جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو

Summary

إنقاذ arenaviruses المؤتلف من cDNAs المستنسخة، وهو نهج يشار إلى عكس علم الوراثة، ويسمح للباحثين للتحقيق في دور الجينات الفيروسية منتجات محددة، فضلا عن مساهمة من المجالات الخاصة المختلفة والمخلفات، إلى العديد من الجوانب المختلفة للبيولوجيا الفيروسة الرملية . وعلى نحو مماثل، عكس تقنيات الوراثة في خطوط الخلايا وافقت عليها الهيئة (فيرو) لتطوير لقاح يوفر إمكانيات جديدة لتوليد لقاحات فعالة وآمنة لمكافحة arenaviruses المسببة للأمراض البشرية.

Abstract

تطوير وتنفيذ الفيروسة الرملية عكس علم الوراثة يمثل انفراجة كبيرة في مجال الفيروسة الرملية ^4. استخدام نظم minigenome الفيروسة الرملية المستندة إلى الخلايا جنبا إلى جنب مع القدرة على توليد المؤتلف arenaviruses المعدية مع الطفرات محددة سلفا في الجينوم الخاصة بهم سهلت التحقيق في مساهمة المحددات الفيروسية إلى الخطوات المختلفة لدورة حياة الفيروسة الرملية، وكذلك في استضافة فيروس تفاعلات وآليات الفيروسة الرملية المرضية ^{1، 3، 11.} وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير arenaviruses trisegmented أباح استخدام الجينوم الفيروسة الرملية للتعبير عن الجينات الغريبة إضافية من الفائدة، مما فتح إمكانية المستندة إلى التطبيقات الفيروسة الرملية ناقلات اللقاح ^5. وبالمثل، وتطوير دورة واحدة arenaviruses المعدية قادرة على التعبير عن الجينات مراسل يوفر أداة تجريبية جديدة لتحسين سلامة الأبحاث التي تنطوي على HIGHLY المسببة للأمراض arenaviruses الإنسان ^16. وقد اعتمد الجيل من arenaviruses المؤتلف باستخدام تقنيات الوراثة العكسية القائمة على البلازميد حتى الآن على استخدام خطوط الخلايا القوارض ^7،19، الأمر الذي يشكل بعض العوائق لتطوير إدارة الغذاء والدواء (FDA) المرخصة لقاح أو ناقلات اللقاح. للتغلب على هذه العقبة، ونحن هنا وصف الجيل كفاءة arenaviruses المؤتلف في خلايا فيرو وافقت عليها الهيئة.

Introduction

Arenaviruses هي فيروسات يلفها مع bisegmented، السلبية تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الجينوم ³ التي تنتمي إلى عائلة الفيروسات الرملية. الجينوم الفيروسة الرملية بترميز أربعة بروتينات بطريقة ambisense من جزأين منفصلين ³ الفيروسية. لشريحة كبيرة (L) بترميز الحمض النووي الريبي بوليميراز RNA التي تعتمد على (L) وحلقة صغيرة (مثيرة للاهتمام حقا جين جديد) البروتين إصبع (Z) التي هي بمثابة القوة الدافعة الرئيسية للفيروس في مهدها. الصغيرة (S) الجزء بترميز البروتين النووي الفيروسي (NP) وبروتين سكري سطح (GP) (الشكل 1).

عدة أعضاء من عائلة الفيروسات الرملية هي المسؤولة عن الحمى النزفية القاتلة (HF) في البشر ^3. من الشواغل مبدأ هي اسا فيروس (LASV) وفيروس جونين (JUNV)، التي من المعروف أنها تسبب ارتفاع معدل الوفيات في المرضى في المستشفى ^{8، 9.} على الرغم من أن هذه الفيروسات تستوطن غرب أفريقيا والأرجنتين الريفية، على التوالي،هناك مخاوف متزايدة من استيراد LASV وJUNV إلى المناطق غير الموبوءة وذلك بسبب زيادة السفر ^10. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن لا ترتبط عادة مع مرض شديد في البشر، ويعتبر فيروس التهاب السحايا المشيمي الفيروسة الرملية prototypic الليمفاوي (LCMV) الممرض المهملة كما كانت هناك حالات من العدوى القاتلة في مرضى نقص المناعة ^{6، 15} ويكون مسؤولا عن العيوب الخلقية والإجهاض العفوي في النساء الحوامل ^{2، 13.} حاليا لا توجد وافقت عليها الهيئة لقاحات ضد arenaviruses والعلاج يقتصر على نيوكليوسيد التناظرية ريبافيرين، والتي لا تكون فعالة إلا جزئيا وغالبا ما ترتبط مع آثار جانبية كبيرة في الولايات المتحدة.

