הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

Summary

שיטת STA-PUT מאפשרת הפרדה של אוכלוסיות שונות של תאי spermatogenic בהתבסס על גודל וצפיפות.

Abstract

תאי זרע של יונקים הוא תהליך התמיינות מורכב המתרחש במספר שלבים בtubules seminiferous של האשכים. נכון לעכשיו, אין מערכת תרבית תאים אמינה המאפשרת בידול spermatogenic במבחנה, ורוב המחקרים ביולוגיים של תאי spermatogenic דורשים קציר רקמות ממודלים של בעלי חיים כמו העכבר והחולדה. בגלל האשך מכיל סוגים רבים של תאים - גם הלא spermatogenic (יידיג, Sertoli, מיאלואידית, ותאי אפיתל) וspermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, spermatids העגול, עיבוי spermatids ותאי זרע) - מחקרים של המנגנונים הביולוגיים המעורבים בתאי זרע דורש הבידוד והעשרה של תאים מסוגים שונים. שיטת STA-PUT מאפשרת להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של תאים - במקרה זה, מהאשכים - דרך שיפוע BSA ליניארי. סוגי תאים בודדים משקעים עם מהירות שקיעה שונה בהתאם לספירהגודל ll, והשברים מועשרים לתאים מסוגים שונים יכולים להיות שנאספו ומנוצלים בניתוחים נוספים. בעוד שיטת STA-PUT לא לגרום לשברים טהורים מאוד של סוגי תאים, למשל כמו ניתן להשיג עם שיטות מיון תא מסוימות, הוא מספק תשואה גבוהה בהרבה של תאים הכולל בכל שבריר
(~ 1 x 10 ⁸ תאים / סוג spermatogenic תא מאוכלוסייה התחלתי של 7-8 x 10 ⁸ תאים). שיטת תשואה גבוהה זה דורשת רק כלי זכוכית מתמחה ויכולה להתבצע בכל חדר קר או מקרר גדול, מה שהופך את שיטה אידיאלית למעבדות שיש להם גישה מוגבלת לציוד מיוחד כמו סדרן הקרינה הופעלה תאים (FACS) או elutriator.

Introduction

תאי זרע של יונקים הוא תהליך התמיינות מורכב המתרחש במספר שלבים בtubules seminiferous של האשכים ^1. בקצרה, הגזע דמוי spermatogonia שמתגורר בסמוך לאפיתל של מתרס אבובית seminiferous ולהתמיין לspermatocytes, אשר לאחר מכן יעבור חטיבות meiotic. לאחר מיוזה היא מוחלטת, וכתוצאה מכך התאים הפלואידים, או spermatids העגול, עוברים spermiogenesis, תהליך בידול המערב את שפיכת הציטופלסמה והדחיסה של הגרעין. Spermatids לפתח בהדרגה השוטון ועובר התארכות והתעבות של הגרעין, הפקת spermatids מתארך ולאחר מכן עיבוי, בהתאמה. מוצרי הקצה הם תאי זרע, המשתחררים ללומן של אבובית seminiferous וסופו של דבר ליותרת האשך שבו הם בוגרים יותר.

בגלל התהליך של spermatogenesis מסתמך על תנאים הורמונליים ומולקולריים מיוחדים בהאשכים, מערכת תרבות אמינה במבחנה לכל התהליך של תאי זרע עדיין לא פותחו ^2,3. שיטות תרבות פותחו ליצירה "תאי נבט קדמוני דמוי תא" ו "תאים עגולים כמו spermatid-" הפלואידים, מתאי גזע, אך שיטות אלה עדיין לא מסוגלים לייצר כמויות גדולות של תאים אלה ולא מצליחים לייצר תא spermatogenic מאוחר יותר סוגי ^4,5. למרבה המזל, סוגי spermatogenic התא שונים באופן משמעותי בגודלם, המאפשר להשעית תא בודד המתקבלת מכל אשכים להיות מופרדים עם שיפוע נוזלי. שיטת STA-PUT, הפגין כאן, משתמשת בשיפוע BSA ליניארי ושקיעה פשוט להפריד תאי spermatogenic מבוסס על גודל והמסה ^6-9.

