FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

Özet

Klonlanmış cDNAs, gibi genetik tersine adlandırılan bir yaklaşım, gelen rekombinant arenaviruses kurtarma araştırmacılar arenavirus biyolojisi birçok farklı yönlerine, spesifik viral gen ürünlerinin rolü, hem de onların farklı özel etki ve kalıntılarının katkısını araştırmak için izin verir . Benzer şekilde, insan patojen arenaviruses mücadele etmek için etkili ve güvenli aşıların üretimi için yeni olanaklar sağlar aşı geliştirilmesi için FDA onaylı hücre çizgileri (Vero) bölgesindeki genetik teknikleri ters.

Özet

Arenavirus ters genetik geliştirilmesi ve uygulanması arenavirus alanında ⁴ önemli bir atılım temsil eder. Genomları içinde önceden belirlenmiş mutasyonlar ile rekombinant bulaşıcı arenaviruses oluşturmak için yeteneği ile birlikte hücre tabanlı arenavirus Minigenom sistemlerinin kullanılması arenavirus yaşam döngüsünün farklı adımlar viral belirleyici katkısı araştırılması, hem de virüs-konak kolaylaştırmıştır etkileşimleri ve arenavirus patogenezi ^{1, 3, 11} mekanizmaları. Buna ek olarak, trisegmented arenaviruses geliştirilmesi ve böylece arenavirus bazlı aşı vektörü uygulamaları ⁵ olasılığını açılması, ilgi ek yabancı genleri ifade etmek için arenavirus genomunun kullanımına izin verdi. Aynı şekilde, ifade muhabiri genlerin yeteneğine sahip tek döngüsü bulaşıcı arenaviruses geliştirilmesi highl ilgili araştırma güvenliğini artırmak için yeni bir deneysel araç sağlary patojenik insan arenaviruses ^16. Plazmid tabanlı ters genetik teknikler kullanılarak rekombinant arenaviruses üretimi bugüne kadar Gıda ve İlaç İdaresi geliştirme (FDA) lisanslı aşı veya aşı vektörleri için bazı engeller teşkil ^7,19 kemirgen hücre hatlarının kullanımı, güvendi. Bu engeli aşmak için, FDA onaylı Vero hücrelerinde rekombinant arenaviruses etkin bir şekilde nesil burada açıklamak.

Giriş

Arenaviruses Arenaviridae ailesine ait bir bisegmented, negatif dallı RNA genomu ³ zarflı virüslerdir. Arenavirus genomu iki ayrı segmentleri viral ³ bir ambisense şekilde dört protein kodlar. Büyük (L) segmenti RNA-bağımlı RNA polimeraz (L) ve virüs tomurcuklanan temel itici güç olarak hizmet veren küçük HALKA (Gerçekten İlginç Yeni Gen) parmak protein (Z) kodlar. Küçük (S) kademeli bir viral nükleoprotein (NP) ve yüzey glikoprotein (GP) (Şekil 1) kodlar.

Arenaviridae ailesinin bazı üyeleri insanlarda ³ ölümcül kanamalı ateşi (HF) sorumludur. Ilke endişeleri yatan hastalarda ^{8, 9} yüksek mortalite neden olduğu bilinmektedir Lassa virüsü (LASV) ve Junín virüsü (JUNV) vardır. Bu virüsler sırasıyla Batı Afrika ve kırsal Arjantin, endemik olmasına rağmen,artan seyahat ¹⁰ nedeniyle endemik olmayan bölgelere LASV ve JUNV ithalatı artan endişeler vardır. Normal insanlarda ciddi hastalığı ile ilişkili olmasa da, ayrıca, prototipik arenavirus lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) immün sistemi baskılanmış hastalarda ^{6, 15} ölümcül enfeksiyon vakası olduğu gibi bir ihmal patojen olarak kabul edilir ve konjenital doğum kusurları ve spontan düşükler için sorumludur hamile kadınlar ^{2, 13.} Şu anda herhangi bir ABD arenaviruses ve tedavi karşı aşı sadece kısmen etkilidir ve genellikle önemli yan etkileri ile ilişkili nükleosit analoğu ribavirin ile sınırlıdır FDA tarafından onaylanmıştır.

