Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero

Resumo

Resgate de arenavírus recombinantes a partir de ADNc clonados, uma abordagem designada por genética reversa, permite aos investigadores para investigar o papel dos produtos de genes virais específicos, bem como a contribuição dos seus vários domínios e resíduos específicos, de diferentes aspectos da biologia do arenavírus . Da mesma forma, inverter técnicas de genética em linhas de células aprovadas pela FDA (Vero) para o desenvolvimento da vacina proporciona novas possibilidades para a produção de vacinas eficazes e seguras para combater arenavírus patogénicos humanos.

Resumo

O desenvolvimento e implementação de arenavírus reversa genética representa um avanço significativo no campo ⁴ arenavírus. A utilização de sistemas de arenavírus minigenome baseados em células, juntamente com a capacidade de gerar arenavírus infecciosos recombinantes com mutações predeterminadas nos seus genomas facilitou a investigação da contribuição dos determinantes virais para as diferentes etapas do ciclo de vida arenavírus, bem como vírus-hospedeiro interacções e mecanismos de patogénese arenavírus ^{1, 3, 11.} Além disso, o desenvolvimento de arenavírus trisegmented tem permitido a utilização do genoma arenavírus para expressar genes estranhos adicionais de interesse, criando assim a possibilidade de uma aplicação vector de vacina à base de arenavírus ^5. Do mesmo modo, o desenvolvimento de arenavírus infecciosas único ciclo capaz de expressar genes repórter proporciona uma nova ferramenta experimental para melhorar a segurança de pesquisa envolvendo highly patogênicos arenavírus humanos ^16. A geração de arenavírus recombinantes utilizando técnicas de genética reversa baseados em plasmídeo, até agora contou com a utilização de linhas de células de roedores ^7,19, o que coloca algumas barreiras para o desenvolvimento da Food and Drug Administration (FDA) licenciado vacina ou vetores vacinais. Para superar esse obstáculo, descrevemos aqui a geração eficiente de arenavírus recombinantes em células Vero FDA-aprovados.

Introdução

Arenavírus são vírus com envelope com um bisegmented, genoma de RNA de cadeia negativa ^3, que pertencem à família Arenaviridae. O genoma arenavírus codifica quatro proteínas de maneira AMBISENSE a partir de dois segmentos virais independentes ^3. O segmento de grande (L) codifica a RNA polimerase dependente de RNA (L) eo pequeno anel (Really Interesting New Gene) proteína dedo (Z), que serve como a principal força motriz do vírus da brotação. O segmento pequeno (S) codifica a nucleoproteína viral (NP) e da glicoproteína de superfície (GP) (Figura 1).

Vários membros da família Arenaviridae são responsáveis ​​pela febre hemorrágica letal (HF) ³ em seres humanos. Das preocupações principais são vírus de Lassa (LASV) e vírus Junín (JUNV), que são conhecidos por causar alta mortalidade em pacientes hospitalizados, ^{8, 9.} Embora esses vírus são endêmicos para a África Ocidental e rural Argentina, respectivamente,há preocupações crescentes de importação de LASV e JUNV para áreas não endêmicas, devido ao aumento de viagem para ^10. Além disso, embora não seja normalmente associada com doença grave em humanos, o arenavírus protótipo vírus choriomeningitis linfocítica (LCMV) é considerado um patógeno negligenciado como tem havido casos de infecção letal em pacientes imunocomprometidos, ^{6, 15} e é responsável por defeitos congênitos e abortos espontâneos em mulheres grávidas, ^{2, 13.} Actualmente não há EUA aprovados pela FDA vacinas contra arenavírus e tratamento é limitada ao nucleósido análogo ribavirina, que é apenas parcialmente eficaz e, muitas vezes associada com efeitos colaterais significativos.

A introdução de reverse-base plasmídeo genética ⁴ e geração de arenavírus recombinantes ^{7, 19} têm avançado muito no campo da pesquisa arenavírus. Actualmente, as células de roedores (tais como BHK-21) são utilizados para o Generção de arenavírus recombinantes devido à específica da espécie murina RNA polimerase I (pol-I) promotora dirigir a transcrição inicial dos segmentos L e S. No entanto salvamento vírus em células BHK-21 não são um método aprovado para a geração de arenavírus recombinantes como vacinas candidatas potenciais de sementes. Aqui vamos documentar o uso do ser humano pol-I promotor de resgate eficiente do Velho Mundo protótipo (OW) LCMV eo Novo Mundo (NW) JUNV Candid º 1 tensão em células Vero. Utilizando uma metodologia similar, geramos LCMV recombinante trisegmented (r3LCMV) e Candid # 1 (r3Candid # 1) arenavírus que contêm dois genes estranhos adicionais codificados em dois segmentos de RNA é diferente ^5. Este novo sistema não só segue um protocolo altamente reprodutível e simples, mas pode ser imediatamente implementado na geração de arenavírus recombinantes como vacinas potenciais ou sementes vector de vacina.

