Separazione di tipi di cellule della spermatogenesi Usando STA-PUT velocità di sedimentazione

Riepilogo

Il metodo STA-PUT consente la separazione delle diverse popolazioni di cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e densità.

Abstract

Spermatogenesi mammifero è un processo di differenziazione complesso che avviene in più fasi nei tubuli seminiferi dei testicoli. Attualmente, non esiste un sistema di coltura cellulare affidabile consentendo differenziazione spermatogenesi in vitro, e la maggior parte degli studi biologici di cellule spermatogenesi richiedono raccolta dei tessuti da modelli animali come il topo e nel ratto. Poiché il testicolo contiene numerosi tipi di cellule - sia non spermatogenesi (Leydig, Sertoli, mieloidi e cellule epiteliali) e spermatogenesi (spermatogoni, spermatociti, spermatidi rotondi, a condensazione spermatidi e spermatozoi) - Studi dei meccanismi biologici coinvolti nella spermatogenesi richiedono l'isolamento e arricchimento di questi tipi di cellule differenti. Il metodo STA-PUT consente la separazione di una popolazione eterogenea di cellule - in questo caso, dai testicoli - attraverso un gradiente lineare BSA. Tipi di cellule individuali sedimentano con velocità di sedimentazione diversa a seconda cedimensioni ll, e le frazioni arricchito da diversi tipi di cellule possono essere raccolti e utilizzati in ulteriori analisi. Mentre il metodo STA-PUT non comporta frazioni altamente puri di tipi di cellule, ad esempio come possono essere ottenuti con determinati metodi di separazione delle cellule, esso fornisce un rendimento molto più elevato di cellule totali in ogni frazione
(~ 1 x 10 ⁸ cellule / tipo di cellula spermatogenesi da una popolazione iniziale di 7-8 x 10 ⁸ cellule). Questo metodo alto rendimento richiede solo vetreria specializzata e può essere eseguita in qualsiasi ambiente freddo o grande frigorifero, che lo rende un metodo ideale per i laboratori che hanno accesso limitato alle attrezzature specializzate come una fluorescenza attivato cell sorter (FACS) o elutriator.

Introduzione

Spermatogenesi mammifero è un processo di differenziazione complesso che avviene in più fasi nei tubuli seminiferi dei testicoli ^1. In breve, staminali come gli spermatogoni che risiedono vicino l'epitelio del tubulo seminifero divide e differenziarsi in spermatociti, che poi subiscono le divisioni meiotica. Dopo meiosi è completa, le cellule aploidi risultante o spermatidi rotondi, subiscono spermiogenesi, un processo di differenziazione che coinvolge lo spargimento del citoplasma e compattazione del nucleo. Spermatidi gradualmente sviluppano un flagello e subiscono l'allungamento e la condensazione del nucleo, producendo allungamento e poi a condensazione spermatidi, rispettivamente. I prodotti finali sono spermatozoi, che vengono rilasciati nel lume del tubulo seminifero e infine nella epididimo dove maturano ulteriormente.

Poiché il processo di spermatogenesi basa su condizioni ormonali e molecolari specialitesticoli, un sistema affidabile coltura in vitro per l'intero processo di spermatogenesi non è ancora stato sviluppato ^2,3. Metodi di coltura sono stati sviluppati per la creazione di "cellule germinali primordiali come cellule" e, "le cellule spermatidi-come rotonde" aploidi da cellule staminali, ma questi metodi non sono ancora in grado di generare un gran numero di queste cellule e non riescono a produrre più tardi cellule spermatogenesi Tipi ^4,5. Fortunatamente, i tipi cellulari spermatogenici differenze significative delle dimensioni, che consente una cella singola sospensione ottenuta da testicoli interi da separare con un gradiente liquido. Il metodo STA-PUT, ha dimostrato qui, usa un gradiente BSA lineare e semplice sedimentazione per separare le cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e massa ^6-9.