Plazmid tabanlı ters genetik ⁴ ve rekombinant arenaviruses ^{7, 19} nesil tanıtımı büyük ölçüde arenavirus araştırma alanında gelişmiş var. Şu anda, kemirgen hücreleri (BHK-21 gibi) homo için kullanılırS ve L bölümlerinin başlangıç ​​transkripsiyonunu yönlendiren türe özgü murin RNA polimeraz I (pol I) promotöre bağlı yeniden birleştirici arenaviruses arasında tirme. BHK-21 hücreleri Bununla birlikte virüs kurtarma potansiyel bir aşı adayı olarak tohum arenaviruses rekombinant üretimi için onaylanmış bir yöntem değildir. Burada prototipik Eski Dünya (OW) LCMV ve Yeni Dünya (KB) Vero hücrelerinde JUNV Candid içerisinde 1. gerginlik etkin kurtarma için insan pol-I organizatörü kullanımını belgeledi. Benzer bir metodoloji kullanarak, rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) ve Candid 1. (r3Candid # 1) iki farklı S RNA segmentlerinde ⁵ olarak kodlanmış iki ek yabancı genleri içeren arenaviruses oluşturulur. Bu yeni sistem son derece tekrarlanabilir ve basit bir protokol takip ama hemen potansiyel aşı veya aşı vektör tohum olarak rekombinant arenaviruses üretimi uygulanabilir değil.

