Generazione di Arenavirus ricombinante per lo sviluppo del vaccino nel approvati dalla FDA cellule Vero

Riepilogo

Salvataggio di arenavirus ricombinanti da cDNA clonati, un approccio denominato invertire la genetica, permette ai ricercatori di indagare il ruolo di specifici prodotti genici virali, così come il contributo dei loro diversi domini e residui specifici, per diversi aspetti della biologia di arenavirus . Allo stesso modo, invertire tecniche di genetica in linee cellulari approvato dalla FDA (Vero) per lo sviluppo di vaccini fornisce nuove possibilità per la generazione di vaccini efficaci e sicuri per combattere arenavirus patogeni umani.

Abstract

Lo sviluppo e l'attuazione di arenavirus genetica inversa rappresenta un significativo passo avanti nel campo ⁴ arenavirus. L'uso di sistemi minigenome Arenavirus base di cellule insieme con la capacità di generare ricombinanti arenaviruses infettive con mutazioni predeterminate nei loro genomi ha facilitato l'indagine del contributo dei determinanti virali nelle diverse fasi del ciclo di vita arenavirus, così come virus-ospite interazioni e meccanismi di patogenesi arenavirus ^{1, 3, 11.} Inoltre, lo sviluppo di arenaviruses trisegmented ha permesso l'utilizzo del genoma arenavirus di esprimere ulteriori geni estranei di interesse, aprendo così la possibilità di applicazioni vettore di vaccino arenavirus basati ^5. Analogamente, lo sviluppo di ciclo unico arenaviruses infettivi capaci di esprimere geni reporter fornisce un nuovo strumento sperimentale per migliorare la sicurezza di ricerca che coinvolge highly patogeni arenavirus umani ^16. La generazione di arenavirus ricombinanti utilizzando tecniche di genetica inversa plasmide-based ha finora invocato l'uso di linee cellulari di roditori ^7,19, il che pone alcune barriere per lo sviluppo di Food and Drug Administration (FDA) con licenza vaccino o di vettori vaccinali. Per superare questo ostacolo, si descrive qui la generazione efficiente di arenavirus ricombinanti in cellule Vero approvato dalla FDA.

Introduzione

Arenavirus sono virus con involucro con bisegmented, negativo-stranded RNA del genoma ³ che appartengono alla famiglia Arenaviridae. Il genoma codifica arenavirus quattro proteine ​​in modo ambisense da due segmenti virali separati ^3. Il grande segmento (L) codifica per la RNA polimerasi RNA-dipendente (L) e il piccolo anello (davvero interessante nuovo gene) finger proteina (Z), che serve come il principale motore di virus in erba. Il piccolo (S) segmento codifica la nucleoproteina virale (NP) e la glicoproteina di superficie (GP) (Figura 1).

Diversi membri della famiglia Arenaviridae sono responsabili della febbre emorragica letale (HF) in esseri umani ^3. Di principio preoccupazioni sono virus Lassa (LASV) e virus Junin (JUNV), che sono noti per causare un'elevata mortalità nei pazienti ospedalizzati ^{8, 9.} Anche se questi virus sono endemiche in Africa occidentale e rurale Argentina, rispettivamente,vi sono preoccupazioni crescenti di importazione di LASV e JUNV ad aree non endemiche a causa di un aumento di viaggio ^10. Inoltre, anche se normalmente non associata a malattia grave nell'uomo, il arenavirus prototipo virus coriomeningite linfocitaria (LCMV) è considerato un agente patogeno trascurato in quanto non vi sono stati casi di infezione letale in pazienti immunocompromessi ^{6, 15} ed è responsabile per i difetti congeniti alla nascita e aborti spontanei in donne in gravidanza ^{2, 13.} Attualmente non ci sono US FDA ha approvato i vaccini contro arenavirus e il trattamento è limitato al nucleoside analogo ribavirina, che è solo parzialmente efficace e spesso associata a significativi effetti collaterali.

L'introduzione di inversione plasmide a base genetica ⁴ e la generazione di ricombinanti arenavirus ^{7, 19} hanno notevolmente migliorato il campo di ricerca arenavirus. Attualmente, cellule di roditore (come BHK-21) vengono utilizzati per la generzione di arenaviruses ricombinanti dovute alla specie-specifico murino RNA polimerasi I (pol-I) promotore dirigere la trascrizione iniziale della S e L segmenti. Tuttavia virus salvataggio in cellule BHK-21 non sono un metodo approvato per la generazione di ricombinanti arenavirus come potenziali candidati di semi vaccino. Qui documentiamo l'uso del umano pol-I promoter di soccorso efficiente del prototipo Vecchio Mondo (OW) LCMV e il Nuovo Mondo (NW) JUNV Candid # 1 ceppo di cellule Vero. Utilizzando una metodologia simile, abbiamo generato ricombinante trisegmented LCMV (r3LCMV) e Candid # 1 (r3Candid # 1) arenavirus che contengono due geni estranei aggiuntivi codificati in due diversi segmenti di RNA S ^5. Questo nuovo sistema segue non solo un protocollo altamente riproducibile e semplice ma può essere immediatamente attuata la generazione di arenaviruses ricombinanti come potenziale vaccino o semi vettore vaccino.