إدخال العكسي القائم على البلازميد الوراثة ⁴ و الجيل من arenaviruses المؤتلف ^{7، 19} تقدمت إلى حد كبير مجال البحث الفيروسة الرملية. حاليا، تستخدم خلايا القوارض (مثل BHK-21) لينايرأوجه من arenaviruses المؤتلف ويرجع ذلك إلى أنواع محددة الفئران الحمض النووي الريبي بوليميراز I (POL-I) مروج توجيه النسخ الأولية للS وشرائح L. لكن الإنقاذ الفيروس في BHK-21 الخلايا ليست أسلوب معتمد لتوليد arenaviruses المؤتلف كمرشحين بذور اللقاح المحتملة. نحن هنا توثيق استخدام الإنسان POL-I المروج للانقاذ كفاءة من العالم القديم prototypic (OW) LCMV والعالم الجديد (NW) JUNV صريح # 1 السلالة في خلايا فيرو. باستخدام منهجية مماثلة، ونحن ولدت المؤتلف LCMV trisegmented (r3LCMV) وصريحة # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses التي تحتوي على اثنين من الجينات المشفرة أجنبية إضافية في اثنين من مختلف شرائح S RNA ^5. هذا النظام الجديد التالي ليس فقط على بروتوكول استنساخه للغاية وبسيطة ولكن يمكن تنفيذها فورا في توليد arenaviruses المؤتلف لقاح محتمل أو البذور ناقلات اللقاح.

