Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

Resumen

Rescate de arenavirus recombinantes a partir de ADNc clonado, un enfoque conocido como la genética inversa, permite a los investigadores estudiar la función de los productos específicos de genes virales, así como la contribución de los diferentes dominios y residuos específicos, a diferentes aspectos de la biología de los arenavirus . Del mismo modo, las técnicas de genética inversa en líneas celulares aprobados por la FDA (Vero) para el desarrollo de vacunas ofrece nuevas posibilidades para la generación de vacunas seguras y eficaces para combatir arenavirus patógenos humanos.

Resumen

El desarrollo e implementación de arenavirus genética inversa representa un avance significativo en el campo arenavirus ^4. El uso de los sistemas de minigenoma arenavirus basados ​​en células, junto con la capacidad de generar recombinantes arenavirus infecciosas con mutaciones predeterminadas en sus genomas ha facilitado la investigación de la contribución de los determinantes virales para las diferentes etapas del ciclo de vida arenavirus, así como virus-huésped interacciones y mecanismos de patogénesis arenavirus ^{1, 3, 11.} Además, el desarrollo de arenavirus trisegmented ha permitido el uso del genoma arenavirus para expresar genes extraños de interés adicionales, abriendo así la posibilidad de aplicaciones de vectores de vacunas basados ​​en arenavirus ^5. Del mismo modo, el desarrollo de un solo ciclo de arenavirus infecciosos capaces de expresar genes indicadores proporciona una nueva herramienta experimental para mejorar la seguridad de la investigación con highlŸ arenavirus patógenos humanos ^16. La generación de arenavirus recombinantes utilizando técnicas de genética inversa basadas en plásmidos ha basado hasta ahora en el uso de líneas celulares de roedores ^7,19, lo que plantea algunas de las barreras para el desarrollo de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) con licencia de vacuna o vectores de vacuna. Para superar este obstáculo, como se describe aquí la generación eficiente de los arenavirus recombinantes en células Vero aprobados por la FDA.

Introducción

Los arenavirus son virus envueltos con un bisegmented, genoma de ARN de cadena negativa ³ que pertenecen a la familia Arenaviridae. El genoma arenavirus codifica cuatro proteínas de una manera ambisense a partir de dos segmentos virales separadas ^3. El segmento grande (L) codifica la ARN polimerasa dependiente de ARN (L) y el anillo pequeño (realmente interesante nuevo gen) de proteínas dedo (Z), que sirve como la principal fuerza impulsora del virus en ciernes. El pequeño segmento (S) codifica la nucleoproteína viral (NP) y la glicoproteína de superficie (GP) (Figura 1).

Varios miembros de la familia Arenaviridae son responsables de la fiebre hemorrágica letal (HF) en los seres humanos ^3. De las preocupaciones principales son el virus de Lassa (LASV) y el virus Junín (JUNV), que se sabe que causa una alta mortalidad en los pacientes hospitalizados, ^{8, 9.} A pesar de estos virus son endémicos de África occidental y rural Argentina, respectivamente,hay cada vez más preocupación de importación de LASV y JUNV a zonas no endémicas debido al aumento de los viajes ^10. Además, a pesar de que normalmente no se asocia con una enfermedad grave en el hombre, el arenavirus prototípico virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) se considera un patógeno descuidado ya que ha habido casos de infección letal en pacientes inmunodeprimidos ^{6, 15} y es responsable de los defectos congénitos y abortos espontáneos en mujeres embarazadas ^{2, 13.} Actualmente no hay EE.UU. FDA aprobó las vacunas contra arenavirus y el tratamiento se limita al análogo de nucleósido ribavirina, que es sólo parcialmente efectiva ya menudo asociado con efectos secundarios significativos.

La introducción de la marcha atrás plásmido basado en la genética ⁴ y la generación de arenavirus recombinantes ^{7, 19} han avanzado en gran medida el campo de la investigación arenavirus. Actualmente, las células de roedores (tales como células BHK-21) se utilizan para la Generación de arenavirus recombinantes debido a la ARN polimerasa I murino específico de la especie (pol-I) promotor que dirige la transcripción inicial de la S y L segmentos. Sin embargo rescate del virus en las células BHK-21 no son un método aprobado para la generación de arenavirus recombinantes como posibles candidatos vacunales de siembra. Aquí se documenta el uso de la pol-I promotor humano de rescate eficiente del Viejo Mundo prototípico (OW) LCMV y el Nuevo Mundo (NW) JUNV Candid # 1 cepa de células Vero. Usando una metodología similar, hemos generado recombinante LCMV trisegmented (r3LCMV) y Candid # 1 (r3Candid # 1) arenavirus que contienen dos genes extraños adicionales codificados en dos segmentos de ARN diferentes S ^5. Este nuevo sistema no sólo sigue un protocolo simple y altamente reproducible, pero se puede implementar inmediatamente en la generación de arenavirus recombinantes como vacuna potencial o semillas de vector de vacuna.

