Séparation des types cellulaires de la spermatogenèse Utilisation STA-PUT vitesse de sédimentation

Résumé

Procédé STA-PUT permet la séparation des différentes populations de cellules spermatiques fonction de la taille et de la densité.

Résumé

Spermatogenèse chez les mammifères est un processus de différenciation complexe qui se produit en plusieurs étapes dans les tubules séminifères des testicules. Actuellement, il n'existe pas de système de culture cellulaire fiable permettant la différenciation de la spermatogenèse in vitro, et la plupart des études biologiques des cellules spermatiques nécessite récolte des tissus de modèles animaux comme la souris et le rat. Parce que le testicule contient de nombreux types cellulaires - à la fois non-spermatogenèse (Leydig, de Sertoli, myéloïdes et les cellules épithéliales) et la spermatogenèse (spermatogonies, spermatocytes, spermatides rondes, condensation spermatides et spermatozoïdes) - études des mécanismes biologiques impliqués dans la spermatogenèse nécessiter l'isolement et l'enrichissement de ces différents types cellulaires. Procédé STA-PUT permet la séparation d'une population hétérogène de cellules - dans ce cas, des testicules - à travers un gradient linéaire de BSA. Types cellulaires individuels sédimentent avec la vitesse de sédimentation différente selon CEtaille de ll, et les fractions enrichies en différents types de cellules peuvent être recueillies et utilisées dans d'autres analyses. Bien que la méthode STA-PUT n'entraîne pas de fractions très pures de types de cellules, par exemple comme on peut obtenir avec certaines méthodes de tri cellulaire, il ne fournit avec un rendement beaucoup plus élevé de cellules totales dans chaque fraction
(~ 1 x 10 ⁸ cellules / spermatogenèse type à partir d'une population de départ de 08.07 x 10 ⁸ cellules de la cellule). Cette méthode à haut rendement nécessite que la verrerie spécialisée et peut être effectuée dans n'importe quelle pièce froide ou grand réfrigérateur, ce qui en fait une méthode idéale pour les laboratoires qui ont un accès limité à de l'équipement spécialisé comme un trieur activé par fluorescence de cellules (FACS) ou élutriateur.

Introduction

Spermatogenèse chez les mammifères est un processus de différenciation complexe qui se produit en plusieurs étapes dans les tubules séminifères des testicules ^1. En bref, la tige-comme spermatogonies qui résident près de l'épithélium du tubule séminifère fracture et se différencient en spermatocytes, qui subissent alors des divisions méiotiques. Après la méiose est terminée, les cellules haploïdes résultant, ou spermatides rondes, subissent la spermiogenèse, un processus de différenciation qui implique l'effusion du cytoplasme et le compactage du noyau. Spermatides développent progressivement un flagelle et subissent un allongement et la condensation du noyau, la production d'allongement puis condensation spermatides, respectivement. Les produits finaux sont les spermatozoïdes, qui sont libérés dans la lumière du tube séminifère et finalement dans l'épididyme, où ils mûrissent plus loin.

Parce que le processus de la spermatogenèse dépend des conditions hormonaux et moléculaires spéciauxles testicules, un système fiable de culture in vitro pour l'ensemble du processus de la spermatogenèse n'a pas encore été mis au point ^2,3. Les méthodes de culture ont été développés pour créer des "cellules analogues à des cellules germinales primordiales» et «cellules rondes de spermatides comme" haploïdes à partir de cellules souches, mais ces méthodes ne sont pas encore en mesure de générer un grand nombre de ces cellules et ne parviennent pas à produire cellule spermatogenèse plus tard types ^{de 4,5.} Heureusement, les types de cellules spermatiques diffèrent de manière significative dans la taille, ce qui permet une suspension à cellule unique obtenue à partir de testicules entiers à séparer avec un gradient liquide. La méthode STA-PUT, démontré ici, utilise un gradient linéaire BSA et simple sédimentation pour séparer les cellules spermatiques fonction de la taille et de la masse ^6-9.