Protocollo

1. Arenavirus Rescue Transfezione

Il nostro sistema di salvataggio si basa sull'utilizzo di due polimerasi II proteiche plasmidi di espressione codificanti la nucleoproteina (NP) e RNA-dipendente-RNA-polimerasi (L), i fattori trans-agenti virali necessarie per la replicazione dell'RNA e l'espressione genica del genoma arenavirus ^{7, 19,} e plasmidi capaci di dirigere la sintesi intracellulare, attraverso l'RNA cellulare polimerasi I (pol-I), del S e L antigenome specie di RNA ^7. Nei nostri studi usiamo l'espressione proteica pCAGGS plasmide, che utilizza il pollo promotore β-actina e polyadenylanation (pA) sequenze di segnale, e il pol-I umana plasmide, che utilizza la polimerasi I umano promotore e sequenze di terminazione murini (Figura 2) . La L segmenti di RNA S e sono clonati nel plasmide HPOL-I in un orientamento antigenomic per consentire la generazione di segmenti di RNA genomici upon trascrizione da HPOL-I. Per il salvataggio di wild-type LCMV ricombinante (rLCMV) e Candid # 1 (rCandid # 1) la pCAGGS NP e L da ciascun virus sono state co-trasfettate con le rispettive L segmenti RNA (Figura 3) pol-I e S umana. Generazione di ricombinante trisegmented LCMV (r3LCMV) e Candid # 1 (r3Candid # 1) ha seguito un protocollo simile, ma il segmento S è stato diviso in due plasmidi pol-I S diversi, ognuno di codifica un gene distintivo giornalista: in una, la lettura NP aperto telaio (ORF) è stata sostituita con la proteina fluorescente verde (GFP) gene reporter (HPOL-I S GFP / GP) e, nell'altro, il precursore glicoproteina virale (GPC) ORF viene sostituita con la Gaussia luciferasi (Gluc) gene reporter (HPOL-I S NP / Gluc). Una rappresentazione schematica del protocollo è illustrato in Figura 4. Il seguente protocollo di trasfezione e l'infezione è stata stabilita per il 6-piastre a pozzetti.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) miscela: Preparare 250 ml di mezzi OptiMEM e, a secondasul salvataggio virus, 10 - 12 mg di LPF2000 (1 mg / mL) per trasfezione (Tabella 1). Si consiglia un rapporto di 2,5 mcg LPF2000 per mg di DNA. Incubare per 5 - 10 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare la miscela di trasfezione plasmide in una provetta da microcentrifuga (passo 1.2).
2. Plasmide miscela di trasfezione del DNA: Preparare il cocktail trasfezione plasmide in una provetta con le quantità raccomandate per ogni salvataggio virus (vedi Tabella 1). Portare il volume finale di 50 microlitri con OptiMEM.
3. OptiMEM-LPF2000-DNA plasmidico miscela: Aggiungere 250 microlitri della miscela OptiMEM-LPF2000 (passo 1.1) nel plasmide DNA miscela di trasfezione (passo 1.2). Incubare questa miscela per 20 - 30 min a TA. Nel frattempo preparare e contare 1 x 10 ⁶ cellule Vero per reazione trasfezione. Cellule Vero saranno transfettate in sospensione.
4. Preparazione delle cellule Vero: Vero celLS sono coltivate in 100 millimetri piatti. Prima di iniziare, portare l'PBS 1x, DMEM 10% FBS 1% PS media, e miscela di tripsina-EDTA a 37 ° C.
   1. Lavare le cellule due volte con 5 ml di PBS 1x.
   2. Trypsinize cellule con 1 ml di tripsina-EDTA e attendere cellule scollegamento (circa 5 min). Gentle intercettazioni forse necessario per distaccare completamente le cellule dai piatti.
   3. Attentamente, risospendere le cellule in 10 ml di DMEM 10% FBS 1% PS in una provetta da centrifuga da 15 ml.
   4. Centrifugare le cellule per 5 min a 1000 rpm in una centrifuga.
   5. Risospendere le cellule in 10 ml di DMEM 10% FBS 1% PS e contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule / ml. È stato osservato che 0,5-1 x 10 ⁶ cellule Vero per trasfezione prodotto i migliori risultati.
5. Mescolare LPF2000/DNA e cellule: dopo 20 - 30 minuti a temperatura ambiente di incubazione (passo 1.3), aggiungere 1 ml di cellule Vero (1 x 10 ⁶⁾ (passo 1,4) ala miscela plasmide OptiMEM-LPF2000-DNA e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
6. Seme LPF2000/DNA-cell mix in 6-piastre a pozzetti: Aggiungere la miscela di DNA-LPF2000-Vero (passo 1.5) nei pozzetti della piastra da 6 pozzetti. Agitare delicatamente il 6-ben piatto e lasciare che la trasfezione incubare una notte in termostato a 37 ° C e 5% di CO _2.
7. Cambia medie trasfezione: circa 16 - 24 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto di trasfezione, aggiungere 2 ml di mezzi di infezione e incubare cellule trasfettate per ulteriori 48 ore.
8. Passaggio Cell: Dopo 48 ore di incubazione nei media di infezione, rimuovere il supernatante di coltura tissutale (TCS) e passare le cellule trasfettate in un piatto di 100 mm. Il TCS raramente contiene virus infettivo, perché le cellule transfettate bisogno ulteriore incubazione per generare particelle virali. Per il passaggio delle cellule:
   1. Lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS 1x.
   2. Trypsinize cellule w esimo 0,5 ml di tripsina-EDTA e attendere che le cellule si staccano.
   3. Risospendere le cellule in 1 ml di DMEM 10% FBS 1% PS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
   4. Centrifugare le cellule per 5 min a 5000 rpm, a 4 ° C in una microcentrifuga.
   5. Risospendere delicatamente le cellule in 1 ml di mezzo di infezione e trasferire le cellule a un piatto di 100 mm. Portare il volume totale nella piastra, con mezzi infettive, 8 ml, un volume sufficiente per evitare l'essiccazione delle cellule così come per concentrare il virus.
9. Agitare delicatamente il piatto 100 mm e continuare l'incubazione di cellule Vero in incubatore a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 72 ore.
10. Collezione del TCS: Dopo 72 ore di incubazione, raccogliere il TCS in una provetta da centrifuga da 15 ml. Rimuovere detriti cellulari mediante centrifugazione per 5 min a 2500 rpm in una centrifuga. Arenavirus infettiva è trovato nella TCS, quindi rimuovere dalla cella detriti pellet e memorizzare il TCS a -80 ° C.