Il metodo STA-PUT ha diversi vantaggi rispetto agli altri due metodi più utilizzati per separare i tipi di cellule spermatogenesi: FACS e elutriazione ^10-13. L'apparato STA-PUT richiede only diversi pezzi di cristalleria specializzati riuniti in una stanza fredda o grande frigorifero. Pertanto, è meno costoso rispetto all'utilizzo di un cell sorter o un elutriator. Il metodo STA-PUT produce una maggiore quantità di cellule per tipo di cellula e testicolo che possono essere ordinati per FACS in un arco di tempo comparabile, sebbene la purezza di ciascuna popolazione cellulare non è così elevata come quelli ottenuti con FACS ^11. Cell sorting utilizzando biglie magnetiche (magnetico cell sorting attivato, MACS) è stato recentemente impiegato con successo per l'arricchimento di spermatogoni da una popolazione di cellule testicolari mista, ma è attualmente inadatto per separare spermatociti e spermatidi a causa della mancanza di conoscenza della superficie adeguatamente i marcatori ^14. Un ulteriore vantaggio del metodo STA-PUT su FACS o MACS è la capacità di isolare cellule vitali adatto a cultura successiva perché, contrariamente alla maggior parte dei protocolli FACS, non richiede alcun DNA o altri tipi di colorazione. Per gli studi che richiedono lrendimenti arge di spermatogenesi tipi di cellule al ~ 90% di purezza, la STA-PUT è un metodo ideale.

Protocollo

Il protocollo STA-PUT prevede tre fasi: 1) Messa a punto di apparecchi e reagenti, 2) Preparazione della sospensione di cellule dai testicoli intere, e 3) il carico delle cellule, la sedimentazione, e la raccolta di frazioni. Quando è eseguita da un team di due ricercatori, il protocollo vogliono otto ore in media.

1. Impostazione del Apparatus STA-PUT (Figura 1)

*** Apparecchi STA-PUT deve essere posto in un 4 ° C grande frigorifero o una cella che può ospitare anche un raccoglitore di frazioni, se si preferisce che metodo di raccolta.

1. La sera prima (o almeno un paio d'ore prima) di eseguire il metodo, lavare tutte le attrezzature (in particolare il vetro e tubi) e sterilizzare con il 70% di etanolo. Lasciare apparecchiatura asciutto completamente prima di assemblare l'apparecchiatura come illustrato in Figura 1.
2. Fissare i due cilindri 2 L (Figure 1B e C) e la camera di carico cella ( Figura 1A) alla piattaforma superiore e collegare il tutto con due piccoli pezzi di tubo con fascette stringi tubo. Bloccare tutte le provette chiuse. Sigillare il beccuccio sulla L cilindro più a destra 2.
3. Mettere una piccola ancoretta nella camera di caricamento cella (Figura 1A) e una ancoretta maggiore nel 2 L cilindro più a sinistra (Figura 1B) che conterrà il BSA 2%.
4. Posizionare la camera di sedimentazione 2 L sulla piattaforma (Figura 1D). Posizionare il deflettore metallico (Figura 1F) direttamente sopra l'apertura nella parte inferiore della camera di sedimentazione (Figura 1D). Questo è fondamentale, come il deflettore evita vortex del liquido e la rottura del gradiente cella durante la raccolta delle frazioni. Mettere il coperchio sulla parte superiore della camera di sedimentazione.
5. Dopo l'applicazione di una piccola quantità di grasso per vuoto a giunto smerigliato del rubinetto a tre vie (figura 1G), fissare il rubinetto sul fondo della SECamera dimentation, collegando i giunti a smeriglio del rubinetto e la camera di sedimentazione.
6. Collegare la camera a cella di carico (Figura 1A) a destra all'uscita del rubinetto con la tubazione. Chiudere il rubinetto.
7. Collegare il tubo frazionamento cellulare alla presa sinistra del rubinetto. Il tubo frazionamento comprende un pezzo di tubo con una pipetta Pasteur di vetro collegato all'estremità aperta. Un pezzo di tubo di diametro inferiore è attaccato alla estremità più stretta della pipetta di vetro. La pipetta stretta limita il flusso della sospensione cellulare durante frazione raccolta. Bloccare questo piccolo tubo nella parte inferiore.
8. Preparare 2 L Krebs (1x) tamponare il giorno dell'esperimento (Tabella 1). Poi, preparare 550 ml 2% BSA in 1x Krebs, 550 ml 4% BSA in 1x Krebs, e 50 ml 0,5% BSA in 1x Krebs. Filtrare e raffreddare queste soluzioni a 4 ° C.
9. Versare la soluzione BSA 4% nel cilindro L right 2 (Figura 1C) e il 2% BSAsoluzione in sinistra 2 L cilindro (Figura 1B). Assicurarsi che non ci sono grandi bolle nel tubo che collega questi cilindri.
10. Versare tampone Krebs nella camera di caricamento delle cellule e riempire il tubo che collega questa camera con la camera di sedimentazione, assicurandosi che non ci siano grandi bolle, in quanto questi potrebbero disturbare il gradiente. Spremitura o sfogliando il tubo aiuta delicatamente per rimuovere le bolle. Assicurarsi che tutto il tampone Krebs è nel tubo e non nella camera di cella.
11. Lasciare una piccola quantità di tampone Krebs di fluire nella camera di sedimentazione e poi drenare quasi tutto il tampone nel tubo frazionamento cellulare per riempire il tubo e rimuovere eventuali bolle grandi.
12. Collocare il raccoglitore di frazioni direttamente sotto la camera di sedimentazione. Assicurarsi che tutti i tubi frazione sono a posto e coperti con pellicola trasparente per evitare la contaminazione.

