STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

요약

STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 정자 형성 세포의 다른 인구의 분리 할 수​​ 있습니다.

초록

포유류의 정자는 고환의 정 세관에서 여러 단계에서 발생하는 복잡한 분화 과정이다. 현재, 체외에서 정자 형성 차별화 있도록 신뢰성있는 세포 배양 시스템은없고, 정자 형성 세포의 대부분의 생물학적 연구는 마우스와 쥐와 같은 동물 모델에서 조직 수확을 필요로합니다. 비 정자 형성 (간질, 세르 톨리, 골수, 상피 세포) 및 정자 형성 모두 (정조 세포, 정모 세포, 둥근 정자, 정자 및 정자를 응축) - - 고환은 많은 종류의 세포가 포함되어 있기 때문에 정자에 관련된 생물학적 메커니즘 연구를 분리해야 이들 상이한 세포 유형의 농축. 이 경우, 고환에서 - - 선형 BSA 그라데이션을 통해 STA-PUT 방법은 세포의 이종 집단의 분리를 허용한다. 개별 세포 유형은 CE에 따라 다른 침강 속도로 침강LL 사이즈, 및 다른 세포 유형의 농축 분획을 수거하고 추가 분석에 이용 될 수있다. STA-PUT 방법은 특정 셀 정렬 방법으로 수득 될 수있는 예를 들어 세포 유형의 고도로 순수한 분획물을 초래하지 않지만, 각 분획의 전체 세포의 더 높은 수율을 제공 않는다
(7 ~ 8 × 10 ⁸ 세포의 시작 인구에서 ~ 1 ^× 108 세포 / 정자 형성 세포 유형). 이 고수익 방법은 전문 유리를 필요로하고 형광 활성화 된 셀 분류기 (FACS) 또는 elutriator 같은 전문 장비에 대한 액세스가 제한 실험실을위한 이상적인 방법하고, 어떤 차가운 방이나 대형 냉장고에 수행 할 수 있습니다.

서문

포유류의 정자는 고환 ^1의 정 세관에서 여러 단계에서 발생하는 복잡한 분화 과정이다. 간단히, 정액을 운반하는 가느 다란 분할의 상피 세포 근처에있는 정조 세포를 같은 줄기 후 감수 분열을 거쳐 정모 세포로 분화. 감수 분열이 완료되면, 그 결과 반수체 세포, 또는 원형 정자는 spermiogenesis, 세포질과 핵의 압축 흘림을 포함하는 분화 과정을 겪는다. 정자는 점차적으로 각각 편모를 개발하고 핵의 신장 및 응축을 받다, 길게 한 후 응축 정자를 생산. 최종 제품은 정소 세관 및 궁극적으로 더 성숙 부고환으로의 루멘 내로 방출되는 정자이다.

정자의 과정에서 특별한 호르몬 분자 조건에 의존하기 때문에고환은 정자의 전체 프로세스에 대한 신뢰할 수있는 체외 배양 시스템은 아직 ^2,3를 개발되지 않았습니다. 배양 방법은 줄기 세포에서 "원시 생식 세포 유사 세포"및 반수체, "라운드 spermatid 같은 세포"를 만들기 위해 개발되었지만, 이들 방법은 아직 이러한 세포를 다수 생성하여 저장 정자 형성 세포를 생산하는 데 실패 할 수 없다 유형 ^4.5. 다행히도, 정자 형성 세포 유형은 액체 구배로 분리 될 전체 정소로부터 얻어진 단일 세포 현탁액을 허용하는 크기가 상당히 다르다. STA-PUT 방법은 여기에 설명, 크기와 질량 ^6-9에 따라 정자 형성 세포를 분리하기 위해 선형 BSA의 그라데이션과 간단한 침을 사용합니다.

FACS 및 elutriation ^10-13 : STA-PUT 방법은 정자 형성 세포 유형을 구분하는 다른 두 가지 가장 널리 사용되는 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. STA-PUT 장치는 ONL 필요전문 유리의 Y 여러 조각 추운 방이나 대형 냉장고에 조립. 따라서, 셀 소터 나 elutriator를 사용하는 것보다 덜 비싸다. 각 세포 집단의 순도는 FACS ^11로 얻은만큼 높지는 않지만 STA-PUT 방법은, 세포 분류와 비교할 시간 프레임에서 FACS에 의해 분류 될 수있는 것보다 정소 당 세포의 높은 금액을 산출한다. 셀 (자기 활성화 된 셀 정렬, MACS)이 최근 성공적으로 혼합 고환 세포 인구에서 정조 세포의 농축을 위해 사용되어왔다, 그러나 ^{14 마커} 적절한 표면의 지식의 부족으로 인해 정모 세포 또는 정자를 분리하는 현재 적합하지 않은 자석 구슬을 이용하여 정렬. FACS 나 MACS 이상의 STA-PUT 방법의 또 다른 장점은 대부분 FACS 프로토콜과 대조적으로, 어떤 DNA 또는 염색 다른 타입을 필요로하지 않기 때문에 이후의 배양에 적합 가능한 세포를 분리 할 수​​있는 능력이다. L을 필요로 연구를위한정자 형성 세포 유형의 아게 수율은 ~ 90 %의 순도, STA-PUT 이상적인 방법입니다.