La méthode STA-PUT a plusieurs avantages par rapport aux deux autres méthodes les plus utilisées pour séparer les types de cellules spermatiques: FACS et élutriation ^10-13. L'appareil STA-PUT nécessite ONLy plusieurs pièces de verrerie spécialisé assemblés dans une chambre froide ou un grand réfrigérateur. Ainsi, il est moins coûteux que d'utiliser un trieur de cellules ou un séparateur par décantation. La méthode STA-PUT produit des quantités plus élevées de cellules par type de cellule et les testicules que peuvent être triés par FACS dans un laps de temps comparable, bien que la pureté de chaque population de cellules n'est pas aussi élevés que ceux obtenus avec FACS ^11. Tri cellulaire utilisant des billes magnétiques (magnétique tri cellulaire activé, MACS) a récemment été utilisée avec succès pour l'enrichissement de spermatogonies à partir d'une population de cellules testiculaires mixte, mais il est actuellement inadapté pour séparer spermatocytes ou spermatides en raison du manque de connaissances de surface appropriée les marqueurs ^14. Un avantage supplémentaire de la méthode STA-PUT sur FACS ou MACS est la capacité à isoler des cellules viables aptes à la culture ultérieure parce que, contrairement à la plupart des protocoles de FACS, il ne nécessite pas d'ADN ou d'autres types de coloration. Pour des études nécessitant lrendements arge de la spermatogenèse types de cellules à ~ 90% de pureté, le STA-PUT est une méthode idéale.

Protocole

Le protocole STA-PUT comporte trois étapes: 1) Mise en place de l'appareil et les réactifs, 2) Préparation de la suspension de cellules de testicules entiers, et 3) Cell, la sédimentation, et la collecte de fractions. Quand elle est réalisée par une équipe de deux chercheurs, le protocole faut huit heures en moyenne.

Une. Mise en place du Dispositif STA-PUT (Figure 1)

*** Appareil STA-PUT doit être placé dans un 4 ° C grand réfrigérateur ou une chambre froide qui peut également accueillir un collecteur de fraction, si ce mode de collecte est préférable.

1. La nuit avant (ou au moins quelques heures avant), vous effectuez la méthode, laver tous les équipements (en particulier la verrerie et de tubes) et stériliser à l'éthanol à 70%. Laissez sécher le matériel avant le montage de l'appareil, comme illustré à la figure 1.
2. Fixez les deux cylindres 2 L (figures 1B et C) et la chambre cellule de chargement ( Figure 1A) à la plate-forme supérieure et relier le tout avec deux petits morceaux de tube avec colliers de serrage. Fixez tous les tubes fermés. Sceller le bec sur le plus à droite 2 L cylindre.
3. Placer une petite barre d'agitation dans la chambre cellule de chargement (figure 1A) et une plus grande barre d'agitation dans le cylindre 2 L plus à gauche (figure 1B) qui contiendra le 2% de BSA.
4. Placer la chambre de sédimentation de 2 L sur la plate-forme (figure 1D). Placer la chicane métallique (figure 1F) directement au-dessus de l'ouverture dans le fond de la chambre de sédimentation (Figure 1D). Ceci est important, car la chicane empêche tourbillonnement du liquide et de la perturbation du gradient de la cellule au cours de la collecte de fraction. Placer le couvercle sur le dessus de la chambre de sédimentation.
5. Après l'application d'une très petite quantité de graisse à vide pour le joint en verre rodé du robinet à trois voies (Figure 1G), serrer le robinet d'arrêt à la partie inférieure de la sechambre de dimentation, reliant les joints en verre rodé du robinet d'arrêt et la chambre de sédimentation.
6. Relier la chambre de cellule de chargement (Figure 1A) vers la droite la sortie du robinet d'arrêt avec tubulure. Fermer le robinet.
7. Fixer le tube de fractionnement de cellule vers la sortie du robinet d'arrêt gauche. Le tube de fractionnement comprend un morceau de tube avec une pipette Pasteur en verre reliée à l'extrémité ouverte. Un petit morceau de tube de diamètre est fixée à l'extrémité étroite de la pipette en verre. La pipette étroite limite l'écoulement de la suspension de cellules pendant la fraction collecteur. Fixez ce petit tube au bas.
8. Préparer 2 L Krebs (1x) tamponner le jour de l'expérience (tableau 1). Ensuite, préparer 550 ml de 2% de BSA dans du Krebs 1x, 550 ml de 4% de BSA dans du Krebs 1x, et 50 ml de 0,5% de BSA dans du Krebs 1x. Filtrer et refroidir ces solutions à 4 ° C.
9. Verser la solution de BSA à 4% dans le cylindre droit 2 L (figure 1C) et la BSA à 2%solution dans le cylindre de gauche 2 L (figure 1B). Assurez-vous qu'il n'y a pas de grosses bulles dans le tube qui relie ces cylindres.
10. Verser tampon Krebs dans la chambre cellule de chargement et de remplir le tube reliant cette chambre avec la chambre de sédimentation, en veillant qu'il n'y a pas de grosses bulles, car ils pourraient perturber le gradient. Presser ou effleurant le tube aide doucement pour enlever les bulles. Assurez-vous que tout le tampon de Krebs est dans le tube et pas dans la chambre de cellule.
11. Laissez une petite quantité de tampon Krebs de s'écouler dans la chambre de sédimentation et puis égouttez presque tout le tampon dans le tube de fractionnement cellulaire afin de remplir le tube et enlever les grosses bulles.
12. Placer le collecteur de fractions, directement sous la chambre de sédimentation. Assurez-vous que tous les tubes de fractions sont en place et recouverts d'une pellicule de plastique pour éviter la contamination.