2. Isolare le cellule della spermatogenesi da Testicoli interi

1. Sezionare testicoli da circa 12 topi adulti (preferibilmente almeno otto settimane) e posto in tampone Krebs a ​​temperatura ambiente per lavare via tutto il materiale contaminante. Questo protocollo essendo dimostrato prevede l'utilizzo di topi di laboratorio ed è stato eseguito in conformità con le linee guida della University of Pennsylvania Institutional Animal Care ed uso comitato.
2. Aggiungere 45 mg di collagenasi a 50 ml di soluzione tampone Krebs in un tubo conico a destra prima che si intende aggiungere i tubuli seminiferi. Lasciare questa soluzione per riscaldare fino a 33 ° C per pochi minuti. Diviso equamente in due provette da 50 ml coniche.
3. Decapsulate i testicoli in un piatto a parte contenente 8 ml di soluzione tampone Krebs, scartando la tunica albuginea e rilasciando i tubuli seminiferi. La tunica albuginea è la sottile membrana che circonda i tubuli seminiferi. I tubuli dovrebbero facilmente staccarsi dalla tunica albuginea. Per fare questo, fare un'incisione nella tunica albuginea, tenere questa membrana con un pair di pinze, e spingere i tubuli fuori e lontano dalla membrana con un altro paio di pinze.
4. Aggiungere 4 ml di tampone Krebs contenente i tubuli in ogni provetta conica contenente 25 ml di soluzione di collagenasi e incubare, agitazione, a 33 ° C per 10 min. Alla fine, i tubuli dovrebbero avere un aspetto "gli spaghetti-like".
5. Lasciare i tubuli di accontentarsi di ~ 5 minuti al fondo della provetta. Versare il surnatante e lavare 2x in 25 ml di tampone Krebs (a temperatura ambiente), permettendo tubuli di depositarsi sul fondo della provetta ogni volta. Lascia ~ 5 ml di soluzione tampone Krebs in ciascun tubo.
6. Mentre il lavaggio, aggiungere 30 mg di tripsina a 50 ml di soluzione tampone Krebs in un tubo falcon destra prima che si intende aggiungere i tubuli seminiferi. Lasciare questa soluzione per riscaldare fino a 33 ° C per pochi minuti. Diviso equamente in due provette da 50 ml coniche.
7. Aggiungere 25 ml di soluzione di tripsina per ciascuna delle due provette contenenti i tubuli. Aggiungere 3 g DNAsi (1 μg/10ml) a ciascun tubo per impedire cellas di aggregazione. Incubare, agitazione, a 33 ° C per 10 min.
8. Utilizzare una vasta pipetta foro per agitare la soluzione contenente i tubuli, li pipettaggio in e out di circa 10x. La soluzione dovrebbe cominciare a guardare più come una sospensione singola cella.
9. Incubare, agitazione, a 33 ° C per altri 10 min. Utilizzare una vasta pipetta foro per disperdere i tubuli in una sospensione singola cella, li pipettaggio in e out di circa 25x. Se si vede ancora un sacco di tubuli o grumi di cellule, disperdere più con la pipetta e / o aggiungere un altro 3 mg DNAse ad ogni provetta (doppia concentrazione iniziale).
10. Filtrare la sospensione singola cellula attraverso un colino cellula maglia 100 micron (una per ciascun tubo di sospensione cellulare 30 ml). Combinare le sospensioni cellulari e contare il numero totale di cellule (dovrebbe essere tra 7-8 x 10 ⁸ cellule). *** NON caricare più di 800 milioni le cellule sul gradiente.
11. Sulla base del conteggio delle cellule ottenuto nella fase 2.10, pellet il appropril volume iate di cellule filtrate a 450 rcf per 5 minuti e lavare con 30 ml di tampone Krebs. Ripeti. *** Di solito 22 testicoli produrranno più di 800.000.000 di cellule, ma non caricare più di questo numero di celle.
12. Risospendere delicatamente le cellule in 25 ml 0,5% BSA contenente tra 2,5 e 5 mg DNAsi (a seconda del grado di aggregazione delle cellule) senza creare bolle. Assicurarsi che le cellule non si aggregano. Filtrare la sospensione singola cella attraverso un colino cella di rete 100 micron. Le cellule sono ora pronti a caricare. Mescolare bene prima di caricare invertendo il tubo di un paio di volte.