프로토콜

STA-PUT 프로토콜은 세 단계를 포함한다 : 1) 장치 및 시약의 설정, 전체 고환에서의 세포 현탁액 2) 준비, 3) 셀 로딩, 침강 및 분수 수집. 두 연구원의 팀에 의해 수행하는 경우, 프로토콜은 평균 8 시간이 소요된다.

1. STA-PUT의 장치를 설정한다 (그림 1)

수집의 방법을 선호하는 경우 *** STA-PUT 장치는 4 ° C 대형 냉장고 나 또한 일부 컬렉터를 수용 할 수있는 차가운 방에 배치해야합니다.

1. 전에 (또는 적어도 몇 시간 전에) 당신이 방법을 수행 밤, 모든 장비 (특히 유리와 튜브)를 세척하고 70 % 에탄올로 소독. 완전도 1에 도시 된 바와 같이 장치를 조립하기 전에 장비를 건조 시키.
2. 두 개의 2 L 실린더 (그림 1B 및 C) 및 셀 로딩 챔버 (보안 그림 1A) 상단 플랫폼 및 튜브 클램프 튜브의 두 개의 작은 조각으로 모두를 연결합니다. 클램프 모든 튜브 폐쇄. 가장 오른쪽이 L 실린더에 주둥이를 밀봉.
3. 셀 로딩 챔버에있는 작은 교반 막대 (그림 1A)와 2 % BSA를 포함 할 가장 왼쪽이 L 실린더에 큰 교반 막대 (그림 1B)를 놓습니다.
4. 플랫폼 (그림 1D)에 2 L 침강 챔버를 놓습니다. 직접 침강 챔버 (도 1D)의 바닥에있는 개구부의 상부에 금속 배플 (도 1F)을 배치. 배플은 분수를 수집하는 동안 셀 그라데이션의 액체 및 중단의 소용돌이로 교반 방지 등이 중요하다. 침전 챔버의 상부에 뚜껑을 놓습니다.
5. 삼방 스톱 콕 (도 1G)의 그라운드 글라스 조인트에 진공 그리스의 미량을 적용하면, SE의 아래쪽 콕 클램프dimentation 챔버, 스톱 콕 및 침강 실의 그라운드 글라스 조인트를 연결.
6. 튜브와 코크의 오른쪽 콘센트에 셀 로딩 챔버 (그림 1A)를 연결합니다. 마개를 닫습니다.
7. 마개의 왼쪽 콘센트에 세포 분별 튜브를 연결합니다. 분별 튜브의 개방 단부에 연결된 유리 파스퇴르 피펫으로 튜브의 조각을 포함한다. 작은 구멍 튜브의 조각은 유리 피펫의 좁은 끝 부분에 부착되어있다. 좁은 피펫은 분수를 수집하는 동안 세포 현탁액의 흐름을 제한합니다. 맨 아래에이 작은 튜브를 클램프.
8. 2 L 크렙스 준비 (1X) 실험 (표 1)의 일을 버퍼. 그런 다음, 1X 레브 550 ml의 2 % BSA, 1X 레브에있는 550 ㎖의 4 % BSA 및 1X 크렙스에 50 ㎖의 0.5 % BSA를 준비합니다. 필터와 4 ° C.에 이러한 솔루션을 냉각
9. 오른쪽 2 L 실린더 (그림 1C)의 4 % BSA 용액과 2 % BSA를 부어왼쪽 2 L 실린더 (그림 1B)의 솔루션을 제공합니다. 확인이 실린더를 연결하는 튜브에 큰 거품이 없는지 확인하십시오.
10. 이러한 그라데이션을 방해 할 수로, 셀 로딩 챔버로 크렙스 버퍼를 따르고 있는지 더 큰 거품이 없다하고, 침전 챔버와이 챔버를 연결하는 튜브를 입력합니다. 압박 또는 튜브를 가볍게 치는 것은 부드럽게 거품을 제거하는 데 도움이됩니다. 크렙스 버퍼의 모든 튜브가 아닌 세포 실에 있는지 확인합니다.
11. 크렙스 완충액 소량 침강 챔버 내로 유동하고 튜브를 채우고있는 큰 기포를 제거하기 위해 세포 분획 튜빙으로 거의 모든 버퍼를 배출되도록.
12. 직접 침전 실 아래 부분 수집기를 놓습니다. 모든 분수 튜브가 제자리에 있고 오염을 방지하기 위해 플라스틱 포장으로 덮여 있는지 확인합니다.