Protokol

1. Arenavirus Kurtarma Transfeksiyon

Bizim kurtarma sistemi nükleoprotein (NP) ve RNA-bağımlı RNA polimeraz (L), RNA kopyalamasının ve arenavirus genomunun gen ekspresyonu için gerekli olan viral Trans-etkili faktör kodlayan polimeraz II proteini ifade plazmid hem de kullanımı dayalı ^{7, 19,} ve hücresel S RNA polimeraz I (pol I), ve L, antigenome RNA türlerinin ⁷ ile hücre içi sentez, doğrudan sahip plazmid. Bizim çalışmalarımız sırasında bir promotör ve terminatör sıçangil dizileri (Şekil 2), insan polimeraz kullanan pCAGGs proteini tavuk β-aktin promoteri ve polyadenylanation (PA) sinyal dizileri kullanan ekspresyon plazmidi, ve insan pol I plazmit kullanmak . S ve L RNA segmenti HPOL-I ile transkripsiyonu genomik RNA segmenti üzerine üretimi için izin vermek için bir antigenomik yönde HPOL-I plazmid içine klonlanır. Vahşi-ty kurtarma içinPE rekombinant LCMV (rLCMV) ve içten # 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP ve her bir virüs, insan L kendi poli-I S ve L RNA segmenti (Şekil 3) ile birlikte ko-transfekte edilmiştir. Rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) ve 1. (# 1 r3Candid) Candid nesil benzer bir protokol izledi ama S segment iki farklı pol-I S plazmid, her kodlama farklı bir muhabir gen bölündü: biri, NP açık okuma çerçevesi (ORF) yeşil floresan proteini (GFP) raportör geni (HPOL-I S GFP / GP) ve bir diğerinde ise, viral glikoprotein öncü (GPC) ORF Gaussia lusiferaz (Gluc) raportör geni ile değiştirilir ile değiştirildi (HPOL-I S NP / Gluc). Protokolünün bir şematik gösterimi Şekil 4 'de gösterilmiştir. Aşağıdaki transfeksiyon, enfeksiyon protokolü 6 kuyulu plakalar için kurulmuştur.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) karışımı: OptiMEM medya 250 ul hazırlayın ve, bağlıüzerinde virüs kurtarma, 10 - transfeksiyon başına LPF2000 12 mg (1 ug / ml) (Tablo 1). DNA mikrogram başına 2.5 mikrogram LPF2000 bir oranı tavsiye edilir. Oda sıcaklığında 10 dakika - 5 inkübe edin. Bununla birlikte, ayrı bir mikrosantrifüj tüpü (adım 1.2) elde edildi ve plazmidin transfeksiyon karışımı hazırlandı.
2. Plazmid DNA transfeksiyon karışımı: Her virüs kurtarma için önerilen miktarda (bkz. Tablo 1) kullanarak mikrosantrifüj tüp plazmid transfeksiyon kokteyl hazırlayın. OptiMEM ile 50 ul son hacim getirin.
3. OptiMEM-LPF2000 plazmid-DNA karışımı: plazmid DNA transfeksiyon karışımı (adım 1.2) içine OptiMEM-LPF2000 karışımı (adım 1.1) 250 ul ekle. Oda sıcaklığında 30 dak - 20 bu karışım inkübe edin. Bu arada hazırlamak ve transfeksiyon reaksiyon başına 1 x 10 ⁶ Vero hücreleri saymak. Vero hücreleri süspansiyon içinde transfekte edilir.
4. Vero hücreleri hazırlanması: Vero CelLs 100 mm çanağı kültürlenmiştir. Başlamadan önce, 37 ° C ile 1x PBS, DMEM,% 10 FBS,% 1 PS medya ve tripsin-EDTA karışımı getirmek
   1. 1x 5 ml PBS ile iki kez, hücreler yıkayın.
   2. Tripsin-EDTA 1 ml hücre Trypsinize ve hücreler çıkartılma (yaklaşık 5 dakika) kadar bekleyin. Nazik belki tam olarak yemekler hücreleri ayırmak için gerekli kılavuz çekme.
   3. Dikkatli bir şekilde, bir 15 ml santrifüj tüpüne DMEM% 10 FBS% 1 PS 10 ml hücre süspansiyon haline getirin.
   4. Bir santrifüj içinde 1000 rpm'de 5 dakika için hücreler santrifüjleyin.
   5. DMEM% 10 FBS,% 1 PS 10 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve bir hemasitometre kullanılarak hücre sayımı, 1 x 10 ⁶ hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır. 1 x 10 transfeksiyon başına ⁶ Vero hücreleri en iyi sonuçları vermiştir 0,5 - olduğu gözlenmiştir.
5. LPF2000/DNA ve hücrelerin karışımı: 20 ardından - 30 dakika, oda sıcaklığında inkübasyon (adım 1.3), Vero hücreleri, 1 ml (1 x 10 ⁶⁾ (Basamak 1.4) eklemekOda sıcaklığında 5 dakika boyunca OptiMEM-LPF2000 plazmid-DNA karışımı ve inkübe.
6. 6 kuyulu tabak içine Tohum LPF2000/DNA-cell karışımı: 6-kuyulu plakanın kuyularına DNA LPF2000-Vero karışımı (adım 1.5) ekleyin. Yavaşça 6-iyi plaka sallamak ve 37 inkübatör transfeksiyon inkübe gecede izin ° C ve% 5 CO _2.
7. Transfeksiyon orta değiştirin: Yaklaşık 16-24 saat sonrası transfeksiyon, transfeksiyon ortamı çıkarın enfeksiyon medya 2 ml ekleyin ve ek 48 saat için transfekte hücreleri inkübe.
8. Hücre geçiş: enfeksiyon ortamı içinde 48 saat inkübasyondan sonra, doku kültür yüzey (ASR) kaldırmak ve 100 mm tabak içine transfekte hücrelere geçerler. Transfekte edilmiş hücrelerin virüs parçacıkları üretmek için ilave inkübasyon gerekir, çünkü ASR nadiren bulaşıcı bir virüs içerir. Hücre geçişi için:
   1. 1x 2 ml PBS ile iki kez, hücreler yıkayın.
   2. Hücreler w Trypsinize ith 0.5 tripsin-EDTA ml ve hücreleri ayırmak kadar bekleyin.
   3. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde DMEM% 10 FBS% 1 PS 1 ml süspansiyon hücreleri.
   4. 5000 rpm'de 5 dakika, 4 ° C bir mikrosantrifüj içinde için hücreler santrifüjleyin.
   5. Dikkatle enfeksiyon ortamı, 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 100 mm tabak için hücreleri aktarın. 8 mL, virüs için konsantre hücre kurutma hem de önlenmesi için yeterli bir hacme kadar, bulaşıcı medya ile, plaka toplam hacmi kadar getir.
9. Yavaşça 37, 100 mm tabak sallamak ve inkübatör Vero hücreleri ile inkübasyon devam ° C ile 5% 72 saat boyunca _CO2.
10. TCS toplanması: 72 saat inkübasyondan sonra, 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne TCS toplamak. Bir santrifüj içinde 2500 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüje edilerek hücre artıkları çıkarın. Bulaşıcı arenavirus TCS bulunan, bu nedenle hücre enkaz pelet kaldırmak ve -80 TCS saklamak ° C