3. Cella di carico e sedimentazione

1. Assicurarsi che il rubinetto è chiuso, ma nella posizione che permetterà liquido di fluire dalla camera di cella (Figura 1A) nella camera di sedimentazione (Figura 1D).
2. Girare entrambe le piastre ancoretta a un livello basso (circa 70 giri) per consentire le barre stir di muoversi continuamente, ma lentamente.
3. Versare la sospensione cellulare nella camera di cella (Figura 1A) e aprire il rubinetto in modo che le cellule fluire lentamente nella camera di sedimentazione ad una velocità di 10 ml / min (Figura 1D). Chiudere il rubinetto. Portata può essere determinata marcatura intervalli volume sulla camera di sedimentazione.
4. Versare 5 ml di soluzione di BSA 0,5% nella camera di cella e di scarico nella camera di sedimentazione ad una velocità di 10 ml / min. Chiudere il rubinetto. Questo passaggio lavare le cellule dalla camera di cella. Ripetere 4x.
5. Preparare il gradiente: Aprire i ganci tra la camera a cella (Figura 1A) e le due cilindri 2 L (Figura 1B e C), e cominciare a drenare il liquido nella camera di sedimentazione ad una velocità di 40 ml / min (Figura 1D) immediatamente. Regolare la portata in modo che richiede circa 20-30 min per caricare il gradiente BSA nella camera di sedimentazione. Un sottile strato di cellule indisturbato situata sulla cima delBSA gradiente dovrebbe essere visibile. Una volta caricata la maggior parte della BSA, chiudere il rubinetto e girarlo nella posizione che vi permetterà di drenare il liquido dalla camera di sedimentazione nel tubo di frazionamento.
6. Spegnere le piastre mescolare.
7. Permettono alle cellule di sedimentare per un'ora e 45 minuti. NON DISTURBARE 'APPARECCHIO durante questo tempo. Qualsiasi agitazione meccanica potrebbe disturbare il gradiente.

4. Frazionamento e analisi delle frazioni

*** Come si eseguono le seguenti operazioni, fare attenzione a non disturbare il gradiente. Se il gradiente BSA è disturbato, la procedura non funzionerà!

