דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

Summary

הצלת Arenaviruses רקומביננטי מcDNAs המשובטים, גישה המכונה להפוך גנטיקה, מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקיד של מוצרים גנטיים נגיפיים ספציפיים, כמו גם את תרומתו של תחומים ושאריות הספציפיים השונים שלהם, להיבטים רבים ושונים של הביולוגיה של arenavirus . כמו כן, להפוך טכניקות גנטיקה בשורות תאי ה-FDA (Vero) לפיתוח חיסון מספק אפשרויות חדשות לייצור חיסונים יעילים ובטוחים כדי להילחם Arenaviruses פתוגניים אדם.

Abstract

הפיתוח והיישום של arenavirus ההפוכה גנטיקה מהווה פריצת דרך משמעותית בתחום arenavirus ^4. השימוש במערכות minigenome arenavirus מבוססי תאים יחד עם היכולת ליצור רקומביננטי Arenaviruses זיהומיות עם מוטציות שנקבעו מראש בגנום שלהם יש להקל את החקירה של התרומה של גורמים ויראליים לשלבים של מחזור החיים arenavirus השונים, כמו גם מארח וירוס אינטראקציות ומנגנוני פתוגנזה arenavirus ^{1, 3, 11.} בנוסף, הפיתוח של Arenaviruses trisegmented התיר את השימוש בגנום arenavirus להביע גנים זרים נוספים של ריבית, ובכך פתח את האפשרות של יישומי וקטור חיסון מבוסס arenavirus ^5. כמו כן, ההתפתחות יחידה במחזור Arenaviruses זיהומיות המסוגלים גני כתב מבטאים מספקת כלי ניסיוני חדש כדי לשפר את הבטיחות של מחקר מעורבת highly Arenaviruses אדם פתוגניים ^16. הדור של Arenaviruses רקומביננטי באמצעות טכניקות גנטיקה הפוכות מבוססות פלסמיד הסתמך עד כה על השימוש בשורות תאי מכרסמים ^7,19, אשר מהווה חלק ממחסומים לפיתוח של מזון והתרופות האמריקאי (FDA) ברישיון חיסון או וקטורי חיסון. כדי להתגבר על מכשול זה, אנו מתארים כאן הדור יעיל של Arenaviruses רקומביננטי בתאי Vero-FDA.

Introduction

Arenaviruses הם וירוסים אפפו עם bisegmented, הגנום RNA שלילי תקוע ³ ששייכים למשפחת Arenaviridae. הגנום מקודד arenavirus ארבעה חלבונים באופן ambisense משני מגזרים נגיפיים נפרדים ^3. הקטע הגדול (L) מקודד RNA פולימראז RNA התלוי (L) וטבעת הקטנה (ניו ג'ין ממש מעניינת) חלבון אצבע (Z) המשמשת ככוח המניע העיקרי של נגיף ניצנים. הקטע הקטן (S) מקודד nucleoprotein הנגיפי (NP) והמשטח גליקופרוטאין (GP) (איור 1).

כמה מחברי משפחת Arenaviridae אחראים לקדחת מדממת קטלנית (HF) בבני אדם ^3. חששות עיקריים הוא לסה וירוס (LASV) וJunín וירוס (JUNV), אשר ידועים כגורמי תמותה גבוהה בחולים מאושפזים ^{8, 9.} למרות שהווירוסים האלה הם אנדמיים למערב אפריקה וארגנטינה הכפרית, בהתאמה,יש חששות גוברים של יבוא LASV וJUNV לאזורים שאינם אנדמיים עקב נסיעות עלו ^10. בנוסף, למרות שבדרך כלל לא קשור למחלה קשה בבני אדם, arenavirus prototypic וירוס choriomeningitis ימפוציטית (LCMV) נחשב הפתוגן מוזנח כמו שיש כבר מקרים של זיהום קטלני בחולי מדוכאי חיסון ^{6, 15} והוא אחראי למומים מולדים מולדים והפלות ספונטניות בנשים בהריון ^{2, 13.} כרגע אין בארה"ב ה-FDA חיסונים נגד Arenaviruses וטיפול מוגבלים לnucleoside האנלוגי ribavirin, וזה רק יעיל באופן חלקי, ולעתים קרובות קשורות לתופעות לוואי משמעותיות.

