JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Abstract

أصبح البحث عن المفقودين عبر التشابك أداة قوية تستخدم لتحليل efferents المركزية التي تنظم أهداف الطرفية من خلال الدوائر المتعددة متشابك. وقد تم هذا النهج يستخدم بشكل مكثف في الدماغ من خلال الاستفادة من فيروس داء الكلب الكاذب الممرض الخنازير (PRV) 1. PRV لا تصيب القردة العليا، بما في ذلك البشر، لذلك فإن استخدامها الأكثر شيوعا في الدراسات على الثدييات الصغيرة، وخاصة القوارض. وPRV152 الكاذب سلالة يعبر عن تعزيز الخضراء بروتين فلوري (EGFP) مراسل الجينات ويعبر فقط نقاط الاشتباك العصبي وظيفية retrogradely من خلال التسلسل الهرمي للاتصالات متشابك بعيدا عن موقع الإصابة 2،3. سلالات PRV أخرى لها خصائص الميكروبيولوجية متميزة ويمكن نقلها في كلا الاتجاهين (PRV-بيكر وPRV-كابلان) 4،5. وهذا البروتوكول يتعامل حصرا مع PRV152. من خلال تقديم الفيروس في موقع الطرفية، مثل العضلات، فمن الممكن للحد من دخول الفيروس إلى ركان الدماغ من خلال مجموعة محددة من الخلايا العصبية. النمط الناتج من إشارة EGFP في جميع أنحاء الدماغ ثم يحل الخلايا العصبية التي ترتبط إلى الخلايا المصابة في البداية. لأن طبيعة وزعت من تتبع عبر التشابك مع فيروس داء الكلب الكاذب يجعل تفسير اتصالات محددة داخل الشبكة التي تم تحديدها من الصعب، نقدم طريقة حساسة وموثوق بها توظيف الأمينات المعقدة البيروكسيديز ديكستران (BDA) والكوليرا السم الوحيدات ب (CTB) لتأكيد صلات بين الخلايا التي تم تحديدها باستخدام PRV152. وقد تم اختيار كشف مناعى من BDA وCTB مع الغلوثانيون وDAB (3، 3'-diaminobenzidine) لأنها فعالة في الكشف عن العمليات الخلوية بما في ذلك التشعبات البعيدة 11/06.

Introduction

أصبح البحث عن المفقودين عبر التشابك أداة قوية تستخدم لتحليل efferents المركزية التي تنظم أهداف الطرفية من خلال الدوائر المتعددة متشابك. وقد تم هذا النهج الأكثر استخداما على نطاق واسع في الدماغ القوارض من خلال الاستفادة من فيروس داء الكلب الكاذب الممرض الخنازير (PRV)، وخصوصا سلالة ضعيفة PRV-بارثا صفت لأول مرة في عام 1961 (12). وهنا، نقدم بروتوكول لتحديد التمثيل القشرية الحركية للعضلات محددة أو المجموعات العضلية باستخدام سلالة فيروس داء الكلب الكاذب المؤتلف (PRV152) معربا عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) مراسل الجين 2. الطريقة الموصوفة يستغل سلوك الفيروسات موجه للعصب، والتي تنتج ذرية المعدية التي تصيب لنقاط الاشتباك العصبي عبر الخلايا العصبية الأخرى داخل الدائرة الفنية 3،4،13. PRV152، وهو إسوي مع PRV-بارثا، والصلبان فقط نقاط الاشتباك العصبي retrogradely من خلال التسلسل الهرمي للاتصالات متشابك بعيدا عن موقع الإصابة 3،5 </ سوب>. عن طريق التحكم بدقة الموقع الطرفية للعدوى فمن الممكن للحد من دخول الفيروس إلى الدماغ من خلال مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية الحركية. كما يصيب فيروس بالتتابع سلاسل من الخلايا العصبية متصلة، فإن نمط الناتجة من إشارة EGFP في جميع أنحاء الدماغ ثم حل شبكة من الخلايا العصبية التي ترتبط إلى الخلايا المصابة في البداية.