Le "> 2. Conferma della ricombinante Arenavirus Rescue

Rilevamento di un salvataggio di successo di rLCMV e rCandid # 1 è ottenuta tramite una unità di formazione di messa a fuoco (FFU) immunofluorescenza saggio (IFA). Per tipo selvatico rescue virus usiamo anticorpi specifici per NP virale. Il r3LCMV e r3Candid # 1 encode due geni reporter (GFP e Gluc), permettendo così di rilevamento virale e titolazione senza la necessità di anticorpi mediante microscopia a fluorescenza (GFP) e / o luminescenza (Gluc).

1. Confermare la wild-type arenavirus salvataggio ricombinante: Il giorno prima della titolazione, lavare le cellule Vero due volte con PBS, trypsinize e preparare piastre da 96 pozzetti per raggiungere l'80 - 90% confluenza giorno successivo (4 x 10 ⁴ cellule / pozzetto). Scuotere piano le piastre a mano per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule. Cultura delle cellule, durante la notte, nel 37 ° C incubatore con il 5% di CO _2. Controllare le cellule sotto il microscopio per confermare un monostrato, prima di procedere con l'infezione:
   1. Diluire serialmente (10 diluizioni) contenente il virus-TCS recuperato dalle cellule trasfettate nel piatto 100 mm (passo 1.10) in OptiMEM.
   2. Rimuovere i supporti dalle cellule Vero teste di serie, lavare due volte con 50 ml di PBS 1x, e infettare le cellule con 50 ml di virus diluito in serie (passo 2,1). Infettare le cellule per 1,5 ore a 37 ° C e 5% di CO _2.
   3. Dopo l'infezione, rimuovere l'inoculo del virus, aggiungere 100 ml di supporti infezione / pozzetto ed incubare le cellule per 16 - 18 hr. Viral re-infezione può verificarsi dopo 18 ore di incubazione, che potrebbe comportare sovrastima dei titoli virali.
   4. A 16 - 18 ore post-infezione, rimuovere il TCS da ciascun pozzetto e fissare le cellule con formaldeide al 4% diluito in PBS 1x, per 15 minuti a RT.
   5. Poi, rimuovere la soluzione di fissaggio e permeabilize le cellule con 0,1% Triton X-100 diluito in PBS 1x, per 10 min a temperatura ambiente.
   6. Aspirare la soluzione di permeabilizzazione, poi lavare le cellule 3 volte wiesimo 1x PBS.
   7. Bloccare le cellule con 2,5% di albumina di siero bovino (BSA) in 1x PBS (soluzione bloccante) per 1 ora a RT. In alternativa, le cellule possono essere bloccati notte a 4 ° C e l'incubazione proseguita con anticorpo il giorno seguente.
   8. Nel frattempo preparare l'anticorpo primario. Diluire gli anticorpi primari # 1-specifici LCMV-e Candid in soluzione di blocco, e quindi centrifugare l'anticorpo / soluzione di blocco per 15 min a 3.500 giri al minuto. L'anti-NP LCMV clone anticorpo monoclonale 1.1.3 (diluizione 1:30) ¹⁶ e l'anticorpo monoclonale anti-anticorpo JUNV NP-SA02 BG12 con BEI Risorse (diluizione 1:500) può essere utilizzato per la rivelazione di rLCMV e rCandid # 1 , rispettivamente.
   9. Dopo 1 ora di incubazione, aspirare la soluzione di saturazione e aggiungere 50 microlitri di anticorpo primario alle cellule e incubare per 1 ora a 37 ° C.
   10. In questo momento, diluire l'anticorpo secondario in una soluzione bloccante, quindi si centrifuga il / soluzione di anticorpo bloccante per 15 min a 3500 rpm. Il policlonale coniglio anti-topo IgG FITC anticorpo secondario per la rivelazione di anticorpi monoclonali primari è stato usato per ottenere immagini osservate in figura 5.