כניסתה של הפוך מבוסס פלסמיד גנטיקה ⁴ ודור של Arenaviruses רקומביננטי ^{7, 19} שהתקדמה מאוד בתחום מחקר arenavirus. נכון לעכשיו, תאי מכרסמים (כגון BHK-21) המשמשים לgenerזמני של Arenaviruses רקומביננטי בשל פולימראז העכברי RNA אני מינים הספציפיים (Pol-I) אמרגן בימוי התעתיק הראשוני של ה-S ומגזרי L. עם זאת הצלת וירוס בתאי BHK-21 הן לא שיטה שאושרה לדור של Arenaviruses רקומביננטי כמועמדי זרעי חיסון פוטנציאליים. כאן אנו לתעד את השימוש בPol-האמרגן האנושי להצלה יעילה של העולם הישן prototypic (OW) LCMV והעולם החדש (NW) מתח # 1 פספוסים JUNV בתאי Vero. שימוש במתודולוגיה דומה, אנחנו שנוצרנו רקומביננטי LCMV trisegmented (r3LCMV) ופספוסי # 1 (r3Candid # 1) Arenaviruses המכילים שני גנים המקודדים זרים נוספים בשני קטעי RNA S שונים ^5. מערכת חדשה זו מתבקשת לא רק פרוטוקול לשעתק ופשוט מאוד אבל יכולה להיות מיושמת באופן מיידי בדור של Arenaviruses רקומביננטי כחיסון פוטנציאלי או זרעי וקטור חיסון.

Protocol

1. Transfection הצלת Arenavirus

מערכת ההצלה שלנו הייתה מבוססת על השימוש בשני פלסמידים ביטוי חלבון פולימראז II קידוד nucleoprotein (NP) ו-RNA תלוי-RNA-פולימראז (L), גורמי טרנס הפועל הנגיפיים הנדרשים לשכפול RNA וביטוי גנים של הגנום arenavirus ^{7, 19,} ופלסמידים שמסוגלים לכוון סינתזה תאית, באמצעות RNA פולימראז אני הסלולרי (Pol-I), של ה-S ומיני L antigenome RNA ^7. במחקרים שלנו אנו משתמשים בביטוי חלבון pCAGGS פלסמיד, אשר משתמש אמרגן β-אקטין העוף ו( PA) רצפי אותות polyadenylanation, וPol-אני אדם פלסמיד, אשר עושה שימוש בפולימראז האנושי אמרגן ורצפי שליחות קטלני עכבריים (איור 2) . S וקטעי RNA L הם משובטים לתוך hpol-פלסמיד בנטיית antigenomic כדי לאפשר לדור של מקטעי RNA הגנומי על ידי שעתוק hpol-I. להצלת פרועה טייPE רקומביננטי LCMV (rLCMV) ופספוסי # 1 (rCandid # 1) NP pCAGGS וL מוירוס היו שיתוף transfected יחד עם Pol-אני בהתאמה האנושי S וקטעי RNA L (איור 3). הדור של רקומביננטי LCMV trisegmented (r3LCMV) ופספוסי # 1 (r3Candid # 1) ואחריו פרוטוקול דומה אבל קטע S פוצל לשני פלסמידים S-Pol אני שונים, שכל אחד קידוד גן כתב ייחודי: באחד, קריאת NP הפתוחה מסגרת (ORF) הוחלפה (GFP) גן ירוק חלבון פלואורסצנטי כתב (hpol-S אני GFP / רופא משפחה), ובשני, מבשר גליקופרוטאין הנגיפי (GPC) ORF מוחלף לוציפראז Gaussia (Gluc) גן הכתב (Hpol-S אני NP / Gluc). ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מתואר באיור 4. Transfection הבאה ופרוטוקול זיהום כבר נקבעו ל6 גם צלחות.