ميزة إضافية لاستخدام الفيروسات لتتبع العصبي هو التضخيم من البروتين مراسل (EGFP في هذه الحالة) داخل الخلايا المصابة. يوفر هذا التضخيم إشارة مستوى من الحساسية التي تتيح الكشف عن التوقعات حتى متفرق. على سبيل المثال، تم العثور على إسقاط متفرق من القشرة شعرة أنفية المحرك إلى الخلايا العصبية الحركية في الوجه السيطرة على شعيرات في الفئران باستخدام أعرب فيروسي بروتين الفلورية الخضراء 14؛ فشلت الدراسات السابقة للعثور على هذا الإسقاط باستخدام استشفاف الكلاسيكية دون مراسل التضخيم الجينات 11،15. لسوء الحظ، والعديد من ناقلات تتبع الفيروسية، مثل تلك المستخدمة في الدراسة المذكورة، لا يعبرون نقاط الاشتباك العصبي، مما يحد من استخدامها لتعقب الدوائر المتعددة متشابك.

بينما تقدم مزايا واضحة لتحديد شبكة من الخلايا المشاركة في الدائرة الحركية، وطبيعة توزيع عبر التشابك البحث عن المفقودين مع PRV-152 يجعل تفسير اتصالات محددة داخل الدائرة الصعبة. ولذلك، فإننا نقدم وسيلة بسيطة للتحقق من صحة اتصالات محددة داخل الدوائر التي تم تحديدها باستخدام PRV-152 عن طريق مزدوج وضع العلامات باستخدام الأمينات المعقدة البيروكسيديز ديكستران (BDA) والسمية الكوليرا الوحيدات ب (CTB). الجمع بين استخدام BDA وCTB هو نهج راسخ لتعقب الاتصالات بين مجموعات محددة من الخلايا العصبية 6-8،11. عند استخدامها معا، وهذه استشفاف اثنين يمكن تصور في نفس القسم باستخدام DAB اللونين (3، 3'-diaminobenzidine) إجراء 16. وقد تم اختيار ارتفاع الوزن الجزيئي BDA (BDA10kDa) لهذا البروتوكول لأنه ذields وضع العلامات مفصل من العمليات العصبية 6،7،9. وتشمل مزايا إضافية من BDA10kDa ما يلي: يتم نقل تفضيلي في الاتجاه تقدمي 6-8. يمكن أن يتم تسليمها من قبل iontophoretic أو ضغط الحقن 6-8. ويمكن تصور كتبها a-البيروكسيديز أفيدين HRP بسيط (ABC) إجراء 17؛ ويمكن تصويرها بواسطة الضوء أو المجهر الإلكتروني 6،7،18. وقد تم اختيار كشف مناعى من CTB مع الغلوثانيون وDAB لوضع العلامات رجعي من العصبونات الحركية لأنه فعال في الكشف عن العمليات الخلوية بما في ذلك التشعبات البعيدة 10،19. كنا مؤخرا هذا النهج لتحديد مسار السيارات صخبا في الفئران وللكشف عن اتصال متفرق من القشرة الحركية الأولية إلى الخلايا العصبية الحركية الحنجرة، والتي كان من المفترض سابقا أن تغيب 20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ديوك.

1. تخزين الكاذب الفيروسات

  1. نحصل على فيروسات حية (PRV152) من مختبر الدكتور لين Enquist في جامعة برينستون في عيار 1 × 10 9 PFU / م. وقد تم نشر بروتوكول لتوليد فيروس 2.
  2. قسامة الفيروس في 20 ميكرولتر في أنبوب داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية BSL-2 وتخزينها في -80 درجة مئوية تحت الظروف المناسبة للسلامة الأحيائية.
  3. ذوبان الجليد قسامة من PRV مباشرة قبل الحقن.