Rekombinant Arenavirus Kurtarma le "> 2. Onay

RLCMV ve rCandid 1. başarılı bir kurtarma tespiti bir odak oluşturan birim (FFU) immünofloresan testi (IFA) ile elde edilir. Vahşi tip virüs kurtarma için biz viral NP için spesifik antikorların kullanımı. R3LCMV ve r3Candid # 1, bu şekilde floresan mikroskobu (GFP) ve / ya da lüminesans (Gluc) ile antikorların gerek kalmadan tespit ve viral titrasyon sağlayan, iki haberci genlerin (GFP ve Gluc) kodlar.

1. Yabani tip rekombinan arenavirus kurtarma tekrarlayın: titrasyon bir gün önce, iki kez PBS ile yıkayın trypsinize Vero hücreleri ve 80 ulaşmak için 96 oyuklu plaka hazırlanması -% 90 izdiham sonraki gün (4 x 10 ⁴ hücre / çukur). Yavaşça hücre üniformalı dağılımı elde etmek için elle tabak sallayın. Kültür hücreleri, gecede, 37 ° C inkübatör% 5 CO ₂ ile. Enfeksiyon devam etmeden önce, bir tek tabaka onaylamak için mikroskop altında hücrelerin kontrol edin:
   1. Seri olarak seyreltilmiş (10 kat seyreltme) virüs içeren TCS OptiMEM içinde 100 mm çanağı (adım 1.10) 'de transfekte edilmiş hücreler geri kazanılır.
   2. Numaralı seribaşı Vero hücrelerinde bulunan ortamı çıkarın 1x PBS 50 ul ile iki kez yıkayın, ve seri seyreltilmiş virüs (adım 2.1) 50 ul hücreleri enfekte. 37 1.5 saat hücreleri enfekte ° C ve% 5 _CO2.
   3. Enfeksiyondan sonra, virüs inokulum kaldırmak 100 enfeksiyon medya ul / iyi ekleyin ve 16 hücreleri inkübe - 18 saat. Viral yeniden enfeksiyon viral titreleri aşırı tahmininde neden olabilecek, 18 saat inkübasyondan sonra oluşabilir.
   4. 16 - 18 saat sonrası enfeksiyon, her kuyudan TCS çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, 1 x PBS içinde sulandırılmış% 4 formaldehit ile hücreleri gidermek.
   5. Daha sonra, sabitleme çözeltisi kaldırmak ve hücre geçirgenliği ile% 0.1 Triton X-100, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, 1 x PBS içinde seyreltilmiştir.
   6. Permeabilization çözüm aspire, daha sonra hücreleri 3 kez wi yıkayıninci 1x PBS.
   7. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS 1x (çözelti engelleme) içinde% 2.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile hücrelerin bloke edin. Seçenek olarak ise, hücreler, 4 ° C'de gece boyunca bloke edilir ve antikor inkübasyon ertesi gün ile devam edilebilir.
   8. Bununla birlikte, birincil antikor hazırlanması. Çözümü engelleme LCMV-ve içten # 1 spesifik primer antikorlar seyreltilir ve daha sonra 3,500 rpm'de 15 dakika boyunca / bloke etme çözeltisi antikor santrifüj. BEI Kaynaklar (1:500 seyreltme) ikinci monoklonal anti-NP LCMV antikor klon 1.1.3 (1:30 seyreltme) ¹⁶ ve monoklonal anti-NP JUNV antikor SA02-BG12 rLCMV algılama ve rCandid # 1 için kullanılabilir sırasıyla.
   9. 1 saat inkübasyondan sonra, bloke etme çözeltisi aspire ve hücrelere birincil antikor 50 ul ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe ° C
   10. Bu zamanda, çözelti engelleme ikincil antikor azaltır ve daha sonra 3,500 rpm'de 15 dakika boyunca antikor / bloke etme çözeltisi santrifüj. Poliprimer monoklonal antikorların tespiti için klonal tavşan anti-fare IgG ikincil antikor FITC Şekil 5'te görülen görüntüler elde etmek için kullanılmıştır.
   11. 1 saat inkübasyondan sonra, birincil antikor aspire 1X PBS ile 3 defa yıkanır ve 37 C'de 30 dakika boyunca, ikincil antikor ekleyin ° C
   12. 30 dakika inkübasyondan sonra, ikinci antikor ve aspire 1x 3 kez PBS ile yıkayın. Hücreler her iki ml (FFU / ml) başına birim oluşturan odak sayarak viral kurtarma ve titrasyon başarısını belirlemek için floresan mikroskobu kullanarak şimdi dikkat edilmesi hazırız.
2. r3LCMV ve 1. r3Candid viral kurtarma: Bu virüsler iki muhabiri gen ifade yana, kendi GFP ifade veya TCS olarak Gluc ifade algılamak için floresan mikroskobu ile izlenebilir kurtarır. Kurtarma da TCS içinde Gluc ifade ile teyit edilebilir. Trisegmented virüs titre etmek için, 2.1.4 adımları 2.1 izleyin, ancak hücreleri, B gerekmezE çünkü GFP ifade başarılı bir viral kurtarma belirlemek için sabit. Virüs titrasyonu FFU / ml sayılması ile tespit edilir. Gluc ifade, TCS gelen Gluc ifade tarafından başarılı viral kurtarma belirlemek için bir Gluc tahlil kiti (Biolux Gaussia Lusiferaz Testi kiti, New England Biolabs) kullanılarak ölçülebilir. Bu amaçla:
   1. Bir 96-gözenekli beyaz plaka (düz tabanlı mikrotitre plakaları, Fisher Scientific) içine pipet TCS 100 ul.
   2. Luminometre (Lumicount, Packard Biosciences) ayarlayın.
   3. Her örnek için 100 ul Gluc Deneyi çözeltisi (imalatçı tarafından tavsiye edilen) ve luminometre ile Gluc raportör gen ölçer - 50 ekleyin. Negatif bir kontrol olarak, vahşi tip virüs enfekte olan hücrelerden TCS Gluc ifade ölçüldü.