1. תערובת OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000): הכן 250 μl של תקשורת OptiMEM ו, בהתאםעל הצלת הווירוס, 10 - 12 מיקרוגרם של LPF2000 (1 מיקרוגרם / μl) לכל transfection (טבלת 1). יחס של 2.5 מיקרוגרם לLPF2000 מיקרוגרם של ה-DNA הוא מומלץ. דגירה של 5 - 10 דקות ב RT. בינתיים מכין את תערובת transfection פלסמיד בצינור microcentrifuge נפרד (שלב 1.2).
2. תערובת transfection פלסמיד דנ"א: להכין את קוקטייל transfection פלסמיד בצינור microcentrifuge שימוש בכמויות המומלצות לכל הצלת וירוס (ראה טבלה 1). להביא את הנפח הסופי ל -50 μl עם OptiMEM.
3. תערובת פלסמיד OptiMEM-LPF2000-DNA: הוסף 250 μl של התערובת-LPF2000 OptiMEM (שלב 1.1) לתוך תערובת transfection פלסמיד דנ"א (שלב 1.2). דגירה את התערובת למשך 20 - 30 דקות ב RT. בינתיים להכין ולספור 1 x 10 ⁶ תאי Vero לתגובת transfection. תאי Vero יהיה transfected בהשעיה.
4. הכנת תאי Vero: Vero celLS בתרבית 100 מ"מ צלחות. לפני שמתחיל, תביא PBS 1X, DMEM 10% FBS PS 1% תקשורת, ותערובת טריפסין-EDTA עד 37 ° C.
   1. שטוף תאים, פעמיים, עם 5 מ"ל של 1x PBS.
   2. Trypsinize תאים עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA ולחכות עד שתאים לניתק (כ -5 דקות). עדין הקשה אולי נדרש לנתק לחלוטין את התאים מאת הכלים.
   3. זהירות, resuspend התאים 10 מ"ל של DMEM 10% FBS PS 1% בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
   4. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 1000 סל"ד בצנטריפוגה.
   5. Resuspend התאים 10 מ"ל של DMEM 10% FBS PS 1% ולספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהתאים את הריכוז ל1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. זה היה ציין כי 0.5 - 1 x 10 ⁶ תאי Vero לכל transfection הניבו את התוצאות הטובות ביותר.
5. מערבבים LPF2000/DNA ותאים: אחרי 20 - 30 דקות בטמפרטורת חדר דגירה (שלב 1.3), להוסיף 1 מ"ל של תאי Vero (1 x 10 ⁶⁾ (שלב 1.4) כדיתערובת OptiMEM-LPF2000-DNA פלסמיד ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
6. זרע לתוך תערובת LPF2000/DNA-cell 6 גם צלחות: הוסף את תערובת ה-DNA LPF2000-Vero (שלב 1.5) לתוך הבארות של צלחת 6 באר. נער בעדינות את 6 היטב הצלחת ולתת דגירה transfection הלילה באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO _2.
7. שנה בינונית transfection: כ 16-24 שעות שלאחר transfection, להסיר את המדיה transfection, להוסיף 2 מ"ל של תקשורת זיהום ודגירת תאי transfected עבור 48 שעות נוספות.
8. מעבר סלולרי: אחרי 48 שעות של דגירה בתקשורת זיהום, להסיר את רקמת תרבות supernatant (TCS) ולהעביר את תאי transfected לתוך צלחת 100 מ"מ. TCS לעתים רחוקות מכיל וירוס מדבק, כי תאי transfected צריך דגירה נוספת כדי ליצור חלקיקי נגיף. למעבר התא:
   1. שטוף תאים, פעמיים, עם 2 מ"ל של 1x PBS.
   2. Trypsinize תאי w 0.5 מ"ל-i של טריפסין-EDTA ולחכות עד שתאים לניתק.
   3. Resuspend תאי 1 מ"ל של DMEM 10% FBS PS 1% בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
   4. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 5000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס בmicrocentrifuge.
   5. resuspend בקפידה את התאים ב 1 מ"ל של תקשורת זיהום ולהעביר את התאים למנת 100 מ"מ. להעלות את הנפח הכולל בצלחת, עם תקשורת זיהומיות, עד 8 מ"ל, נפח מספיק כדי למנוע התייבשות של התאים, כמו גם לריכוז הווירוס.
9. נער בעדינות את צלחת 100 מ"מ ולהמשיך את הדגירה של תאי Vero בחממה ב 37 ° C ו 5% CO _{2 למשך} 72 שעות.
10. אוסף של TCS: לאחר הדגירה 72 שעות, לאסוף TCS בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. הסר את תא פסולת על ידי centrifuging במשך 5 דקות ב2,500 סל"ד בצנטריפוגה. arenavirus זיהומיות נמצאת TCS, כך להסיר מתא פסולת גלולה ולאחסן TCS ב -80 ° C.