2. إعداد الجراحية لحقن في العضلات

  1. حمل التخدير العام عن طريق الحقن العضلي الكيتامين-زيلازين (100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ زيلازين) والحفاظ على طائرة التخدير المناسبة باستخدام isofluorane.
  2. حماية القرنيات مع مرهم البصريات.
  3. إعداد رانه موقع الجراحة وفقا لتقنية العقيم بواسطة تقليم الشعر وتعقيم موقع الجراحة مع الدعك بالتناوب من Betadine والكحول 70٪ (الحد الأدنى من 3 دورات). تأكد من استخدام الستائر معقمة لتغطية المناطق الجراحية. للتأكد من الالتزام تقنيات معقمة طوال الإجراءات.
  4. جعل شق الجلد وتكشف عن العضلات من الفائدة. على سبيل المثال، للوصول إلى عضلة الحنجرة الحلقية الدرقية فمن الضروري أولا إزالة جزء المغطي للعضلة القصية اللامية.
  5. ختم أي العضلات مقطوع مع VetBond نسيج لاصق.

3. حقن PRV في العضلات

  1. تحميل 10 ميكرولتر NanoFil نظام محقنة مكروية مع حل PRV إذابة طازجة، إرفاق المقاوم للصدأ إبرة الصلب 34 G، وتركيبها بعناية على الجهاز التجسيمي.
  2. مسح ببطء الفضاء الميت والتحقق من أن حل يخرج طرف محقنة مكروية. تجاهل السائل كنفايات bioharzard.
  3. باستخدام microp التجسيميجهاز ositioning تضع بعناية طرف محقنة مكروية في عضلة الفائدة وملء ببطء العضلات حتى تورم طفيف مرئيا. معدل الحقن سوف تختلف تبعا لحجم العضلات وحجم ليتم حقنه. على سبيل المثال، ينبغي بذل خمس حقن 200 NL (1 ميكرولتر الكل) بمعدل 4 NL / ثانية 1 دقيقة بعيدا في نفس الموقع لملء العضلات الحلقية الدرقية. نقل المحقنة إلى العضلات القادمة من الفائدة (على الحلقي الطرجهالي الجانبي في هذه الحالة) وتكرار إجراء الحقن. ثقب فقط كل عضلة مرة واحدة.
  4. التراجع عن محقنة مكروية بعد خمس دقائق.
  5. ختم كسر في العريضة باستخدام VetBond نسيج لاصق.
  6. بعد أن تم الانتهاء من جميع الحقن، وإغلاق الجرح باستخدام VetBond نسيج لاصق. اعتمادا على المبادئ التوجيهية الخاصة بك المحلية institional استخدام الحيواني، الغرز أو مقاطع الجرح يمكن استخدامها.
  7. مراقبة الحيوانات حتى الاستلقاء القصية وتوفير تسكين الألم، والغذاء، والمياه، والرعاية التي تتطلبها ذمبادئ توجيهية لاستخدام الحيوانات لدينا المؤسسية.
  8. بعد وقت بقاء تجريبيا (في هذه الحالة، 90 ساعة لتسمية 2 الثانية تأمر الخلايا العصبية القشرية)، التضحية الحيوانية جرعة زائدة بنتوباربيتال ويروي transcardially مع المياه المالحة 0.9٪ تليها 4٪ الفورمالديهايد في 0.1 M PBS.
  9. إزالة وبعد إصلاح الدماغ في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة.
  10. Cryoprotect الدماغ في الفوسفات عازلة تحتوي على 30٪ سكروز لمدة 48 ساعة على الأقل.