2. 전체 고환에서 정자 형성 세포를 분리

1. 캘리포니아 주 12 성인 마우스 (바람직하게는 최소 8 주 이전) 및 실온에서 크렙스 버퍼에 어떤 장소 오염 물질을 씻어에서 고환을 해부하다. 설명하는이 프로토콜은 실험실 생쥐의 사용을 포함하고 펜실베니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학의 가이드 라인을 준수하여 수행되었다.
2. 당신이 정 세관을 추가하려는 직전에 원뿔 튜브에 50 ㎖ 크렙스 버퍼에 45 mg의 콜라게나 제를 추가합니다. 이 솔루션은 몇 분 동안 33 ° C까지 가열 할 수 있습니다. 두 50 ML 원뿔 튜브에 균등하게 분할합니다.
3. 투 니카 albuginea을 버리고 정 세관을 발표, 8 ML 크렙스 버퍼를 포함하는 별도의 접시에 고환을 디 캡슐. 투 니카 albuginea는 정 세관을 둘러싸고있는 얇은 막이다. 세관은 쉽게 투 니카 albuginea에서 분리해야합니다. 이를 위해, 투 니카 albuginea의 절개를, 친구 야 함께이 막을 개최집게의 R, 멀리 포셉의 다른 쌍을 사용하여 막에서 밖으로 세관을 밀어.
4. 콜라게나 제 용액 25 ㎖를 포함하는 각 원뿔 튜브에 세관을 포함하는 4 ML 크렙스 버퍼를 추가하고 10 분 동안 33 ° C에서, 동요, 품어. 끝에, 세뇨관는 "스파게티와 같은"외관을 가져야한다.
5. 세관은 튜브의 바닥에 ~ 5 분에 정착 할 수 있습니다. 상층 액을 붓고 세관은 튜브의 바닥에 각각의 시간을 정착 할 수 있도록 (실온에서) 25 ㎖를 크렙스 버퍼에 배를 세척한다. 각 튜브 ~ 5 ㎖ 크렙스 버퍼를 남겨주세요.
6. 세탁은, 당신이 정 세관을 추가하려는 직전에 팔콘 튜브에 50 ㎖ 크렙스 버퍼에 30 밀리그램의 트립신을 추가하는 동안. 이 솔루션은 몇 분 동안 33 ° C까지 가열 할 수 있습니다. 두 50 ML 원뿔 튜브에 균등하게 분할합니다.
7. 25 ㎖의 세관을 포함하는 두 개의 튜브의 각 트립신 솔루션을 추가합니다. 셀을 방지하기 위해 각각의 튜브에 3 μg의 DNA 분해 효소 (1 μg/10ml)를 추가응집에서의. 10 분 동안 33 ° C에서, 동요, 품어.
8. 약 10 배의 상품을 피펫 팅, 세관을 포함하는 용액을 교반의 넓은 구멍 피펫을 사용합니다. 이 솔루션은 더 많은 단일 세포 현탁액과 같이 시작한다.
9. 추가로 10 분 동안 33 ° C에서, 동요, 품어. 약 25 배의 상품을 피펫 팅, 단일 세포 현탁액에 세관을 분산 넓은 구멍 피펫을 사용합니다. 당신이 아직도 세관 또는 세포 덩어리를 많이 볼 경우, 피펫으로 더 분산 및 / 또는 각 튜브에 또 다른 3 μg의 DNA 분해 효소 (더블 초기 농도)를 추가합니다.
10. 100 ㎛의 메쉬 셀 스트레이너 (30 ㎖의 세포 현탁액을 각 튜브에 대해 하나)을 통해 단일 ​​세포 현탁액을 필터. 세포 현탁액을 결합하고 세포의 총 수 (10 × ¹³ 7-8 사이 셀이어야한다) 센다. *** 그라데이션에 이상 800,000,000 세포를 넣지 마십시오.
11. 2.10 단계에서 얻은 세포 수에 기초하여, appropr 펠렛늦었 5 분 450 RCF에서 필터링 된 세포의 부피 30 ㎖ 크렙스 버퍼로 세척. 반복합니다. *** 보통 22 고환 이상 800,000,000 세포를 얻을 수 있지만 세포의 수보다 더로드되지 않습니다.
12. 조심스럽게 기포를 생성하지 않고 (세포 응집의 정도에 따라) DNA 분해 효소 μg 2.5에서 5 사이를 함유하는 25 ㎖의 0.5 % BSA에서 세포를 재현 탁. 세포가 응집하지 않도록합니다. 100 μm의 메쉬 셀 스트레이너를 통해 단일 ​​세포 현탁액을 필터링합니다. 세포는 이제로드 할 준비가되어 있습니다. 튜브를 몇 번 반전로드하기 전에 잘 섞는다.