1. Una volta che le cellule si sedimentano, drenare lentamente 50 ml dalla camera di sedimentazione in una provetta da 50 ml e mettere da parte. Questa frazione di solito contiene grumi indesiderati di cellule e detriti.
2. Collegare il tubo frazione al collettore di frazioni. *** E 'anche possibile raccogliere frazioni da parte se un colle frazionector non è disponibile.
3. Raccogliere frazioni: Regolare il flusso con il rubinetto in modo che 10 ml (riempimento un tubo di raccolta) sono raccolti ogni 45 sec.
4. Tappare i tubi di raccolta frazione e girare per 5 minuti a 450 rcf a 4 ° C. Versare il surnatante delicatamente, risospendere le cellule in un liquido rimanente e mantenere le cellule in ghiaccio.
5. Una volta che tutte le frazioni vengono raccolte, microscopicamente analizzare le frazioni di diverse popolazioni cellulari. Diversi tipi di cellule possono essere distinti in base alle dimensioni e la morfologia cellulare nucleare ^8,15. Figura 2 illustra "risultati rappresentativi" per le tre frazioni raccolte che si arricchiscono per celle (a) e somatiche meiotiche e spermatogoni, (b) spermatidi rotondi, e (c) allungamento e condensazione spermatidi.
   • Tipo A spermatogoni sono 12-14μm ca. di diametro e hanno nuclei rotondi che sono omogenea composizione cromatina.
   • Tipo B spermatogoni sono 8-9μm ca. di diametro e hanno ROUNd nuclei che mostrano più denso eterocromatina lungo la periferia nucleare.
   • Spermatociti Pre-leptotene sono 7.5-8.2μm ca. di diametro, hanno meno citoplasma di tipo B spermatogoni, e hanno nuclei che sembrano simili a quelle di tipo B spermatogoni.
   • Spermatociti primari leptotene sono 8-10 micron ca. di diametro e hanno nuclei che sono simili a quelli di spermatociti pre-leptotene, ma sembrano avere più denso cromatina a livello della membrana nucleare.
   • Zigotene spermatociti primari sono 10-12 micron ca. di diametro e hanno nuclei che sono simili a quelli di spermatociti primari leptotene.
   • Spermatociti pachitene sono ovunque 12-18 micron ca. di diametro e sono costituiti da un sottile bordo di citoplasma che circonda un nucleo di grandi dimensioni. Altre macchie di denso cromatina può essere visto nel nucleo.
   • Spermatidi rotondi sono 10 micron ca. di diametro e hanno un nucleo rotondo con chromocenter densamente colorazione nel mezzo.
   • Residuocorpi sono ~ 6.5 micron di diametro, sono rotondi, e mancano di un nucleo.
   • Allungamento e condensazione spermatidi sono simili per dimensioni a arrotondare spermatidi, ma hanno un unico nucleo a forma di falce.
   1. Inizia con frazione di 15, e analizzare ogni cinque frazioni fino a 85. Di solito, le frazioni inferiori a 15 saranno troppo misto e disomogeneo, e le frazioni superiori a 85 conterranno pochi a nessun cellule utilizzabili.
   2. Per analizzare una frazione, prendere 5UL di liquido dal tubo di raccolta delle frazioni (volta che le cellule sono state risospese dopo centrifugazione) e aggiungere 5UL dell'8% formaldeide in tampone Krebs. Lasciare le cellule fissate a riposare a temperatura ambiente per cinque minuti.
   3. Aggiungere 5UL del 0,1% Triton e DAPI (5 μ / ml tampone Krebs) alle cellule fisse. Permettono alle cellule di riposare a temperatura ambiente per 5 min.
   4. Trasferire 10 microlitri della soluzione risultante su un vetrino, coprire con un vetrino coprioggetto e analizzare con un microscopio a fluorescenza per determinare la purezza di ciascuna frazione.
   5. Unire le frazioni che sono simili per dimensioni e morfologia nucleare (vedi "Rappresentante dei risultati") per creare le seguenti popolazioni di cellule: cellule diploidi meiotiche e somatiche, spermatidi rotondi e condensazione / allungamento spermatidi.

Risultati

Il risultato ideale dalla procedura STA-PUT è abbastanza evidente separazione di cellule dai testicoli in base alle dimensioni e la densità delle cellule. Mentre le cellule isolate da testicoli sono sedimenta attraverso il gradiente BSA, si possono osservare diverse bande distinte di cellule. Eventuali grumi di cellule tendono a depositarsi sul fondo del gradiente e non contaminare le altre frazioni. Un po 'più in alto il gradiente sarà il grande somatiche e le cellule meiotico. Più in alto il gradiente sarà a...

Discussione

Coloro che studiano la spermatogenesi si basano su modelli animali per i campioni di cellule spermatogenesi, come un sistema di coltura cellulare affidabile non esiste ancora per generare tutti i tipi cellulari spermatogeniche ^3. Anche se le cellule spermatogenesi sono prontamente raccolti dai testicoli intere, solo una popolazione mista risultati. Questo pone un problema per coloro che desiderano studiare specifici sottotipi di queste cellule, come le cellule meiotiche, spermatidi rotondi e spermatidi conden...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternate can be used.
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions	Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
KREBS (10x)	3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20		Autoclave/filter and store at 4 °C for several months.
KREBS (1x)	Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
Collagenase	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsin	Sigma	T9201-1G
DAPI	Preference of researcher
Triton-X100	Preference of researcher
Formaldehyde (~37%)	Preference of researcher
TABLE 2: EQUIPMENT
Equipment	Company	Catalog #	Comments
Complete STA-PUT apparatus	ProScience Glass Shop	STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)	Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.
10 μm mesh filter	Fisherbrand	22363549
Mouse dissection tools	Preference of researcher
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps	Preference of researcher
	Need approximately 100 tubes
Fraction collector	GE Healthcare Life Sciences	Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40	Alternate can be used.
Microscope slides, cover glass	Preference of researcher
Light/Fluorescent Microscope	Preference of researcher