יש שיטת STA-PUT מספר יתרונות על פני שתי שיטות נפוצות ביותר האחרות כדי להפריד בין סוגי spermatogenic תא: FACS וelutriation ^10-13. מנגנון STA-PUT דורש onlכמה חתיכות y של כלי זכוכית מתמחה התאספו בחדר קר או מקרר גדול. לכן, זה פחות יקר מאשר באמצעות סדרן תא או elutriator. שיטת STA-PUT מניבה כמויות גדולות יותר של תאים לכל סוג תא ואשך מאשר ניתן למיין על ידי FACS במסגרת זמן דומה, אם כי טוהר של כל אוכלוסיית תא הוא לא גבוה כמו אלו שהושגו עם ¹¹ FACS. מיון תא ניצול חרוזים מגנטיים (מיון מגנטי מופעל סלולרי, מחשבי מקינטוש) לאחרונה מועסק בהצלחה להעשרת spermatogonia מאוכלוסיית תאי אשכים מעורבת, אבל זה כרגע לא מתאים להפרדת spermatocytes או spermatids בשל חוסר ידע של שטח מתאים סמני ^14. יתרון נוסף של שיטת STA-PUT על FACS או MACS הוא היכולת לבודד תאי קיימא מתאימים לתרבות שלאחר מכן, כי, בניגוד לרוב פרוטוקולי FACS, היא אינה דורשת כל ה-DNA או סוגים אחרים של מכתים. למחקרים שדורשים lתשואות arge של סוגי תאי spermatogenic ב ~ טוהר 90%, STA-PUT היא שיטה אידיאלית.

Protocol

פרוטוקול STA-PUT כרוך בשלושה שלבים: 1) הגדרה של המנגנון וחומרים כימיים, 2) הכנה של השעיה תא מכל אשכים, ו3) טעינה סלולרי, שקיעה, ואיסוף שברים. כאשר היא מבוצעת על ידי צוות של שני חוקרים, הפרוטוקול לוקח שמונה שעות בממוצע.

1. הקמת מנגנון STA-PUT (איור 1)

*** מנגנון STA-PUT צריך להיות ממוקם במקרר גדול 4 ° C או חדר קר שיכול גם להכיל אספן שבריר, אם שיטה זו של אוסף היא מועדפת.

1. בלילה שלפני (או לפחות כמה שעות לפני) שתבצע את השיטה, לשטוף את כל הציוד (בעיקר כלי הזכוכית וצינורות) ולחטא עם 70% אתנול. בואו יבש ציוד לחלוטין לפני הרכבת המנגנון כפי שמודגם באיור 1.
2. Secure שני צילינדרי 2 ליטר (איורים 1B ו-C) ותא העמסת תא ( איור 1 א) לפלטפורמה העליונה ולחבר את כל עם שתי חתיכות קטנות של צינורות עם מהדק צינור. הצמידו כל הצינורות סגורים. חותם את הזרבובית על גליל L ​​ימני ביותר 2.
3. הנח בר קטן ומערבבים בתא טעינת תא (איור 1 א), ובר גדול ומערבבים בצילינדר L 2 השמאלי ביותר (איור 1) שיכיל BSA 2%.
4. הנח את תא שקיעת 2 L על הפלטפורמה (1D איור). הנח לבלבל המתכת (איור 1F) ישירות על גבי הפתח בחלק התחתון של חדר השיקוע (1D איור). זה הוא קריטי, שכן לבלבל מונע vortexing של הנוזל ושיבוש של שיפוע התא במהלך איסוף שברים. מניחים את המכסה על החלק העליון של חדר שקיעה.
5. לאחר מריחת כמות קטנה מאוד של שומן ואקום למפרק זכוכית קרקע של הסתום המשולש (איור 1G), מהדק את ברזלים לעומקו של seקאמרי dimentation, המחבר את מפרקי זכוכית קרקע של ברזלים וחדר שקיעה.
6. חבר את התא לתא טעינה (איור 1 א) אל השקע הימני של ברזלים עם צינורות. סגור את ברזלים.
7. צרף את צינורות חלוקה התא לשקע שמאל של ברזלים. צינורות חלוקה כוללים חתיכת הצינור עם זכוכית פיפטה פסטר מחוברת לסוף הפתוח. חתיכת צינור שעמם קטן יותר מחוברת לקצה הצר של פיפטה מזכוכית. פיפטה הצרה מגבילה את הזרימה של ההשעיה התא באיסוף שברים. הצמד הצינור הקטן הזה בתחתית מאוד.
8. להכין 2 L קרבס (1x) חיץ היום של הניסוי (טבלת 1). לאחר מכן, להכין 550 BSA מיליליטר 2% ב1x קרבס, 550 מיליליטר BSA 4% ב1x קרבס, וארגון ה-BSA 50 מיליליטר 0.5% ב1x קרבס. לסנן ולצנן את הפתרונים הללו ל4 ° C.
9. יוצקים את פתרון 4% BSA בצילינדר תקין 2 L (איור 1 ג) וBSA 2%פתרון בצילינדר L 2 שמאלה (איור 1). ודא שאין בועות גדולות בצינור שמחבר את הגלילים אלה.
10. יוצקים חיץ קרבס לתוך תא טעינת תא ולמלא את צינורות המחברים חדר זה עם חדר שקיעה, כדי לוודא שאין בועות גדולות, כמו אלה יכולים להפריע לשיפוע. לוחץ או מצליף את הצינור בעדינות מסייע להסיר את הבועות. ודא שכל של חיץ קרבס הוא בצינור ולא בתא התא.
11. לאפשר כמות קטנה של חיץ קרבס לזרום לתוך תא השיקוע ולאחר מכן לנקז כמעט את כל החיץ לתוך צינורות חלוקה תא כדי למלא את הצינור ולהסיר את כל בועות גדולות.
12. הנח את אספן שבריר ישירות תחת קאמרי שקיעה. ודא שכל צינורות שבריר נמצאים במקום ומכוסה בניילון הנצמד, כדי למנוע זיהום.