Protocol

1. الفيروسة الرملية ترنسفكأيشن الإنقاذ

واستند نظام الإنقاذ لدينا على استخدام كل من البلمرة الثاني البروتين البلازميدات التعبير ترميز البروتين النووي (NP) والحمض النووي الريبي التي تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز (L)، والعوامل العابرة المفعول الفيروسية اللازمة لتكرار الحمض النووي الريبي والتعبير الجيني للجينوم الفيروسة الرملية ^{7، 19،} والبلازميدات قادرة على توجيه التوليف بين الخلايا، عن طريق الحمض النووي الريبي بوليميراز الخلوية I (POL-I) من S و L الأنواع RNA antigenome ^7. في دراساتنا نستخدم التعبير pCAGGs البروتين البلازميد، والذي يستخدم الدجاج المروج β-الأكتين وpolyadenylanation (PA) متواليات إشارة، وPOL-I الإنسان البلازميد، والذي يستخدم البلمرة الإنسان أنا المروج ومتواليات المنهي الفئران (الشكل 2) . يتم استنساخ S و شرائح الحمض النووي الريبي L في hpol-I البلازميد في التوجه antigenomic لإتاحة الفرصة لجيل من شرائح الحمض النووي الريبي الجينوم على النسخ بواسطة hpol-I. من أجل إنقاذ البرية تايPE المؤتلف LCMV (rLCMV) وصريحة # 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP وL من كل فيروس وشارك في transfected مع بهم POL-I الإنسان منهما S وشرائح الحمض النووي الريبي L (الشكل 3). يتبع جيل المؤتلف LCMV trisegmented (r3LCMV) وصريحة # 1 (r3Candid # 1) بروتوكول مماثلة ولكن تم تقسيم الجزء إلى قسمين S مختلف البلازميدات POL-I S، كل ترميز مميزة الجين المراسل: في واحد، وقراءة مفتوحة NP تم استبدال الإطار (ORF) مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) الجين مراسل (hpol-I S GFP / GP) و، في الآخر، والسلائف بروتين سكري الفيروسي (GPC) يتم استبدال ORF مع Gaussia وسيفيراز (الحلاوة) الجين المراسل (hpol NP-I S / الحلاوة). ويتضح A التمثيل التخطيطي للبروتوكول في الشكل 4. تم تأسيس ترنسفكأيشن التالية وبروتوكول عدوى لمدة 6-لوحات جيدا.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) خليط: إعداد 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام OptiMEM، وتبعاعلى الإنقاذ الفيروس، 10-12 ميكروغرام من LPF2000 (1 ميكروغرام / ميكرولتر) لكل ترنسفكأيشن (الجدول 1). ينصح نسبة 2.5 ميكروغرام لكل LPF2000 ميكروغرام من الحمض النووي. احتضان لمدة 5 - 10 دقيقة في RT. في هذه الأثناء، وإعداد خليط ترنسفكأيشن البلازميد في أنبوب microcentrifuge منفصلة (الخطوة 1.2).
2. البلازميد الحمض النووي خليط ترنسفكأيشن: إعداد كوكتيل ترنسفكأيشن البلازميد في أنبوب microcentrifuge باستخدام المبالغ الموصى بها لكل الانقاذ فيروس (انظر الجدول 1). جلب الحجم النهائي إلى 50 ميكرولتر مع OptiMEM.
3. OptiMEM-LPF2000-DNA البلازميد خليط: إضافة 250 ميكرولتر من OptiMEM-LPF2000 خليط (الخطوة 1.1) في الحمض النووي البلازميد خليط ترنسفكأيشن (الخطوة 1.2). احتضان هذا الخليط لمدة 20 - 30 دقيقة في RT. وفي الوقت نفسه إعداد والعد 1 × 10 ⁶ خلايا فيرو في رد الفعل ترنسفكأيشن. سيتم الخلايا transfected فيرو في التعليق.
4. إعداد خلايا فيرو: فيرو سليتم تربيتها ليرة سورية في 100 ملم الأطباق. قبل البدء، وجلب 1X PBS، DMEM 10٪ FBS 1٪ وسائل الإعلام PS، وخليط التربسين EDTA-إلى 37 درجة مئوية.
   1. غسل الخلايا، مرتين، مع 5 مل من 1X PBS.
   2. يعرض للتريبسين الخلايا مع 1 مل من التربسين EDTA-والانتظار حتى فصل الخلايا (حوالي 5 دقائق). لطيف التنصت المطلوبة ربما لفصل الخلايا تماما من الأطباق.
   3. بعناية، resuspend الخلايا في 10 مل من DMEM 10٪ FBS 1٪ PS في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
   4. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق عند 1،000 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي.
   5. resuspend الخلايا في 10 مل من DMEM 10٪ FBS 1٪ PS وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وضبط تركيز إلى 1 × 10 ⁶ خلية / مل. ولوحظ أن 0،5-1 × 10 ⁶ خلايا فيرو في ترنسفكأيشن تنتج أفضل النتائج.
5. مزيج LPF2000/DNA والخلايا: بعد 20 - 30 دقيقة غرفة الحضانة درجة الحرارة (الخطوة 1.3)، إضافة 1 مل من خلايا فيرو (1 × 10 ⁶⁾ (الخطوة 1.4) إلىالخليط البلازميد OptiMEM-LPF2000-DNA واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. البذور LPF2000/DNA-cell المزيج في 6 لوحات جيدا: يضاف خليط الحمض النووي LPF2000-فيرو (الخطوة 1.5) في الآبار من لوحة 6 جيدا. هز بلطف جيدا لوحة (6) والسماح للاحتضان بين عشية وضحاها ترنسفكأيشن في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
7. تغيير المتوسطة ترنسفكأيشن: حوالي 16-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة وسائل الإعلام ترنسفكأيشن، إضافة 2 مل من وسائل الاعلام العدوى واحتضان الخلايا transfected ل48 ساعة إضافية.
8. مرور الخلية: بعد 48 ساعة من الحضانة في وسائل الإعلام العدوى، وإزالة زراعة الأنسجة طاف (TCS) وتمرير الخلايا transfected في طبق 100 ملم. نادرا ما يحتوي على TCS الفيروسات المعدية وذلك لأن الخلايا transfected تحتاج حضانة إضافية لتوليد جزيئات الفيروس. لمرور الخلية:
   1. غسل الخلايا، مرتين، مع 2 مل من 1X PBS.
   2. يعرض للتريبسين الخلايا ث إيث 0.5 مل من التربسين EDTA-والانتظار حتى فصل الخلايا.
   3. resuspend الخلايا في 1 مل من DMEM 10٪ FBS 1٪ PS في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
   4. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق عند 5،000 دورة في الدقيقة، 4 ° C في microcentrifuge.
   5. resuspend بعناية الخلايا في 1 مل من وسائل الإعلام العدوى ونقل الخلايا إلى طبق 100 ملم. إحضار الحجم الكلي في لوحة، مع وسائل الاعلام المعدية، إلى 8 مل، وهو حجم كاف لمنع جفاف الخلايا وكذلك لتركيز الفيروس.
9. يهز بلطف طبق 100 ملم وتستمر الحضانة من الخلايا فيرو في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 72 ساعة.
10. جمع TCS: بعد 72 ساعة حضانة، وجمع TCS في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2،500 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي. تم العثور على الفيروسة الرملية المعدية في TCS، حتى إزالته من حطام خلية بيليه وتخزين TCS في -80 درجة مئوية.