Le "> 2. אישור על הצלת Arenavirus רקומביננטי

זיהוי של הצלה מוצלחת של rLCMV וrCandid # 1 מושגת באמצעות הקמת יחידת פוקוס (FFU) assay immunofluorescence (IFA). להצלת וירוס פראי מסוג שאנו משתמשים נוגדנים ספציפיים לNP הנגיפי. # 1 r3LCMV וr3Candid לקודד שני גני כתב (GFP וGluc), ובכך מאפשר זיהוי נגיפי וללא הצורך בטיטרציה של נוגדנים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (GFP) ו / או הארה (Gluc).

1. לאשר הצלת arenavirus רקומביננטי פראי סוג: היום לפני טיטרציה, לשטוף תאי Vero פעמיים עם PBS, trypsinize ולהכין צלחות 96, גם כדי להגיע ל80 - מפגש 90% למחרת (4 x 10 ⁴ תאים / טוב). נער בעדינות את הצלחות ביד כדי לקבל את חלוקת מדים של התאים. תרבות התאים, בן לילה, ב37 ° C חממה עם 5% CO _2. בדקו את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר monolayer, לפני שתמשיך עם הזיהום:
   1. סדרנו לדלל (10 דילולים קיפול) המכיל את נגיף TCS התאושש מתאי transfected בצלחת 100 מ"מ (שלב 1.10) בOptiMEM.
   2. הסר את המדיה מתאי Vero זרע, לשטוף פעמיים עם 50 μl של 1x PBS, ולהדביק תאים עם 50 μl של נגיף דילול סדרתי (שלב 2.1). להדביק תאים עבור 1.5 שעות ב 37 ° C ו 5% CO _2.
   3. לאחר הדבקה, הווירוס להסיר את הבידוד, להוסיף 100 μl של זיהום תקשורת / היטב דגירה התאים עבור 16 - 18 שעות. מחדש זיהום נגיפי עלול להתרחש לאחר הדגירה שעות 18, אשר יכול לגרום ליתר הערכה של titers ויראלי.
   4. ב16 - 18 שעות לאחר פגיעה, הסר את TCS מכל הטוב ולתקן את התאים עם פורמלין 4% בדילול ב 1x PBS, במשך 15 דקות ב RT.
   5. בשלב בא, להסיר את פתרון הקיבעון וpermeabilize התאים עם 0.1% טריטון X-100 בדילול 1x PBS, למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
   6. לשאוב את פתרון permeabilization, ולאחר מכן לשטוף את התאים 3 פעמים wiה 1x PBS.
   7. לחסום את התאים עם 2.5% אלבומין בסרום השור (BSA) ב 1x PBS (חסימת פתרון) עבור שעה 1 ב RT. לחלופין, ניתן לחסום את תאי הלילה ב 4 מעלות צלזיוס והמשיכו בדגירת נוגדן ביום המחרת.
   8. בינתיים מכין את הנוגדן הראשוני. לדלל את הנוגדנים הראשוניים ספציפיים #-1-LCMV ופספוסים בחסימת פתרון, ואז צנטריפוגות הנוגדן / פתרון חסימה במשך 15 דקות ב -3,500 סל"ד. שיבוט חד שבטי אנטי LCMV NP נוגדן 1.1.3 (1:30 דילול) ¹⁶ והנוגדן אנטי-NP JUNV חד שבטי SA02-BG12 ממשאבי BEI (1:500 דילול) יכול לשמש לזיהוי של rLCMV וrCandid # 1 , בהתאמה.
   9. לאחר דגירה 1 שעה, לשאוב את פתרון החסימה ולהוסיף 50 μl של הנוגדן הראשוני לתאים ודגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C.
   10. בשלב זה, לדלל את הנוגדנים משני בחסימת פתרון, ואז צנטריפוגות / פתרון חסימת נוגדנים במשך 15 דקות ב 3500 סל"ד. פולינוגדן ארנבת משובט אנטי עכבר IgG FITC המשני לצורך זיהוי של נוגדנים חד שבטיים העיקריים היה בשימוש כדי להשיג תמונות שנצפו באיור 5.
   11. לאחר הדגירה 1 שעה, לשאוב את הנוגדן הראשוני, לשטוף 3 פעמים עם 1X PBS, ומוסיף את הנוגדנים משני למשך 30 דקות ב 37 ° C.
   12. בעקבות דגירה 30 דקות, לשאוב את הנוגדנים משני ולשטוף 3 פעמים עם 1X PBS. התאים מוכנים כעת להיות שנצפה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לשניהם יקבעו את ההצלחה של הצלה וטיטרציה נגיפית על ידי ספירת מוקד יצירת יחידות למ"ל (FFU / מ"ל).
2. הצלה נגיפית r3LCMV וr3Candid # 1: מאז וירוסים אלה מבטאים שני גני כתב, שלהם מציל את יכול להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות ביטוי של GFP או ביטוי Gluc בTCS. חילוץ יכול להיות גם על ידי ביטוי של Gluc בTCS. כדי לכייל את וירוסי trisegmented, אנו עוקבים אחר צעדים 2.1 ל 2.1.4, לעומת זאת תאים לא צריכים בדואר קבוע כדי לקבוע הצלת ויראלי מוצלחת בגלל הביטוי של GFP. טיטרציה של הנגיף תיקבע על ידי ספירת FFU / מ"ל. כדי לקבוע הצלת ויראלי מוצלחת על ידי ביטוי Gluc, ביטוי Gluc מTCS ניתן למדוד באמצעות ערכת assay Gluc (ערכת Biolux Gaussia לוציפראז assay, ניו אינגלנד Biolabs). לשם כך:
   1. Pipet 100 μl של TCS לתוך צלחת 96 גם לבנה (צלחות microtiter תחתית שטוחות, פישר סיינטיפיק).
   2. הגדרת luminometer (LumiCount, Packard Biosciences).
   3. הוסף 50 - פתרון Assay Gluc μl 100 (כפי שהומלץ על ידי היצרן) לכל דגימה ולמדוד את ביטוי גן כתב Gluc עם luminometer. כביקורת שלילית, ביטוי Gluc של TCS מהווירוסים פראי מסוג התאים נגועים נמדד.