2. בידוד תאי Spermatogenic מאשכים שלמים

1. לנתח אשכים מca 12 עכברים בוגרים (רצוי לפחות שמונה שבועות) ומקום בחיץ קרבס בטמפרטורת חדר כדי לשטוף את כל חומר מזהם. פרוטוקול זה שמפגינים כרוך בשימוש בעכברי מעבדה והוצא להורג בעמידה בקווים המנחים של אוניברסיטת הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בפנסילבניה.
2. הוספת 45 collagenase מ"ג למיליליטר 50 חיץ קרבס בצינור חרוטי ממש לפני שאתה מתכוון להוסיף tubules seminiferous. פתרון זה יאפשר לחום עד 33 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות. לפצל באופן שווה לשני צינורות 50 חרוטי מיליליטר.
3. Decapsulate האשכים בצלחת נפרדת המכילה 8 מיליליטר חיץ קרבס, השלכת albuginea Tunica ושחרור tubules seminiferous. Albuginea Tunica הוא הקרום הדק המקיף את tubules seminiferous. Tubules צריך בקלות להתנתק מalbuginea Tunica. כדי לעשות זאת, עושה חתך בalbuginea Tunica, החזק הקרום הזה עם פאיr של מלקחיים, ולדחוף את tubules מתוך ומחוץ לקרום עם זוג נוסף של מלקחיים.
4. הוסף 4 מיליליטר חיץ קרבס מכיל את הצינוריות לכל צינור חרוטי המכיל 25 מיליליטר של תמיסת collagenase ודגירה, רועד, ב33 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בסוף, צריך להיות לי tubules מראה "דמוי ספגטי".
5. לאפשר tubules להסתפק ~ 5 דקות לחלק התחתון של הצינור. יוצקים את supernatant ולשטוף 2x ב25 מיליליטר חיץ קרבס (בטמפרטורת חדר), המאפשר tubules להתיישב לחלק התחתון של הצינור בכל פעם. השאר ~ 5 מיליליטר חיץ קרבס בצינור אחד.
6. בעוד כביסה, להוסיף 30 טריפסין מ"ג למ"ל 50 חיץ קרבס בצינור בז ממש לפני שאתה מתכוון להוסיף tubules seminiferous. פתרון זה יאפשר לחום עד 33 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות. לפצל באופן שווה לשני צינורות 50 חרוטי מיליליטר.
7. הוסף 25 מיליליטר פתרון טריפסין לכל אחד משני הצינורות המכילים את הצינוריות. הוסף 3 DNAse מיקרוגרם (μg/10ml 1) על צינור אחד כדי למנוע תאים מהתקבצות. דגירה, טלטולים, ב-C ° 33 10 דקות.
8. השתמש פיפטה שעם רחבה כדי להתסיס את התמיסה המכילה צינוריות, pipetting אותם פנימה והחוצה כ 10x. הפתרון צריך להתחיל להיראות יותר כמו השעיה תא בודדת.
9. דגירה, רועד, ב33 מעלות צלזיוס במשך נוספת 10 דקות. השתמש פיפטה שעם רחבה לפזר את הצינוריות לתוך השעיה תא בודדת, pipetting אותם פנימה והחוצה כ 25x. אם אתה עדיין רואה הרבה צינוריות או גושי תא, לפזר יותר עם פיפטה ו / או להוסיף עוד DNAse 3 מיקרוגרם לצינור אחד (ריכוז כפול ראשוני).
10. סנן את ההשעיה התא בודדת דרך מסננת תא רשת 100 מיקרומטר (אחד לכל שפופרת של 30 השעיה תא מיליליטר). מערבבים את השעיות התא ולספור את המספר הכולל של תאים (צריך להיות בין 7-8 x 10 ⁸ תאים). *** אין לטעון יותר מ 800,000,000 תאים על גבי השיפוע.
11. בהתבסס על ספירת התאים שהושגה בשלב 2.10, גלולה approprנפח iate של תאים מסוננים ב450 RCF למשך 5 דקות ולשטוף עם 30 מיליליטר חיץ קרבס. חזור על פעולה. בדרך כלל *** 22 אשכים יניבו יותר מ 800,000,000 תאים, אבל לא להעמיס יותר ממספר זה של תאים.
12. resuspend תאים בזהירות ב25 BSA 0.5% מיליליטר מכיל בין 2.5 ו5 מיקרוגרם DNAse (תלוי במידת התקבצות תא) מבלי ליצור בועות. ודא שתאים לא גוש. סנן את ההשעיה התא בודדת דרך מסננת תא רשת 100 מיקרומטר. התאים מוכנים לטעון עכשיו. מערבבים היטב לפני הטעינה על ידי צינור היפוך כמה פעמים.