4. كشف مناعى من EGFP

  1. قطع المقاطع في 40 ميكرون على مشراح انزلاق وحفظ المقاطع العائمة إلى 0.1M برنامج تلفزيوني. أقسام أرق، على سبيل المثال 30 ميكرون، ويمكن استخدامها عند تلطيخ أقسام محمولة.
  2. إرواء أقسام لمدة 30 دقيقة في 0.3٪ H 2 O 2 في برنامج تلفزيوني محمية من الضوء.
  3. منع مستضدات غير محددة في الأقسام لمدة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ توين 20 مع مصل الماعز العادي من أدوات VECTASTAIN النخبة (VE عدة).
  4. احتضان سدت أبواب مقابل 3.5 ساعة في أرنب مكافحة EGFP (1: 1000) في RT.
  5. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم احتضان لهم لمدة 1 ساعة في الماعز المضادة للأرنب الضد الثانوية من VE عدة في RT.
  6. إعداد الحل ABC من VE عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  7. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم الرد عليهم لمدة 1 ساعة في حل ABC من VE عدة في RT.
  8. غسل أقسام ثلاث مرات في المخزن الفوسفات لمدة 10 دقيقة، وتطوير لمدة 8 دقائق في المخزن الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.05٪ DAB (3، 3'-diaminobenzidine) و0.015٪ H 2 O 2.
  9. أقسام جبل على الشرائح SuperFrost زائد ويذوى من خلال سلسلة الكحول متدرج (70٪، 95٪، 100٪ و 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما).
  10. مسح المقاطع من خلال اثنين من يغسل زيلين (5 دقائق لكل منهما) وساترة الشرائح مع Permount المتوسطة المتزايدة.
  11. صورة الأقسام التي شنت على المجهر. المنتج رد فعل DAB insidه يجب أن تظهر الخلايا البني. يمكن للصور الرقمية يكون لون مقلوب لتسليط الضوء على العمليات الدقيقة.

5. إعداد الجراحية لحقن استشفاف في مناطق الدماغ التي اكتشفها PRV للبحث عن المفقودين

  1. حمل التخدير العام عن طريق الحقن العضلي الكيتامين-زيلازين (100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ زيلازين) والحفاظ على طائرة التخدير المناسبة باستخدام isofluorane.
  2. حماية القرنيات مع مرهم البصريات.
  3. إصلاح الرأس في إطار التجسيمي المناسب.
  4. إعداد الموقع الجراحي وفقا لتقنية العقيم بواسطة تقليم الشعر وتطهير الموقع مع الدعك بالتناوب من Betadine والكحول 70٪ (الحد الأدنى من 3 دورات).
  5. جعل شق فروة الرأس وسحب الجلد فوق منطقة في الدماغ من الفائدة.
  6. أداء حج القحف صغير في الإحداثيات التجسيمي المناسبة. على سبيل المثال، الإحداثيات للاتصال laryngeally القشرة الحركية التي حددها PRV البحث عن المفقودين فين الماوس البالغين من 1.2 ملم و 0.2 ملم الوحشي منقاري إلى Bregma.

6. حقن البيروكسيديز ديكستران الأمينات في المخ

  1. إعداد 7.5٪ الأمينات ديكستران المعقدة البيروكسيديز (BDA) عن طريق إذابة 25 ملغ من BDA (10000 ميغاواط) في 333 ميكرولتر من محلول ملحي.
  2. تحميل نظام micropipette Nanoject II مع حلا كافيا BDA لحقن المخطط لها.
  3. مسح ببطء الفضاء الميت والتحقق من أن الحل يتم إنهاء غيض micropipette.
  4. باستخدام جهاز micropositioning التجسيمي خفض بعناية غيض micropipette في منطقة الدماغ من الفائدة وحقن ببطء BDA. ضبط معدل الحقن اعتمادا على حجم المنطقة ليكون المسمى. على سبيل المثال، 12 حقن 4.6 NL يجب أن أدلى تكون على أربعة مواقع مختلفة 0.2 مم وبصرف النظر (اتجاه rostro الذيلية) لتغطية القشرة الحركية ترتبط laryngeally في فئران بالغة. ينبغي تعديل حجم الحقن النهائي وفقا لحجم منطقة الدماغ من الفائدة، مع الأخذ في الاعتبار أن التسمية قد ينتشر من صميم حقن عن طريق الانتشار من خلال أنسجة المخ وعلى طول عمليات الخلايا العصبية المسماة.
  5. ختم حج القحف باستخدام الاسمنت الأسنان، وإغلاق الجرح فروة الرأس باستخدام VetBond نسيج لاصق.
  6. مراقبة الحيوانات حتى الاستلقاء القصية وتوفير تسكين الألم، والغذاء، والمياه، والرعاية المطلوبة من قبل الإرشادات استخدام الحيوان المؤسسية الخاص بك.