3. מעבר של Supernatants תרבית רקמה

הצלת ויראלי תלויה ביעילות transfection. תאי Vero הוכחויש יעילות transfection נמוכה יותר משורות תאים אחרות ^14. אם titers הווירוס בTCS הם נמוך, להדביק תאי Vero טריים בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 0.01 (LCMV) או 0.1 (פספוסים # 1) 72 לשעה כדי להגביר את הנגיף.

תוצאות

הצלה מוצלחת של arenavirus פראי סוג רקומביננטי תאושר על ידי הנוכחות של אנטיגנים נגיפיים באמצעות IFA (איור 5). במקרה של וירוסי trisegmented רקומביננטי, ניתן להעריך הצלת ויראלי מוצלחת על ידי התבוננות הביטוי של GFP על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 6 א). חילוץ מוצלח י?...

Discussion

הדור של Arenaviruses רקומביננטי באמצעות טכניקות גנטיקה הפוכות מבוססות פלסמיד הפך גישה בשימוש נרחב לחקירת היבטים שונים של הביולוגיה arenavirus. כאן אנו לתעד שיפור חיוני למערכת הנוכחית על ידי ביצוע arenavirus מציל בתאי Vero, המאפשר לדור הפוטנציאל של מועמדי חיסון ה-FDA נגד Arenaviruses ווקטורי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.