Protocolo

1. Arenavirus Resgate transfecção

O nosso sistema de resgate foi baseado na utilização de ambas as proteínas II plasmídeos de expressão que codificam a polimerase de nucleoproteína (NP) e dependente de ARN-ARN-polimerase (L), os factores que actuam em trans necessárias para a replicação viral de ARN e a expressão do gene do genoma arenavírus ^{7, 19,} e os plasmídeos, capazes de dirigir a síntese intracelular, via celular espécies de ARN antigenoma G RNA polimerase I (pol-I), de S e ^7. Nos nossos estudos que utilizam a expressão de proteínas do plasmídeo pCAGGS, que utiliza o promotor de frango β-actina e as sequências de sinal polyadenylanation (PA), e o pol-I humana do plasmídeo, o qual utiliza o promotor da polimerase I humana e sequências de terminação de murino (Figura 2) . Os segmentos de ARN L S e são clonados no plasmídeo HPOL-I numa orientação antigenomic para permitir a geração de segmentos de RNA genómicas após a transcrição por HPOL-I. Para o resgate de wild-tyep recombinante LCMV (rLCMV) e Espontânea # 1 (rCandid # 1) o pCAGGS NP e L a partir de cada um dos vírus, foram co-transfectados juntamente com o seu respectivo segmentos de ARN L (Figura 3) Pol-I humana e S. Geração de LCMV recombinante trisegmented (r3LCMV) e Espontânea # 1 (r3Candid # 1) seguido de um protocolo similar, mas o segmento S foi dividido em dois plasmídeos diferentes de pol I-S, cada um codificando um gene repórter diferente: em um, a leitura aberta NP armação (ORF) foi substituído com o (GFP), gene repórter Proteína Fluorescente Verde (HPOL-GFP I S / GP) e, no outro, o precursor da glicoproteína virai (GPC) ORF é substituído com o Gaussia luciferase (Glic) gene repórter (HPOL-I S NP / Gluc). Uma representação esquemática do protocolo é ilustrada na Figura 4. Foi estabelecido o seguinte protocolo de transfecção e infecção por 6-well-placas.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mistura: Preparar 250 mL de mídia OptiMEM e, dependendosobre o vírus de resgate, 10 - 12 ug de LPF2000 (1 ug / ul) por transfecção (Tabela 1). Recomenda-se uma razão de 2,5 ug LPF2000 por ug de ADN. Incubar durante 5 - 10 min à temperatura ambiente. Entretanto, prepara-se a mistura de transfecção do plasmídeo num tubo de microcentrífuga separados (passo 1.2.)
2. Mistura de transfecção de ADN de plasmídeo: Preparar o cocktail de transfecção do plasmídeo num tubo de microcentrífuga utilizando as quantidades recomendadas para cada vírus de resgate (ver Tabela 1). Levar o volume final de 50 ul com OptiMEM.
3. OptiMEM-LPF2000-mistura de plasmídeo de DNA: Adicionar 250 ul da mistura-LPF2000 OptiMEM (passo 1.1) para a mistura de transfecção de ADN do plasmídeo (passo 1.2.) Incubar a mistura por mais 20 - 30 min a RT. Enquanto isso, prepare e conte 1 x 10 ⁶ células Vero por reação transfecção. Células Vero serão transfectados em suspensão.
4. Preparação de células Vero: Vero cells são cultivadas em placas de 100 mm. Antes de começar, trazer o PBS 1x, DMEM FBS a 10% 1% Meios PS e mistura de tripsina-EDTA a 37 ° C.
   1. Lavar as células, duas vezes, com 5 ml de PBS 1x.
   2. Tripsinizar as células com 1 ml de tripsina-EDTA e esperar até que as células de separar (aproximadamente 5 min). Suave escutas talvez necessária para separar completamente as células dos pratos.
   3. Cuidadosamente, ressuspender as células em 10 ml de meio DMEM 10% FBS a 1%, PS, em um tubo de centrífuga de 15 ml.
   4. Centrifugar as células durante 5 min a 1000 rpm numa centrífuga.
   5. Ressuspender as células em 10 ml de meio DMEM FBS a 10% 1% de PS e contar as células utilizando um hemocitómetro e ajuste a concentração de 1 x 10 ⁶ células / ml. Foi observado que a 0,5-1 x 10 ⁶ por transfecção de células Vero produziram os melhores resultados.
5. Misturar LPF2000/DNA e células: após 20 - 30 minutos de incubação a temperatura ambiente (passo 1.3), adicionar 1 ml de células Vero (1 x 10 ⁶⁾ (passo 1.4) paraa mistura do plasmídeo OptiMEM-LPF2000-DNA e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
6. Semente LPF2000/DNA-cell mistura em 6 poços placas: Adicionar a mistura de ADN-LPF2000-Vero (passo 1.5) para os poços da placa de 6 poços. Agitar suavemente o-bem-placa 6 e deixar a incubar durante a noite a transfecção na incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
7. Alterar meio de transfecção: Aproximadamente 16 - 24 horas após a transfecção, remova a mídia de transfecção, adicionar 2 ml de mídia infecção e incubar células transfectadas para um adicional de 48 horas.
8. Passagem celular: Após 48 horas de incubação em meio de infecção, remover o tecido de cultura sobrenadante (TCS) e passar as células transf ectadas em um prato de 100 mm. O TCS raramente contém o vírus infeccioso, porque as células transfectadas precisa de incubação adicional para gerar partículas de virus. Para a passagem de células:
   1. Lavar as células, duas vezes, com 2 ml de PBS 1x.
   2. Trypsinize células w om 0,5 ml de tripsina-EDTA e esperar até que as células separar.
   3. Ressuspender as células em 1 ml de meio DMEM 10% FBS a 1%, PS, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   4. Centrifugar as células durante 5 min a 5000 rpm, 4 ° C, numa microcentrifugadora.
   5. Ressuspender cuidadosamente as células em 1 ml de meio de infecção e transferência das células para um prato de 100 mm. Levar o volume total da placa, com meios infecciosas, a 8 ml, um volume suficiente para evitar a secagem das células, bem como para a concentração do vírus.
9. Agitar suavemente o prato de 100 mm e continuar a incubação de células Vero na incubadora a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 72 horas.
10. Colecção de SCT: Após 72 horas de incubação, recolher o TCS em um tubo de centrífuga de 15 ml. Remover os detritos celulares por centrifugação durante 5 min a 2500 rpm numa centrífuga. Arenavírus infecciosa é encontrado na TCS, para remover detritos da célula sedimento e guardar o TCS a -80 ° C.