2. Isoler les cellules de la spermatogenèse de testicules entiers

1. Disséquer les testicules de ca 12 souris adultes (de préférence au moins huit semaines) et les placer dans un tampon de Krebs à la température ambiante pour laver toute matière contaminante. Ce protocole est démontré implique l'utilisation de la souris de laboratoire et a été exécuté en conformité avec les lignes directrices de l'Université de Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux en Pennsylvanie.
2. Ajouter 45 mg de collagénase à 50 ml de tampon Krebs dans un tube conique juste avant vous avez l'intention d'ajouter les tubules séminifères. Laisser cette solution se réchauffer à 33 ° C pendant quelques minutes. Répartis également en deux tubes de 50 ml coniques.
3. Décapsuler les testicules dans une plaque séparée contenant 8 ml de tampon Krebs, en rejetant la tunique albuginée et libérer les tubules séminifères. La tunique albuginée est la fine membrane qui entoure les tubes séminifères. Les tubes devraient facilement se détacher de l'albuginée. Pour ce faire, faire une incision dans la tunique albuginée, maintenez cette membrane avec une pair des forceps, et pousser les tubes et hors de l'écart de la membrane avec une autre paire de forceps.
4. Ajouter 4 ml de tampon de Krebs contenant les tubules à chaque tube conique contenant 25 ml de solution de collagénase et incuber, en agitant, à 33 ° C pendant 10 min. A la fin, les tubules devraient avoir une apparence «spaghetti-comme".
5. Laisser les tubules se déposer pendant environ 5 min à la partie inférieure du tube. Verser le surnageant et laver 2x dans 25 ml de tampon Krebs (à température ambiante), ce qui permet les tubules de se déposer au fond du tube à chaque fois. Ajouter 5 ml de tampon Krebs ~ dans chaque tube.
6. Bien laver, ajouter 30 mg de trypsine à 50 ml de tampon Krebs dans un tube falcon juste avant vous avez l'intention d'ajouter les tubules séminifères. Laisser cette solution se réchauffer à 33 ° C pendant quelques minutes. Répartis également en deux tubes de 50 ml coniques.
7. Ajouter 25 ml de solution de trypsine à chacun des deux tubes contenant les tubules. Ajouter 3 pg DNAse (1 μg/10ml) à chaque tube pour éviter cellules à partir de l'agglutination. Incuber, en agitant, à 33 ° C pendant 10 min.
8. Utiliser une pipette de grand calibre pour agiter la solution contenant les tubes, les pipetage dans et hors d'environ 10x. La solution devrait commencer à ressembler davantage à une suspension cellulaire unique.
9. Incuber, en agitant, à 33 ° C pendant encore 10 min. Utiliser une pipette de grand calibre pour disperser les tubules dans une suspension de cellules individuelles, les pipetage dans et hors d'environ 25x. Si vous voyez encore beaucoup de tubes ou amas de cellules, disperser plus avec la pipette et / ou ajouter un autre 3 pg DNAse à chaque tube (concentration initiale double).
10. On filtre la suspension de cellules individuelles à travers un tamis de maille 100 um (un pour chaque tube de 30 ml de suspension cellulaire). Combiner les suspensions cellulaires et de compter le nombre total de cellules (qui devrait être entre 7-8 x 10 ⁸ cellules). *** NE PAS charger plus de 800 000 000 cellules sur le gradient.
11. Sur la base du nombre de cellules obtenu à l'étape 2.10, le culot approprle volume iate de cellules filtrées à 450 rcf pendant 5 minutes et laver avec 30 ml de tampon Krebs. Répétez. Habituellement *** 22 testicules vont produire plus de 800 000 000 cellules, mais ne chargez pas plus de ce nombre de cellules.
12. Remettre en suspension les cellules avec précaution dans 25 ml de 0,5% de BSA contenant entre 2,5 et 5 pg de DNAse (en fonction du degré d'agglutination cellulaire) sans créer de bulles. Assurez-vous que les cellules ne se collent pas. On filtre la suspension de cellules individuelles à travers un tamis de maille de 100 um. Les cellules sont maintenant prêts à charger. Mélangez bien avant le chargement en inversant le tube plusieurs fois.