Protocolo

1. Arenavirus transfección Rescate

Nuestro sistema de rescate se basa en el uso de ambos II plásmidos de expresión de proteínas de polimerasa que codifican la nucleoproteína (NP) y dependiente de ARN-ARN-polimerasa (L), los factores que actúan en trans virales necesarias para la replicación de ARN y la expresión de genes del genoma arenavirus ^{7, 19,} y los plásmidos capaces de dirigir la síntesis intracelular, celular a través de la ARN polimerasa I (pol-I), de la S y L ​​especies de ARN antigenoma ^7. En nuestros estudios usamos el pCAGGS plásmido de expresión de la proteína, que utiliza el pollo promotor de β-actina y polyadenylanation (pA) secuencias de señal, y el pol-I humano plásmido, que utiliza la polimerasa I humana secuencias promotoras y terminadoras murinos (Figura 2) . La S y segmentos de ARN L se clonaron en el plásmido HPOL-I en una orientación antigenómico para permitir la generación de segmentos de ARN genómico en la transcripción por HPOL-I. Para el rescate de wild-tyPE LCMV recombinante (rLCMV) y Candid # 1 (rCandid # 1) el pCAGGS NP y L a partir de cada virus fueron co-transfectadas junto con sus respectivos pol-I humano S y L ​​segmentos de ARN (Figura 3). Generación de LCMV trisegmented recombinante (r3LCMV) y Candid # 1 (r3Candid # 1) siguió un protocolo similar pero el segmento S se dividió en dos plásmidos pol I-S diferentes, cada uno que codifica un gen reportero distintivo: en uno, la lectura NP abierto marco (ORF) se reemplazó con la proteína (GFP) gen verde fluorescente reportero (HPOL-I S GFP / GP) y, en el otro, el precursor de la glicoproteína viral (GPC) ORF se sustituye con la luciferasa Gaussia (Gluc) gen reportero (HPOL-I S NP / Gluc). Una representación esquemática del protocolo se ilustra en la Figura 4. El siguiente protocolo de transfección y la infección se ha establecido para los de 6 pocillos y placas.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mezcla de: preparar 250 l de los medios de comunicación Optimem y, dependiendoen el virus de rescate, 10 - 12 g de LPF2000 (1 g / l) por transfección (Tabla 1). Se recomienda una relación de 2,5 g LPF2000 por g de ADN. Incubar durante 5 - 10 min a RT. Mientras tanto, preparar la mezcla de transfección del plásmido en un tubo de microcentrífuga separado (paso 1.2).
2. Mezcla de transfección de ADN de plásmido: Preparar el cóctel de transfección del plásmido en un tubo de microcentrífuga usando las cantidades recomendadas para cada virus de rescate (véase la Tabla 1). Llevar el volumen final a 50 l con OptiMEM.
3. Plásmido mezcla OptiMEM-LPF2000-ADN: Añadir 250 l de la mezcla-LPF2000 OptiMEM (paso 1.1) en la mezcla de transfección de ADN plásmido (paso 1.2). Se incuba esta mezcla durante 20 - 30 min a TA. Mientras tanto preparar y contar 1 x 10 ⁶ células Vero por reacción de transfección. Células Vero se transfectaron en suspensión.
4. Preparación de células Vero: Vero cells se cultivan en placas de 100 mm. Antes de comenzar, llevar el 1x PBS, DMEM FBS al 10% PS 1%, y la mezcla de tripsina-EDTA a 37 ° C.
   1. Lavar las células dos veces con 5 ml de PBS 1x.
   2. Tripsinizar las células con 1 ml de tripsina-EDTA y esperar hasta que las células de desconexión (aproximadamente 5 min). Golpecitos suaves quizá necesaria para retirar completamente las células de los platos.
   3. Con cuidado, resuspender las células en 10 ml de DMEM 10% de FBS 1% PS en un tubo de centrífuga de 15 ml.
   4. Centrifugar las células durante 5 min a 1000 rpm en una centrífuga.
   5. Resuspender las células en 10 ml de DMEM 10% de FBS 1% PS y contar las células usando un hemocitómetro y ajustar la concentración de 1 x 10 ⁶ células / ml. Se observó que el 0,5 - 1 x 10 ⁶ células Vero por transfección produce los mejores resultados.
5. Mezclar LPF2000/DNA y células: Después de 20 - 30 min sala de incubación a temperatura ambiente (paso 1.3), añadir 1 ml de células Vero (1 x 10 ⁶⁾ (paso 1.4) ael plásmido mezcla OptiMEM-LPF2000-ADN y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Semilla LPF2000/DNA-cell mezcla en 6-así placas: Añadir la mezcla de ADN-LPF2000-Vero (paso 1.5) en los pocillos de la placa de 6 pocillos. Agitar suavemente la placa de pocillos 6 y dejar que la transfección se incuba durante la noche en la incubadora a 37 ° C y 5% de _CO2.
7. Cambiar medio de transfección: Aproximadamente 16 - 24 horas después de la transfección, eliminar el medio de transfección, añadir 2 ml de medio de infección y se incuban las células transfectadas durante 48 h adicionales.
8. Paso de la célula: Después de 48 h de incubación en los medios de comunicación de infección, eliminar el sobrenadante de cultivo de tejido (TCS) y pasar las células transfectadas en una placa de 100 mm. El TCS rara vez contiene virus infeccioso debido a que las células transfectadas necesitan incubación adicional para generar partículas de virus. Para el paso de células:
   1. Lavar las células dos veces con 2 ml de PBS 1x.
   2. Tripsinizar células w ith 0,5 ml de tripsina-EDTA y esperar hasta que las células se desprenden.
   3. Resuspender las células en 1 ml de DMEM 10% de FBS 1% PS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   4. Centrifugar las células durante 5 min a 5000 rpm, 4 ° C en una microcentrífuga.
   5. Cuidadosamente resuspender las células en 1 ml de medio de infección y transferir las células a un plato de 100 mm. Llevar el volumen total en la placa, con los medios de comunicación infecciosas, a 8 ml, un volumen suficiente para prevenir el secado de las células, así como para concentrar el virus.
9. Agite suavemente el plato de 100 mm y continuar la incubación de células Vero en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 72 horas.
10. Colección de TCS: Después de 72 h de incubación, recoger el TCS en un tubo de centrífuga de 15 ml. Eliminar los restos celulares por centrifugación durante 5 min a 2500 rpm en una centrífuga. Arenavirus infecciosa se encuentra en el TCS, por lo que eliminar de la sedimento de restos celulares y almacenar el TCS a -80 ° C.