3. טוען תא ושקיעה

1. ודא כי ברזלים סגור, אבל במצב שיאפשר לי נוזל לזרום מהתא לתא (איור 1 א) לתוך תא השיקוע (1D איור).
2. הפעל את שני צלחות בר ומערבב להגדרה נמוכה (כ 70 סל"ד) על מנת לאפשר לברים ומערבבים לנוע ברציפות, אבל לאט לאט.
3. יוצקים את ההשעיה התא לתוך תא התא (איור 1 א) ולפתוח את ברזלים כך שהתאים לזרום באיטיות אל תוך חדר שקיעה בשיעור של 10 מיליליטר / דקה (1D איור). סגור את ברזלים. שיעור זרימה ניתן לקבוע על ידי סימון מרווחי נפח בתא השיקוע.
4. יוצקים 5 מיליליטר של .0.5% פתרון BSA לתוך תא התא ולנקז לתוך תא השיקוע בשיעור של 10 מיליליטר / דקה. סגור את ברזלים. צעד זה לשטוף את התאים מהתא לתא. חזור על 4x.
5. הכן את השיפוע: פתח את מהדק בין התא לתא (איור 1 א) ושני צילינדרי 2 ליטר (איור 1B ו-C), ולהתחיל לרוקן את הנוזל לתוך תא השיקוע בשיעור של 40 מיליליטר / דקה (איור 1D) באופן מיידי. התאם את קצב הזרימה ולכן זה לוקח בערך 20-30 דקות כדי לטעון את שיפוע BSA לתוך תא השיקוע. שכבה דקה, ללא הפרעה של תאים מונחת על גבישיפוע BSA צריך להיות גלוי. ברגע שרוב BSA נטען, סגור את הברז ופונה לעמדה שתאפשר לניקוז נוזלים מתא שקיעה לתוך צינור חלוקתו.
6. כבה את הצלחות ומערבבים.
7. אפשר התאים למשקעים לשעה אחת ו45 דקות. לא להפריע למכשיר בתקופה זו. כל תסיסה מכאנית יכולה להפריע את השיפוע.

