μm ок. в диаметре, имеют меньше цитоплазму, чем типа B сперматогониев, и имеют ядра, которые выглядят аналогичны типа B сперматогониев.
   • Leptotene сперматоциты 8-10 мкм ок. в диаметре и имеют ядра, которые выглядят аналогичны предварительно leptotene сперматоцитах, но, кажется, чтобы получить больше плотный хроматин на ядерной мембране.
   • Зиготены сперматоциты 10-12 мкм ок. в диаметре и имеют ядра, которые выглядят аналогичны leptotene первичных сперматоцитах.
   • Пахитенных сперматоциты где-нибудь от 12-18 мкм ок. в диаметре и состоит из тонкого ободка цитоплазмы, окружающей большое ядро. Еще сгустки плотной хроматина можно увидеть в ядре.
   • Круглые сперматиды являются 10 мкм ок. в диаметре и имеют круглую ядро ​​с плотно-окрашивания хромоцентр в середине.
   • Остаточныйтела ~ 6,5 мкм в диаметре, круглые, и не имеют ядро.
   • Удлинения и конденсации сперматиды близки по размерам к круглой сперматиды, но имеют уникальную, серповидные ядро.
   1. Начните с фракцией 15 и анализировать каждые пять фракций до 85. Как правило, фракции ниже 15 будет слишком смешивают и массивный, и фракции, выше 85 будет содержать некоторые, чтобы не пригодных к использованию клеток.
   2. Для анализа фракцию, принимать 5UL жидкости из коллекции фракция трубки (один раз клетки были повторно суспендируют после центрифугирования) и добавить к 5UL 8% формальдегида в буфера Кребса. Разрешить фиксированные клетки сидеть при комнатной температуре в течение пяти минут.
   3. Добавить 5UL 0,1% Тритон и DAPI (5 μ / мл буфера Кребса) с фиксированными клетками. Разрешить клетки сидеть при комнатной температуре в течение 5 мин.
   4. Поместите 10 мкл полученного раствора на слайд, накрыть покровным и анализировать с флуоресцентным микроскопом, чтобы определить чистоту каждой фракции.
   5. Объедините фракции, которые похожи по размеру и морфологии ядра (см. "Представитель результаты"), чтобы создать следующие популяции клеток: мейотические и соматические диплоидных клеток, круглые сперматиды и конденсационных / удлинения сперматиды.

Результаты

Идеальным результатом от процедуры СТА-PUT довольно заметно разделение клеток из яичек в зависимости от размера ячейки и плотности. В то время как клетки, выделенные из семенников которые седиментации через градиента BSA, несколько различных групп клеток можно наблюдать. Любые скопления...

Обсуждение

Те, кто изучает сперматогенез полагаться на животных моделях для образцов сперматогенных клеток, как надежная система культуры клеток еще не существует для генерации всех типов сперматогенного клеток ^3. Хотя сперматогенного клетки легко собраны из цельных яичек, приводит тольк?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternate can be used.
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions	Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
KREBS (10x)	3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20		Autoclave/filter and store at 4 °C for several months.
KREBS (1x)	Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
Collagenase	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsin	Sigma	T9201-1G
DAPI	Preference of researcher
Triton-X100	Preference of researcher
Formaldehyde (~37%)	Preference of researcher
TABLE 2: EQUIPMENT
Equipment	Company	Catalog #	Comments
Complete STA-PUT apparatus	ProScience Glass Shop	STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)	Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.
10 μm mesh filter	Fisherbrand	22363549
Mouse dissection tools	Preference of researcher
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps	Preference of researcher
	Need approximately 100 tubes
Fraction collector	GE Healthcare Life Sciences	Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40	Alternate can be used.
Microscope slides, cover glass	Preference of researcher
Light/Fluorescent Microscope	Preference of researcher