جنيه "> 2. تأكيد من المؤتلف الإنقاذ الفيروسة الرملية

ويتحقق الكشف عن عملية انقاذ ناجحة من rLCMV وrCandid # 1 عن طريق وحدة التركيز تشكيل (FFU) مقايسة التألق المناعي (IFA). لمن النوع البري الانقاذ فيروس نستخدم الأجسام المضادة المحددة لNP الفيروسية. وr3LCMV وr3Candid # 1 ترميز اثنين من الجينات مراسل (GFP والحلاوة)، مما يتيح الكشف الفيروسية والمعايرة من دون الحاجة إلى الأجسام المضادة بواسطة المجهر مضان (GFP) و / أو التلألؤ (الحلاوة).

1. تأكيد البرية من نوع المؤتلف الانقاذ الفيروسة الرملية: وقبل يوم المعايرة، وغسل خلايا فيرو مرتين مع برنامج تلفزيوني، يعرض للتريبسين وإعداد لوحات 96-جيدا لتصل إلى 80 - 90٪ التقاء اليوم التالي (4 × 10 ⁴ خلايا / جيد). يهز بلطف لوحات باليد للحصول على توزيع الزي الرسمي للخلايا. ثقافة الخلايا، بين عشية وضحاها، في الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO _2. التحقق من الخلايا تحت المجهر للتأكد من أحادي الطبقة، قبل المضي قدما في العدوى:
   1. تمييع متسلسل (10 التخفيفات أضعاف) الفيروس التي تحتوي على TCS تعافى من الخلايا transfected في طبق ملم 100 (الخطوة 1.10) في OptiMEM.
   2. إزالة وسائل الاعلام من الخلايا فيرو المصنف، ويغسل مرتين مع 50 ميكرولتر من 1X PBS، وتصيب الخلايا مع 50 ميكرولتر من الفيروس المخفف متسلسل (الخطوة 2.1). تصيب الخلايا لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
   3. بعد الإصابة، وإزالة فيروس اللقاح، إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام عدوى / بئر واحتضان الخلايا لمدة 16-18 ساعة. قد تحدث الفيروسية إعادة العدوى بعد 18 ساعة حضانة، والتي يمكن أن تؤدي إلى الإفراط في تقدير التتر الفيروسية.
   4. في 16-18 ساعة بعد العدوى، وإزالة TCS من كل بئر وإصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد 4٪ المخفف في برنامج تلفزيوني 1X، لمدة 15 دقيقة في RT.
   5. المقبل، وإزالة الحل تثبيت وpermeabilize الخلايا مع 0.1٪ تريتون X-100 مخففة في برنامج تلفزيوني 1X، لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   6. نضح الحل permeabilization، ثم غسل الخلايا 3 مرات انترنتال 1X PBS.
   7. منع الخلايا مع 2.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني 1X (عرقلة الحل) لمدة 1 ساعة على RT. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون قد تم حظره الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، واستمر مع الحضانة الضد في اليوم التالي.
   8. وفي الوقت نفسه إعداد الأجسام المضادة الأولية. تمييع الأجسام المضادة الأولية رقم 1 الخاصة LCMV وصريح في عرقلة الحل، ثم الطرد المركزي الضد / عرقلة الحل لمدة 15 دقيقة عند 3،500 دورة في الدقيقة. وحيدة النسيلة المضادة للLCMV NP الضد استنساخ 1.1.3 (1:30 تمييع) ¹⁶ وحيدة النسيلة المضادة للJUNV الأجسام المضادة NP-SA02 BG12 من BEI الموارد (1:500 تمييع) يمكن استخدامها للكشف عن rLCMV وrCandid # 1 ، على التوالي.