   11. Dopo 1 h di incubazione, aspirare l'anticorpo primario, lavare 3 volte con PBS 1x, e aggiungere l'anticorpo secondario per 30 min a 37 ° C.
   12. Dopo 30 minuti di incubazione, aspirare l'anticorpo secondario e lavare 3 volte con PBS 1x. Le cellule sono ora pronti per essere osservato mediante microscopia a fluorescenza sia determinare il successo di salvataggio titolazione virale e contando il fuoco formando unità per ml (FFU / ml).
2. r3LCMV e r3Candid # 1 di salvataggio virale: Dal momento che questi virus esprimono due geni reporter, il loro salvataggi possono essere monitorati mediante microscopia a fluorescenza per rilevare l'espressione della GFP o espressione Gluc in TCS. Rescue può essere confermata anche dalla espressione di Gluc in TCS. Per titolare i virus trisegmented, seguiamo passi da 2.1 a 2.1.4, ma le cellule non hanno bisogno di be fissato per determinare un salvataggio virale di successo a causa di espressione GFP. La titolazione del virus sarà determinata contando il FFU / ml. Per determinare il salvataggio di successo virale di espressione Gluc, espressione Gluc dal TCS può essere misurata con un kit di test Gluc (Biolux Gaussia kit Assay luciferasi, New England Biolabs). A tal fine:
   1. Dispensare 100 ul di TCS in una piastra a 96 pozzetti bianco (micropiastre fondo piatto, Fisher Scientific).
   2. Impostare il luminometro (LumiCount, Packard Biosciences).
   3. Aggiungere 50 - 100 microlitri soluzione Assay Gluc (come consigliato dal produttore) per ogni campione e misurare la Gluc espressione del gene reporter con il luminometro. Come controllo negativo, è stata misurata l'espressione Gluc del TCS dai virus wild-type cellule infettate.

3. Passaggio del tessuto surnatanti di coltura

Salvataggio virale dipende l'efficienza di trasfezione. Cellule Vero sono state indicateavere efficienze di trasfezione inferiori rispetto altre linee cellulari ^14. Se titoli di virus nel TCS sono bassi, infettare cellule Vero fresche in una molteplicità di infezione (MOI) di 0,01 (LCMV) o 0,1 (Candid # 1) per 72 ore per amplificare il virus.

Risultati

Salvataggio di successo di un ricombinante arenavirus wild-type sarà confermata dalla presenza di antigeni virali mediante IFA (Figura 5). Nel caso dei virus ricombinanti trisegmented, salvataggio di successo virale può essere valutata osservando espressione GFP mediante microscopia a fluorescenza (Figura 6A). Salvataggio di successo sarà ulteriormente confermato dalla valutazione dell'espressione Gluc (Figura 6B). Rappresentante risultati illustrano il salvatagg...

Discussione

Generazione di arenavirus ricombinanti utilizzando tecniche di genetica inversa plasmide-based è diventata un metodo ampiamente utilizzato per lo studio di molti e diversi aspetti della biologia arenavirus. Qui documentiamo un miglioramento fondamentale per l'attuale sistema eseguendo arenavirus salvataggi su cellule Vero, consentendo la potenziale generazione di candidati vaccini approvati dalla FDA contro arenavirus e vettori di vaccini contro altre malattie infettive.

Le procedure sp...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.