3. Doku kültür yüzer geçişi

Viral kurtarma transfeksiyon verimliliği bağlıdır. Vero hücrelerinde gösterilmiştirdiğer hücre hatları ¹⁴ daha düşük transfeksiyon verimliliği olması. TCS virüs titreleri düşük ise, virüs amplifiye etmek için 72 saat boyunca 0.01 (LCMV) veya 0.1 (1. İçten) 'lik bir enfeksiyon çokluğu (İB), taze Vero hücreleri enfekte edebilir.

Sonuçlar

Bir rekombinant yabani tip arenavirus başarılı kurtarma IFA (Şekil 5) kullanılarak viral antijen varlığı ile teyit edilecektir. Trisegmented rekombinant virüsler ile ilgili olarak, başarılı virüs kurtarma floresan mikroskobu (Şekil 6A), GFP ifade gözlemleyerek değerlendirilebilir. Başarılı kurtarma daha Gluc ifade (Şekil 6B) değerlendirerek teyit edilecektir. Yabani tip ve trisegmented arenavirus başarılı bir kurtarma gösteren Örnek sonuçlar, ...

Tartışmalar

Plazmid tabanlı ters genetik teknikler kullanılarak rekombinant arenaviruses üretimi arenavirus biyoloji birçok farklı yönleriyle araştırılması için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım haline gelmiştir. Burada arenavirus yaparak mevcut sistem için çok önemli bir gelişmeyi belgelemek diğer bulaşıcı hastalıklara karşı arenaviruses ve aşı vektörler karşı FDA onaylı aşı adayların potansiyel üretimi için izin, Vero hücrelerinde kurtarır.

Ilgili deneysel p...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.