4. חלוקה וניתוח של שברים

*** כפי שאתה לבצע את השלבים הבאים, יש להיזהר שלא להפריע את השיפוע. אם שיפוע BSA מופרע, ההליך לא יעבוד!

1. ברגע שתאי משקעים, לנקז לאט 50 מיליליטר מתא שקיעה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ומניח בצד. חלק זה מכיל בדרך כלל גושים לא רצויים של תאים ופסולת.
2. צרף את צינור החלק לאספן שבריר. *** אפשר גם לאסוף את השברים ביד אם Colle שברירctor אינו זמין.
3. איסוף שברים: התאם את קצב הזרימה עם ברזלים כך ש10 מיליליטר (מילוי צינור איסוף אחד) נאסף כל שניות 45.
4. מכסה את צינורות איסוף שבריר ספין 5 דקות ב450 RCF ב 4 ° C. יוצקים את supernatant בעדינות, resuspend תאים בנוזל שנותר, ולשמור את התאים על קרח.
5. ברגע שכל השברים נאספים, מיקרוסקופי לנתח את השברים לאוכלוסיות תאים שונים. ניתן להבחין בין סוגי תאים שונים המבוססים על גודל תא ומורפולוגיה גרעינית ^8,15. איור 2 מדגים "תוצאות נציג" לשלושת שברים ונקוו שמועשרים לתאים וspermatogonia () גופניים וmeiotic, (ב) spermatids העגול, ו (ג) מתארך ועיבוי spermatids.
   • הקלד spermatogonia הם ca 12 14μm. קוטרו ויש לי גרעינים עגולים שהם הומוגני בהרכב הכרומטין.
   • סוג B spermatogonia הוא ca 8-9μm. קוטרו ויש לי לפהגרעיני ד המראים heterochromatin צפוף יותר לאורך הפריפריה הגרעינית.
   • spermatocytes טרום leptotene הוא ca 7.5-8.2μm. קוטרו, יש להם פחות מ ציטופלסמה סוג B spermatogonia, ויש להם גרעינים שנראים דומה לאלה בB spermatogonia סוג.
   • spermatocytes העיקרי Leptotene הוא 8-10 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעינים שנראים דומה לאלה של spermatocytes מראש leptotene, אבל נראה שכדי לזכות בהכרומטין צפוף יותר בקרום הגרעין.
   • Zygotene spermatocytes העיקרי הוא 10-12 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעינים שנראים דומה לאלה של spermatocytes העיקרי leptotene.
   • spermatocytes Pachytene הם בכל מקום בין 12-18 ca מיקרומטר. קוטר ומורכב של שפה דקה של ציטופלסמה סביב גרעין גדול. יותר גושים של הכרומטין צפוף ניתן לראות בגרעין.
   • spermatids העגול 10 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעין עגול עם chromocenter צפוף מכתים באמצע.
   • שרידיםגופים הם ~ 6.5 מיקרומטר בקוטר, הם עגולים, וחסרי גרעין.
   • spermatids מתארך והעיבוי דומה בגודלן לעגל spermatids, אבל יש גרעין ייחודי, בצורת מגל.
   1. התחל עם חלק 15 ולנתח כל חמישה שברים עד 85. בדרך כלל, שברים מתחת 15 יהיו מעורבים וגבשושיים מדי, ושברים מעל 85 יכילו כמה לתאים לא שמישים.
   2. כדי לנתח כל חלק, לקחת 5ul של נוזל מצינור איסוף שבריר (פעם תאים כבר resuspended לאחר צנטריפוגה) ולהוסיף ל5ul של פורמלדהיד 8% בחיץ קרבס. אפשר התאים הקבועים לשבת בטמפרטורת חדר למשך חמש דקות.
   3. הוספת 5ul של .0.1% טריטון וDAPI (5 μ / מיליליטר חיץ קרבס) לתאים הקבועים. אפשר התאים לשבת בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
   4. הנח 10 μl של הפתרון שהתקבל לשקופית, מכסה בלהחליק את מכסה, ולנתח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את טוהר של כל חלק.
   5. שלב את השברים הדומים בגודלם ומורפולוגיה גרעינית (ראו "נציג תוצאות") כדי ליצור האוכלוסיות של תאים הבאים: תאי דיפלואידי meiotic וסומטיים, spermatids העגול, וspermatids עיבוי / מתארך.

תוצאות

התוצאה האידיאלית מהליך STA-PUT היא הפרדה די בולטת של תאים מהאשכים המבוססים על גודל תא וצפיפות. בעוד התאים מבודדים מאשכי סדימנטציה דרך שיפוע BSA, כמה להקות שונות של תאים יכולות להיות שנצפו. כל גושים של תאים נוטים לשקוע בתחתית של השיפוע ולא לזהם את השברים האחרים. עוד קצת במע?...

Discussion

אלה שלומדים spermatogenesis להסתמך על מודלים של בעלי חיים לדגימות תאי spermatogenic, כמערכת תרבית תאים אמינה עדיין לא קיימת ליצירה כל סוגי תאי spermatogenic ^3. למרות שתאי spermatogenic נאספים בקלות מכל אשכים, רק אוכלוסיית תוצאות מעורבת. זה מהווה בעיה למי שרוצה ללמוד תתי סוגים מסוימים של ת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternate can be used.
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions	Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
KREBS (10x)	3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20		Autoclave/filter and store at 4 °C for several months.
KREBS (1x)	Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
Collagenase	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsin	Sigma	T9201-1G
DAPI	Preference of researcher
Triton-X100	Preference of researcher
Formaldehyde (~37%)	Preference of researcher
TABLE 2: EQUIPMENT
Equipment	Company	Catalog #	Comments
Complete STA-PUT apparatus	ProScience Glass Shop	STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)	Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.
10 μm mesh filter	Fisherbrand	22363549
Mouse dissection tools	Preference of researcher
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps	Preference of researcher
	Need approximately 100 tubes
Fraction collector	GE Healthcare Life Sciences	Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40	Alternate can be used.
Microscope slides, cover glass	Preference of researcher
Light/Fluorescent Microscope	Preference of researcher