3. Cellule de chargement et de sédimentation

1. Assurez-vous que le robinet d'arrêt est fermée, mais dans la position qui permet au liquide de s'écouler de la chambre de cellule (figure 1A) dans la chambre de sédimentation (Figure 1D).
2. Tournez les deux plaques de barres d'agitation sur un réglage bas (environ 70 min) pour permettre aux barres d'agitation pour se déplacer en permanence, mais lentement.
3. Verser la suspension de cellules dans la chambre de cellule (figure 1A) et d'ouvrir le robinet d'arrêt de telle sorte que les cellules s'écoulent lentement dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 ml / min (figure 1D). Fermer le robinet. Le débit peut être déterminé par le marquage des intervalles de volume de la chambre de sédimentation.
4. Verser 5 ml de solution de BSA à 0,5% dans la chambre de cellule et de s'écouler dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 ml / min. Fermer le robinet. Cette étape de lavage des cellules en dehors de la chambre de cellule. Répétez 4x.
5. Préparer le gradient: ouvrir les pinces entre la chambre à cellules (Figure 1A) et les deux cylindres 2 L (Figure 1B et C), et de commencer à vider le liquide dans la chambre de décantation à un débit de 40 ml / min (figure 1D) immédiatement. Ajuster le débit d'écoulement de sorte qu'il faut environ 20 à 30 min pour charger le gradient de BSA dans la chambre de sédimentation. Une mince couche de cellules intactes située au-dessus de laBSA gradient doit être visible. Une fois la plupart des BSA est chargé, fermer le robinet et le tourner à la position qui permettra liquide s'écouler de la chambre de sédimentation dans le tube de fractionnement.
6. Eteignez les plaques d'agitation.
7. Laisser les cellules sédimenter pendant une heure et 45 minutes. NE TOUCHEZ PAS L'APPAREIL PENDANT CE TEMPS. Toute agitation mécanique pourrait perturber le gradient.

4. Le fractionnement et l'analyse des fractions

*** Lorsque vous effectuez les étapes suivantes, veillez à ne pas perturber le gradient. Si le gradient BSA est perturbé, la procédure ne fonctionnera pas!