3. 셀 로딩 및 침전

1. 반드시 마개가 닫혀 있는지,하지만 액체가 침전 실 (그림 1D)에 셀 챔버 (그림 1A)로부터의 정보 흐름을 허용 할 위치에서 확인합니다.
2. 낮은 설정 교반 막대가 지속적으로 이동 할 수 있도록 (약 70 RPM)에 모두 교반 막대 판을 돌려, 그러나 천천히.
3. 셀 챔버 (도 1a)에 세포 현탁액을 넣고 세포를 10 ㎖ / 분 (도 1D)의 속도로 침강 챔버 내로 서서히 유동되도록 스톱 콕을 열어. 마개를 닫습니다. 유속은 침강 실에 체적 간격을 표시함으로써 결정될 수있다.
4. 셀 챔버에 0.5 % BSA 용액 5 ㎖을 넣고 10 ㎖ / 분의 속도로 침강 챔버로 흘려. 마개를 닫습니다. 이 단계는 세포 챔버로부터 세포를 세척한다. 배를 반복합니다.
5. 그라데이션을 준비 셀 챔버 (그림 1A)와 두 개의 2 L 실린더 (그림 1B 및 C)의 클램프를 열고, 40 ㎖ / 분의 속도 (그림 1D)에서 침강 실에 액체를 배출하기 시작 즉시. 그것은 침전 챔버로 BSA 구배를로드하는 데 약 20 ~ 30 분 소요되도록 유량을 조절합니다. 상단에 거짓말 세포의 얇은, 흐트러 층BSA 그라데이션 볼 수 있어야합니다. BSA의 대부분이로드되면, 마개를 닫고 액체가 분별 튜브에 침전 챔버에서 배출 할 수 있도록 위치로 돌립니다.
6. 볶음 판을 끕니다.
7. 세포가 1 시간 45 분 동안 침전 할 수 있습니다. 이 시간 동안 장치를 방해하지 않습니다. 기계적 교반 그라데이션을 방해 할 수 있습니다.

4. 분수의 분류 및 분석

다음 단계를 수행 ***, 그라데이션을 방해하지 않도록주의하십시오. BSA 구배 방해가되는 경우, 절차는 작동하지 않을 것이다!