   9. بعد 1 ساعة الحضانة، ونضح عرقلة الحل وإضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى الخلايا واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   10. في هذا الوقت، وتمييع الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة الحل، ثم الطرد المركزي الضد / عرقلة الحل لمدة 15 دقيقة عند 3،500 دورة في الدقيقة. بوليوقد استخدم أرنب النسيلي المضادة للماوس مفتش FITC الضد الثانوية للكشف عن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الأولية للحصول على صور لاحظ في الشكل 5.
   11. بعد 1 ساعة الحضانة، ونضح الأجسام المضادة الأولية، ويغسل 3 مرات مع 1X PBS، وإضافة الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   12. بعد 30 دقيقة الحضانة، ونضح الضد الثانوية ويغسل 3 مرات مع 1X PBS. الخلايا هي الآن جاهزة لللوحظ باستخدام المجهر مضان لكلا تحدد نجاح الانقاذ الفيروسية والمعايرة عن طريق عد التركيز تشكيل وحدة لكل مل (FFU / مل).
2. r3LCMV وr3Candid # 1 الإنقاذ الفيروسية: منذ هذه الفيروسات التعبير عن اثنين من الجينات المراسل، من ينقذ يمكن رصدها بواسطة المجهر مضان للكشف عن GFP التعبير أو التعبير الحلاوة في TCS. يمكن تأكيد الإنقاذ أيضا التعبير عن الحلاوة في TCS. لعاير الفيروسات trisegmented، ونحن نتابع الخطوات 2.1 إلى 2.1.4، ولكن الخلايا لا تحتاج إلى به ثابتة لتحديد الانقاذ الفيروسية ناجحة بسبب التعبير GFP. وسيتم تحديد المعايرة للفيروس عن طريق عد FFU / مل. لتحديد نجاح الانقاذ الفيروسية من خلال التعبير الحلاوة والتعبير الحلاوة من TCS يمكن قياسها باستخدام عدة الفحص الحلاوة (Biolux Gaussia luciferase المراسل عدة الفحص، نيو إنجلاند Biolabs). وتحقيقا لهذه الغاية:
   1. الماصة 100 ميكرولتر من TCS في لوحة 96 جيدا أبيض (شقة وحات microtiter أسفل، فيشر العلمية).
   2. إعداد luminometer (LumiCount، باكارد العلوم البيولوجية).
   3. أضف 50-100 ميكرولتر الحلاوة حل الفحص (على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة) لكل عينة وقياس الحلاوة مراسل التعبير الجيني مع luminometer. كعنصر تحكم السلبية، وقد تم قياس التعبير الحلاوة من TCS من الفيروسات البرية من نوع الخلايا المصابة.

3. مرور Supernatants زراعة الأنسجة

الانقاذ الفيروسية يعتمد على الكفاءة ترنسفكأيشن. وقد ثبت أن خلايا فيرولدينا الكفاءات ترنسفكأيشن أقل من خطوط الخلايا الأخرى ^14. إذا التتر الفيروس في TCS منخفضة، تصيب الخلايا فيرو جديدة في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 0.01 (LCMV) أو 0.1 (صريح # 1) لمدة 72 ساعة لتضخيم الفيروس.

النتائج

وسوف يتم تأكيد الانقاذ بنجاح من الفيروسة الرملية البرية من نوع المؤتلف من خلال وجود مستضدات فيروسية باستخدام IFA (الشكل 5). في حالة الفيروسات trisegmented المؤتلف، يمكن تقييم نجاح الانقاذ الفيروسية من خلال مراقبة التعبير GFP بواسطة المجهر مضان (الشكل 6A). وسو?...

Discussion

أصبح جيل من arenaviruses المؤتلف باستخدام تقنيات الوراثة العكسية القائمة على البلازميد نهج المستخدمة على نطاق واسع للتحقيق في العديد من جوانب مختلفة من علم الأحياء الفيروسة الرملية. نحن هنا توثيق تحسن حاسم في النظام الحالي عن طريق إجراء الفيروسة الرملية عمليات الإنقاذ ف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.