le "> 2. Confirmação de Resgate Arenavirus recombinante

A detecção de um resgate bem sucedido de rLCMV e rCandid º 1 é obtida através de um formando unidade de foco (UFF) imunofluorescência indireta (IFA). Para o tipo selvagem de vírus de resgate que utilize anticorpos específicos para o NP viral. O r3LCMV e r3Candid # 1 codificar dois genes repórter (GFP e Glic), permitindo assim a detecção de vírus e sem a necessidade de titulação de anticorpos por meio de microscopia de fluorescência (BPA) e / ou luminescência (Glic).

1. Confirmar de tipo selvagem salvamento arenavírus recombinante: Um dia antes da titulação, as células Vero lavar duas vezes com PBS, e trypsinize preparar placas de 96 poços para atingir 80 - 90% de confluência no dia seguinte (4 x ⁴ 10 células / poço). Agite as placas com as mãos para obter uma distribuição uniforme das células. Cultura das células, durante a noite, no 37 ° C incubadora com 5% de CO _2. Verifique as células ao microscópio para confirmar a monocamada, antes de prosseguir com a infecção:
   1. Diluir em série (10 diluições duplas), contendo o vírus TCS recuperado a partir das células transfectadas no prato de 100 mm (passo 1.10) em OptiMEM.
   2. Remover os suportes das células Vero semeadas, lavar duas vezes com 50 ul de PBS 1x, e infectar as células com 50 ul de vírus diluído em série (passo 2.1.) Infect células durante 1,5 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.
   3. Após a infecção, remover o inoculo de vírus, adicionar 100 mL de meio de infecção / poço e incubar as células durante 16 - 18 h. Viral re-infecção pode ocorrer após 18 horas de incubação, o que pode resultar em excesso de estimativa dos títulos virais.
   4. Em 16-18 horas pós-infecção, remover a TCS a partir de cada poço e fixar as células com formaldeído a 4% diluído em PBS 1x, durante 15 min à TA.
   5. Em seguida, remover a solução de fixação e permeabilizar as células com 0,1% de triton X-100 diluído em PBS 1x, durante 10 min à temperatura ambiente.
   6. Aspirar a solução de permeabilização, em seguida, lave as células três vezes wipo PBS 1x.
   7. Bloquear as células com soro de albumina bovina 2,5% (BSA) em 1x PBS (solução de bloqueio) durante 1 hora à temperatura ambiente. Alternativamente, as células podem ser bloqueadas durante a noite a 4 ° C e continuou a incubação com o anticorpo, no dia seguinte.
   8. Enquanto isso preparar o anticorpo primário. Dilui-se os anticorpos primários como 1 específicos do LCMV-Espontânea e em solução de bloqueio, e em seguida, centrifuga o anticorpo / solução de bloqueio durante 15 minutos a 3500 rpm. O anti-NP LCMV clone de anticorpo monoclonal 1.1.3 (diluição 1:30) ¹⁶ NP e o anticorpo monoclonal anti-JUNV SA02-BG12 de BEI Recursos (diluição 1:500) podem ser utilizados para a detecção de rLCMV e rCandid # 1 , respectivamente.
   9. Após 1 hora de incubação, aspirar a solução de bloqueio e adicionar 50 ul do anticorpo primário às células e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
   10. Neste momento, dilui-se o anticorpo secundário em solução de bloqueio, e depois centrifugar a / solução de bloqueio de anticorpos durante 15 min a 3500 rpm. O polide coelho anti-IgG de ratinho FITC anticorpo secundário clonal para a detecção de anticorpos monoclonais primários foram utilizados para obter as imagens observadas na Figura 5.