1. Une fois que les cellules ont sédimenté, vider lentement 50 ml de la chambre de sédimentation dans un tube conique de 50 ml et mettre de côté. Cette fraction contient généralement des amas de cellules non désirées et les débris.
2. Fixez le tube de fraction vers le collecteur de fraction. *** Il est également possible de recueillir les fractions à la main si une fraction de collecteur n'est pas disponible.
3. Recueillir des fractions: Régler le débit avec le robinet de sorte que 10 ml (remplissage d'un tube de collecte) sont recueillies toutes les 45 sec.
4. Boucher les tubes de collecte de fraction et tourner pendant 5 min à 450 rcf à 4 ° C. Verser doucement le surnageant, remettre les cellules en liquide restant, et garder les cellules sur la glace.
5. Une fois toutes les fractions sont recueillies, analyser au microscope les fractions de différentes populations cellulaires. Différents types de cellules peuvent être distingués en fonction de la taille des cellules et la morphologie nucléaire ^8,15. Figure 2 illustre "des résultats représentatifs" pour les trois fractions rassemblées qui sont enrichies en cellules et les spermatogonies (a) somatiques et méiotiques, (b) spermatides rondes, et (c) allongement et condensation spermatides.
   • Tapez spermatogonies sont 12 14μm environ. de diamètre et ont des noyaux ronds qui sont homogènes en composition de la chromatine.
   • Spermatogonies de type B sont 8-9μm ca. de diamètre et ont rounnoyaux d qui montrent hétérochromatine plus dense le long de la périphérie du noyau.
   • Spermatocytes pré-leptotène sont 7,5 8.2μm ca. de diamètre, ont moins de cytoplasme de spermatogonies de type B, et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de type B spermatogonies.
   • Spermatocytes primaires sont leptotène 8-10 um ca. de diamètre et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de spermatocytes pré-leptotène, mais semblent gagner la chromatine plus dense à la membrane nucléaire.
   • Zygotene spermatocytes primaires sont 10-12 um ca. de diamètre et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de spermatocytes primaires leptotène.
   • spermatocytes Pachytène sont partout de 12 à 18 um ca. de diamètre et sont constituées d'un mince rebord du cytoplasme entourant un gros noyau. Plus amas de chromatine dense peuvent être vus dans le noyau.
   • spermatides rondes sont de 10 um ca. de diamètre et ont un noyau rond avec une forte densité de coloration chromocentre au milieu.
   • Résiduelcorps sont ~ 6,5 m de diamètre, sont ronds, et n'ont pas de noyau.
   • D'allongement et condensation spermatides sont de taille similaire à arrondir spermatides, mais avoir un noyau unique, en forme de faucille.
   1. Commencez par fraction de 15 et d'analyser tous les cinq fractions jusqu'à 85. Habituellement, les fractions inférieures à 15 seront trop mixte et touffue, et les fractions supérieures à 85 contiennent peu ou pas de cellules utilisables.
   2. Pour analyser une fraction, prendre 5uL de liquide depuis le tube de collecte de fractions (une fois que les cellules ont été remises en suspension après centrifugation) et ajouter à 5uL de 8% de formaldehyde dans du tampon Krebs. Laisser les cellules fixées au repos à température ambiante pendant cinq minutes.
   3. Ajouter 5uL de 0,1% de Triton et DAPI (5 de tampon μ / ml de Krebs) pour les cellules fixes. Laisser les cellules au repos à température ambiante pendant 5 min.
   4. Placer 10 ul de la solution obtenue sur une lame, couvrir avec une lamelle, et d'analyser avec un microscope à fluorescence pour déterminer la pureté de chaque fraction.
   5. Combiner les fractions qui sont similaires en taille et la morphologie nucléaire (voir «Les résultats représentatifs») pour créer les populations suivantes de cellules: les cellules diploïdes de la méiose et somatiques, spermatides rondes et condensation / montaison spermatides.

Résultats

Le résultat idéal de la procédure STA-PUT est une séparation assez notable des cellules des testicules sur la base de la taille des cellules et de la densité. Alors que les cellules isolées à partir des testicules sont sédimentation à travers le gradient de BSA, plusieurs bandes distinctes de cellules peuvent être observées. Toutes les amas de cellules ont tendance à couler au fond de la pente et ne pas contaminer les autres fractions. Un peu plus haut sur la pente sera le grand cellules somatiques et méiot...

Discussion

Ceux qui étudient la spermatogenèse s'appuient sur ​​des modèles animaux pour des échantillons de cellules spermatiques, comme il n'existe pas encore un système de culture cellulaire fiable pour générer tous les types cellulaires de la spermatogenèse ^3. Bien que les cellules spermatiques sont facilement collectées à partir des testicules entiers, seule une population mixte résulte. Cela pose un problème pour ceux qui souhaitent étudier les sous-types spécifiques de ces cellules, comm...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternate can be used.
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions	Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
KREBS (10x)	3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20		Autoclave/filter and store at 4 °C for several months.
KREBS (1x)	Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
Collagenase	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsin	Sigma	T9201-1G
DAPI	Preference of researcher
Triton-X100	Preference of researcher
Formaldehyde (~37%)	Preference of researcher
TABLE 2: EQUIPMENT
Equipment	Company	Catalog #	Comments
Complete STA-PUT apparatus	ProScience Glass Shop	STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)	Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.
10 μm mesh filter	Fisherbrand	22363549
Mouse dissection tools	Preference of researcher
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps	Preference of researcher
	Need approximately 100 tubes
Fraction collector	GE Healthcare Life Sciences	Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40	Alternate can be used.
Microscope slides, cover glass	Preference of researcher
Light/Fluorescent Microscope	Preference of researcher