1. 세포가 침전 한 후, 천천히 50 ML 원뿔 튜브에 침전 실에서 50 ㎖를 배출하고 따로 설정합니다. 이 부분은 일반적으로 세포와 파편의 원치 않는 덩어리가 포함되어 있습니다.
2. 분수의 집에 분수 튜브를 연결합니다. *** 그것은 손으로 분수를 수집 할 수도 있습니다 경우 분수 콜레ctor에 사용할 수 없습니다.
3. 분수를 수집 : 10 ㎖ (한 포집 관을 채우는)가 매 45 초를 수집되도록 꼭지와 유량을 조절합니다.
4. 분수 수집 관을 씌우고 4 ℃에서 450 RCF에서 5 분 동안 회전 조심스럽게 뜨는을 붓고 나머지 액체에 세포를 재현 탁하고, 얼음에 세포를 유지.
5. 모든 분수가 수집되면, 현미경으로 다른 세포 집단의 분수를 분석 할 수 있습니다. 상이한 세포 유형은 세포의 크기 및 핵 형태학 ^8,15 기반으로 구별 될 수있다. 2 (a) 체세포와 감수 세포 정조 세포에 대해 충실 세 풀링 된 분획은 "대표 결과", (b) 라운드 정자 등을 도시하는데,도 (C) 길게과 정자를 응축.
   • 정조 세포 유형은 12-14μm 캘리포니아입니다. 직경 및 염색질 조성 동질 둥근 핵이있다.
   • B 형 정조 세포는 8 9μm 캘리포니아입니다. 직경과 둥근 목 한핵 주변을 따라 더 밀도가 이질 염색질을 보여 D 핵.
   • 사전 leptotene의 정모 세포는 7.5-8.2μm 캘리포니아입니다. 직경, B 형 정조 세포보다 세포질을 가지고 있고, B 형 정조 세포와 유사한 모양의 핵이있다.
   • Leptotene 차 정모 세포는 8 ~ 10 μm의 캘리포니아 있습니다. 직경 및 사전 leptotene의 정모 세포의 것과 유사하지만, 핵 막에 더 조밀 한 염색질을 얻을 것 같다 핵이있다.
   • 접합기에 이어지는시기로 차 정모 세포는 10 ~ 12 μm의 캘리포니아 있습니다. 직경 및 leptotene 차 정모 세포의 것과 유사 핵이있다.
   • Pachytene의 정모 세포 어디서나 12 ~ 18 μm의 캘리포니아에서입니다. 직경과 큰 핵 주변 세포질의 얇은 테두리로 구성되어 있습니다. 조밀 염색질 이상의 덩어리가 핵에서 볼 수있다.
   • 원형 정자는 10 ㎛ 캘리포니아입니다. 직경이 중간에 밀집 염색 chromocenter 라운드 핵이있다.
   • 잔여체는 직경이 6.5 μm의 원형이며, 핵이 부족 ~하다.
   • 길게 및 응축 정자는 정자를 둥글게 크기가 비슷하지만, 고유, 낫 모양의 핵이있다.
   1. 분수 15로 시작하는 85까지 매 5 분수를 분석 할 수 있습니다. 보통, 15 이하 분수도 혼합 덩어리 진 것입니다, 그리고 85 위의 분수없이 사용할 수있는 세포에 몇 가지를 포함합니다.
   2. 분수 수집 관 (세포를 원심 분리 후 재 부유 한 후)에서 액체의 5UL을 가지고 크렙스 버퍼에 8 %의 포름 알데히드의 5UL에 추가 부분을 분석 할 수 있습니다. 고정 된 세포는 실온에서 5 분 앉아 할 수 있습니다.
   3. 고정 된 세포에 0.1 % 트리톤과 DAPI (5 μ / ㎖ 크렙스 버퍼)의 5UL를 추가합니다. 세포를 5 분 동안 실온에서 앉을 수있다.
   4. 슬라이드 상에 생성 된 용액 10 μl를 놓고 커버 슬립으로 덮고, 각 분획의 순도를 결정하기 위하여 형광 현미경으로 분석한다.
   5. 감수 분열과 체세포 이배체 세포, 둥근 정자, 그리고 길게 / 응축 정자 : 크기와 핵 형태에서 유사 세포의 다음 인구를 만들 수있는 ( "대표 결과"참조) 분수를 결합합니다.

결과

STA-PUT 절차에서 이상적인 결과는 셀의 크기 및 밀도에 기초하여 세포의 고환에서 상당히 눈에 띄는 박리이다. 정소로부터 격리 세포 BSA 그라데이션을 통해 침전되는 동안, 셀들의 몇몇 뚜렷한 밴드가 관찰 될 수있다. 세포 덩어리는 상관 그라데이션의 바닥에 가라 그리고 다른 분획을 오염되지 경향이있다. 좀 더 그라데이션까지 대형 체세포 및 감수 세포 될 것입니다. 멀리 그라데이션까지 아직?...

토론

신뢰할 수있는 세포 배양 시스템은 아직 모든 정자 형성 세포 유형 ^3을 생성하는 존재하지 않는 정자를 연구하는 사람들은 정자 형성 세포 샘플에 대한 동물 모델에 의존하고 있습니다. 정자 형성 세포가 쉽게 전체 고환에서 수집되어 있지만, 단지 혼합 인구가 발생합니다. 이는 감수 세포, 둥근 정자 및 응축 정자 등이 세포의 특정 아형을 공부하고자하는 사람들을위한 문제가있다. 세 가...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternate can be used.
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions	Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
KREBS (10x)	3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20		Autoclave/filter and store at 4 °C for several months.
KREBS (1x)	Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
Collagenase	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsin	Sigma	T9201-1G
DAPI	Preference of researcher
Triton-X100	Preference of researcher
Formaldehyde (~37%)	Preference of researcher
TABLE 2: EQUIPMENT
Equipment	Company	Catalog #	Comments
Complete STA-PUT apparatus	ProScience Glass Shop	STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)	Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.
10 μm mesh filter	Fisherbrand	22363549
Mouse dissection tools	Preference of researcher
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps	Preference of researcher
	Need approximately 100 tubes
Fraction collector	GE Healthcare Life Sciences	Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40	Alternate can be used.
Microscope slides, cover glass	Preference of researcher
Light/Fluorescent Microscope	Preference of researcher