   11. Após 1 hora de incubação, aspirar o anticorpo primário, lavar 3 vezes com PBS 1x, e adicionar o segundo anticorpo, durante 30 min a 37 ° C.
   12. Após 30 min de incubação, aspirar o anticorpo secundário e lavar 3 vezes com PBS 1x. As células são agora pronto para ser observada usando microscopia de fluorescência para determinar tanto o sucesso do salvamento a titulação viral e por contagem do foco formando unidades por ml (UFF / mL).
2. r3LCMV e r3Candid # 1 resgate viral: Uma vez que estes vírus expressam dois genes repórter, a sua salva pode ser monitorizada por microscopia de fluorescência para detectar a expressão da GFP ou expressão Gluc na TCS. Resgate também pode ser confirmado pela expressão de Gluc na TCS. Para a titulação de vírus trisegmented, seguimos os passos 2.1 a 2.1.4, no entanto as células não precisam de be corrigido para determinar um resgate viral bem sucedida por causa da expressão GFP. A titulação do vírus vai ser determinada pela contagem do UFF / mL. Para determinar o resgate viral bem sucedida por expressão Gluc, a expressão a partir de Glic TCS pode ser medida utilizando um kit de ensaio Gluc (Biolux kit de ensaio de luciferase Gaussia, New England Biolabs). Para esse efeito:
   1. Pipetar 100 l de TCS em uma placa de 96 poços branca (placas de microtitulação de fundo plano, Fisher Scientific).
   2. Configure o luminometer (LumiCount, Packard Biosciences).
   3. Adicionar 50-100 ul de solução de ensaio Gluc (como recomendado pelo fabricante) a cada amostra e medir a expressão do gene repórter com o Glic luminómetro. Como controlo negativo, foi medida a expressão de Glic TCS a partir dos vírus do tipo selvagem, células infectadas.

3. A passagem de sobrenadantes de cultura de tecidos

Resgate viral depende da eficiência de transfecção. As células Vero foram mostradoster eficiências de transfecção mais baixos do que outras linhas de células ^14. Se os títulos de vírus no TCS são baixos, infectar as células frescas Vero a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 (LCMV) ou 0,1 (Espontânea # 1) durante 72 horas para amplificar o vírus.

Resultados

Salvamento bem sucedido de um arenavírus do tipo selvagem recombinante será confirmada pela presença de antigénios do vírus utilizando IFA (Figura 5). No caso de vírus recombinantes trisegmented, resgate viral bem sucedida pode ser avaliada através da observação se expressão da GFP por microscopia de fluorescência (Figura 6A). Salvamento bem sucedido irá ser ainda confirmada por avaliar a expressão Gluc (Figura 6B). Os resultados representativos que ilustra...

Discussão

Geração de arenavírus recombinantes utilizando técnicas de genética reversa baseados plasmídeo tornou-se uma abordagem amplamente utilizado para a investigação de muitas facetas diferentes de biologia arenavírus. Aqui nós documentar uma melhoria crucial para o atual sistema através da realização de arenavírus resgata em células Vero, permitindo o potencial de geração de vacinas candidatas aprovadas pela FDA contra arenavírus e vetores de vacinas contra outras doenças infecciosas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.