7. حقن الكوليرا السمية الوحدة الفرعية ب في العضلات

  1. إعداد 1٪ الكوليرا السمية فرعية ب (CTB) عن طريق إذابة 1 ملغ من CTB في 100 ميكرولتر من محلول ملحي.
  2. بعد ستة أيام BDA الحقن في الدماغ، نفذ إعداد الجراحية كما هو موضح أعلاه لحقن PRV في العضلات.
  3. تحميل 10 ميكرولتر NanoFil نظام محقنة مكروية مع حل CTB، إرفاق المقاوم للصدأ إبرة الصلب 34 G، وبعناية تركيبها على جهاز التجسيمي.
  4. أداء إبر دقيقة جدا في العضلات (ق) من الفائدة وإلغاء سابقامكتوب لPRV.
  5. مراقبة الحيوانات حتى الاستلقاء القصية وتوفير تسكين الألم، والغذاء، والمياه، والرعاية المطلوبة من قبل الإرشادات استخدام الحيوان المؤسسية الخاص بك.
  6. بعد ثلاثة أيام من الحقن CTB، التضحية الحيوانية جرعة زائدة بنتوباربيتال ويروي transcardially مع المياه المالحة 0.9٪ تليها 4٪ الفورمالديهايد في 0.1 M PBS.
  7. إزالة وبعد إصلاح الدماغ في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة.
  8. Cryoprotect الدماغ في الفوسفات عازلة تحتوي على 30٪ سكروز لمدة 48 ساعة على الأقل.

8. الكشف عن BDA وCTB في نفس المقاطع

  1. قطع المقاطع في 40 ميكرون على مشراح وحفظ المقاطع العائمة إلى 0.1M برنامج تلفزيوني.
  2. إرواء أقسام لمدة 30 دقيقة في 0.3٪ H 2 O 2 في برنامج تلفزيوني محمية من الضوء.
  3. إعداد الحل ABC من VE عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  4. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم الرد عليهم لمدة 1 ساعة في حل ABC في RT.
  5. غسل أقسام ثلاث مرات في المخزن الفوسفات لمدة 10 دقيقة، وتطوير لمدة 8 دقائق في المخزن الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.05٪ DAB (3، 3'-diaminobenzidine)، 0.015٪ H 2 O 2، و 0.05٪ كلوريد النيكل. المنتج رد فعل DAB داخل الخلايا يجب أن تظهر الأسود.
  6. أقسام كتلة لمدة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ توين 20 مع مصل الأرنب العادي من أدوات VECTASTAIN النخبة.
  7. احتضان سدت أبواب لمدة 2 ساعة في الماعز المضادة للCTB (1: 10000) في RT.
  8. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم احتضان لهم لمدة 1 ساعة في أرنب مكافحة الماعز الضد الثانوية من VE عدة في RT.
  9. إعداد الحل ABC من VE عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  10. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم الرد عليها لمدة 30 دقيقة في محلول ABC في RT.
  11. غسل أقسام ثلاث مرات في المخزن الفوسفات لمدة 10 دقيقة، وتطوير لمدة تصل إلى 8 دقائق في المخزن الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.05٪ DAB (3، 3'-diaminobenzidine) و0.015٪ H 2 O 2. المنتج رد فعل DAB داخل الخلايا يجب أن تظهر البني.
  12. أقسام جبل على الشرائح SuperFrost زائد ويذوى من خلال سلسلة الكحول متدرج (70٪، 95٪، 100٪ و 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما).
  13. مسح المقاطع من خلال اثنين من يغسل زيلين (5 دقائق لكل منهما) وساترة الشرائح مع Permount المتوسطة المتزايدة.
  14. صورة الأقسام التي شنت على المجهر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يجب تلطيخ لEGFP تبدأ تظهر إشارة ضعيفة في الخلايا العصبية الحركية الأولية حوالي 72 ساعة بعد الحقن PRV152 في العضلات. تكرار والنقل عبر التشابك من الفيروسات وtiter- و 4 تعتمد على الوقت. ما يقرب من 90 ساعة بعد الحقن، وEGFP تلطيخ تكشف إشارة قوية من أجل الخلايا المصابة 2 الثانية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وهناك عدد من القضايا التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند التخطيط لتجربة استخدام PRV152 4،21. الأهم من ذلك، فيروس داء الكلب الكاذب قاتلة. كما ذكر سابقا، القردة العليا، بما في ذلك البشر ليست عرضة للإصابة، ولكن يجب توخي الحذر المناسبة لحماية الحيوانات الأخرى. فئران بال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Acknowledgements