le "> 2. Confirmación de rescate Arenavirus recombinante

La detección de un rescate exitoso de rLCMV y rCandid # 1 se logra a través de una unidad de formación de enfoque (FFU) ensayo de inmunofluorescencia (IFA). Para rescatar virus natural que utilizamos anticuerpos específicos para el NP viral. El r3LCMV y r3Candid # 1 codifican dos genes informadores (GFP y Gluc), permitiendo así la detección viral y valoración sin la necesidad de anticuerpos por microscopía de fluorescencia (GFP) y / o luminiscencia (Gluc).

1. Confirmación de tipo salvaje rescate arenavirus recombinante: El día antes de la titulación, lavar las células Vero dos veces con PBS, trypsinize y preparar placas de 96 pocillos para llegar al 80 - 90% de confluencia día siguiente (4 x 10 ⁴ células / pocillo). Agite suavemente las placas con la mano para conseguir una distribución uniforme de las células. Cultura de las células, durante la noche, en el 37 ° C incubadora con 5% de CO _2. Compruebe las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa, antes de proceder con la infección:
   1. Diluir en serie (diluciones de 10 veces) que contiene el virus-TCS se recuperó de las células transfectadas en la placa de 100 mm (paso 1,10) en OptiMEM.
   2. Retire el medio de las células sembradas Vero, lavar dos veces con 50 l de 1x PBS, e infectar las células con 50 l del virus diluido en serie (paso 2.1). Infectar a las células durante 1,5 horas a 37 ° C y 5% de CO _2.
   3. Después de la infección, eliminar el inóculo del virus, añadir 100 ml de los medios de comunicación de infección / pocillo e incubar las células durante 16 - 18 h. Re-infección viral puede ocurrir después de 18 h de incubación, lo que podría dar lugar a una estimación de los títulos virales.
   4. En 16 - 18 horas después de la infección, eliminar el TCS de cada pocillo y fijar las células con formaldehído al 4% diluido en 1x PBS, durante 15 min a TA.
   5. A continuación, eliminar la solución de fijación y permeabilizar las células con 0,1% de Triton X-100 diluido en 1x PBS, durante 10 min a temperatura ambiente.
   6. Aspirar la solución de permeabilización, lavar las células 3 veces wiª 1x PBS.
   7. Bloquear las células con albúmina de suero bovino 2,5% (BSA) en 1x PBS (solución de bloqueo) durante 1 hora a TA. Alternativamente, las células pueden ser bloqueados durante la noche a 4 ° C y se continuó con la incubación del anticuerpo el día siguiente.
   8. Mientras tanto preparar el anticuerpo primario. Diluir los anticuerpos primarios # 1-específicos LCMV-y Candid en solución de bloqueo, y luego centrifugar la solución de anticuerpo / bloqueo durante 15 min a 3500 rpm. El anticuerpo monoclonal anti-LCMV NP clon del anticuerpo 1.1.3 (dilución 1:30) ¹⁶ y el anticuerpo anti-NP JUNV monoclonal SA02-BG12 de Recursos BEI (dilución 1:500) se puede utilizar para la detección de rLCMV y rCandid # 1 , respectivamente.
   9. Después de 1 hora de incubación, aspirar la solución de bloqueo y añadir 50 l de anticuerpo primario a las células e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
   10. En este momento, diluir el anticuerpo secundario en solución de bloqueo, y luego centrifugar el / solución de bloqueo de anticuerpos durante 15 min a 3500 rpm. El polide conejo anti-IgG de ratón FITC anticuerpo secundario clonal para la detección de anticuerpos monoclonales primarios se utilizó para obtener imágenes observadas en la Figura 5.
   11. Después de 1 hora de incubación, aspirar el anticuerpo primario, lavar 3 veces con 1 x PBS, y añadir el anticuerpo secundario durante 30 min a 37 ° C.
   12. Después de 30 min de incubación, aspirar el anticuerpo secundario y lavar 3 veces con 1 x PBS. Las células están ahora listos para ser observados mediante microscopía de fluorescencia para determinar tanto el éxito del rescate viral y titulación contando el foco formando unidades por ml (FFU / ml).
2. r3LCMV y r3Candid # 1 rescate viral: Puesto que estos virus expresan dos genes indicadores, su rescates puede ser monitoreada por microscopía de fluorescencia para detectar la expresión de GFP o expresión Gluc en TCS. Rescate puede ser también confirmado por la expresión de Gluc en TCS. Para valorar los virus trisegmented, seguimos los pasos 2.1 a 2.1.4, pero las células no necesitan be fija para determinar un rescate viral éxito debido a la expresión de GFP. La titulación del virus se determinó contando el FFU / ml. Para determinar rescate viral con éxito por la expresión Gluc, expresión Gluc de TCS se puede medir usando un kit de ensayo de Gluc (Biolux Gaussia kit de ensayo de luciferasa, New England Biolabs). Para ello:
   1. Pipetear 100 l de TCS en una placa de 96 pozos (placas de microtitulación de fondo plano, Fisher Scientific).
   2. Configure el luminómetro (LumiCount, Packard Biosciences).
   3. Añadir 50 - 100 l solución de ensayo Gluc (según lo recomendado por el fabricante) a cada muestra y medir la expresión del gen informador Gluc con el luminómetro. Como control negativo, se midió la expresión de Gluc el TCS de los virus de tipo salvaje células infectadas.

3. Paso de sobrenadantes de cultivo de tejidos

Rescate viral depende de las eficacias de transfección. Células Vero se ha demostradoa tener menores eficiencias de transfección que otras líneas de células ^14. Si los títulos de virus en el TCS son bajos, infectar células Vero frescas a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 (LCMV) o 0.1 (Candid # 1) durante 72 horas para amplificar el virus.

Resultados

Rescate exitoso de un arenavirus de tipo salvaje recombinante se confirmó por la presencia de antígenos virales mediante IFA (Figura 5). En el caso de los virus recombinantes trisegmented, rescate viral exitosa puede evaluarse mediante la observación de la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia (Figura 6A). Rescate exitoso será confirmado por la evaluación de la expresión Gluc (Figura 6B). Los resultados representativos que ilustran el rescate co...

Discusión

Generación de arenavirus recombinantes utilizando técnicas de genética inversa basadas en plásmidos ha convertido en un método ampliamente utilizado para la investigación de muchos aspectos diferentes de la biología arenavirus. Aquí se documenta una mejora fundamental en el sistema actual mediante la realización de arenavirus rescata en células Vero, lo que permite la generación potencial de las vacunas aprobadas por la FDA contra el arenavirus y vectores de vacunas contra otras enfermedades infecciosas.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.