نشكر الدكتور توشيو Terashima من جامعة كوبي، اليابان، لتدريس تقنية جراحة الحنجرة، والدكتور لين Enquist من جامعة برينستون لتوريد PRV-بارثا. وأيد البحث من قبل جائزة الرواد NIH DP1 OD000448 لإريك D. جارفيس وجائزة زمالة أبحاث NSF العليا لغوستافو آرياغا. وتستخدم الأرقام من الأعمال السابقة الفضل بشكل مناسب تحت بلوس وان الوصول المفتوح جميل الترخيص (CC-BY) وفقا لسياسات التحرير في المجلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent/MaterialCompanyCatalog NumberComments
NanoFil Microinjection SystemWorld Precision InstrumentsIO-Kit34 G option
Stereotaxic frameDavid Kopf InstrumentsModel 900
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond Scientific Company3-000-204
Sliding microtomeLeicaSM2010 R
[header]
VetBond3M1469SB
Isofluorane (Forane)Baxter 1001936060
Betadine Swab StickCardinal Health2130-01200 count
Permount Mounting MediumFisher ScientificSP15-500
SuperFrost Plus slidesFisher Scientific12-550-15
Biotinylated dextran aminesInvitrogenD-195610,000 MW
Pseudorabies virusLaboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)PRV152Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)List Biological Laboratories703
Cholera Toxin B SubunitList Biological Laboratories103B
Anti-eGFPOpen BiosystemsABS4528
3, 3'-diaminobenzidineSigma-AldrichD590510 mg tablets
EthanolSigma-AldrichE7023200 proof
FormaldehydeSigma-AldrichF8775Dilute to 4%
Hydrogen peroxideSigma-AldrichH341030%
Ketamine HCl & Xylazine HClSigma-AldrichK413880 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chlorideSigma-Aldrich339350
Phosphate bufferSigma-AldrichP36191.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP549310x; pH 7.4
Sodium PentobarbitalSigma-AldrichP376150 mg/ml dose
SucroseSigma-AldrichS9378
Tween 20Sigma-AldrichP1379
XylenesSigma-Aldrich534056Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC KitVector LaboratoriesPK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointmentVet Depot1017992

References

  1. Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
  2. Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
  3. Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
  4. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
  5. Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
  6. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
  7. Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
  8. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  9. Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
  10. Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
  11. Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
  12. Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
  13. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  14. Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
  15. Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  18. Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
  19. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
  20. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610(2012).
  21. Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
  22. Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
  23. Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
  24. Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
  25. Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

103

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved