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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Zusammenfassung

Transsynaptische Verfolgung hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug zur zentralen Efferenzen, die periphere Ziele durch Multi-synaptischen Schaltungen zu regulieren zu analysieren. Dieser Ansatz wurde sehr ausgiebig im Gehirn durch die Nutzung der Schweine pathogen Pseudorabies-Virus (PRV) 1 verwendet. PRV nicht infizieren, Menschenaffen, einschließlich des Menschen, so dass es am häufigsten in Studien von kleinen Säugetieren, vor allem Nagetiere. Die Pseudorabies-Stamm PRV152 drückt das enhanced green fluorescent protein (eGFP) Reportergen und kreuzt nur funktionierender Synapsen retrograd durch die hierarchische Sequenz der synaptischen Verbindungen von der Infektionsstelle 2,3. Andere PRV-Stämme haben unterschiedliche mikrobiologischen Eigenschaften und kann in beiden Richtungen (PRV-Becker und PRV-Kaplan) 4,5 transportieren. Dieses Protokoll wird ausschließlich mit PRV152 umzugehen. Durch die Bereitstellung der Virus bei einer peripheren Stelle, wie Muskeln, ist es möglich, den Eintritt des Virus in T GrenzEr Gehirn durch eine bestimmte Gruppe von Neuronen. Das resultierende Muster der eGFP-Signal über das gesamte Gehirn löst dann die Nervenzellen, die zu den ursprünglich infizierten Zellen verbunden sind. Da die verteilte Natur transsynaptische Tracing mit Pseudorabies-Virus macht die Interpretation spezifischen Verbindungen innerhalb eines identifizierten Netzwerk schwierig, präsentieren wir eine empfindliche und zuverlässige Verfahren, bei dem biotinylierte Dextran Amine (BDA) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) zur Bestätigung der Verbindungen zwischen Zellen identifiziert Verwendung PRV152. Immunochemische Detektion BDA und CTB mit Peroxidase und DAB (3, 3'-Diaminobenzidin) wurde gewählt, weil sie effektiv bei der Aufklärung von zellulären Prozessen, einschließlich distalen Dendriten 6-11.

Einleitung

Transsynaptische Verfolgung hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug zur zentralen Efferenzen, die periphere Ziele durch Multi-synaptischen Schaltungen zu regulieren zu analysieren. Dieser Ansatz wurde sehr ausgiebig im Gehirn von Nagetieren durch die Nutzung der Schweine pathogen Pseudorabies-Virus (PRV), vor allem die abgeschwächten Stamm PRV-Bartha erstmals 1961 beschrieben, verwendet 12. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Identifizierung der Motor kortikalen Repräsentation von spezifischen Muskeln oder Muskelgruppen unter Verwendung eines rekombinanten Pseudorabies-Virus-Stamm (PRV152) die verstärkte grün fluoreszierende Protein (eGFP) Reporter-Gen 2 zum Ausdruck. Das beschriebene Verfahren nutzt das Verhalten der neurotropen Viren, die infektiösen Nachkommen, dass grenz Synapsen zu anderen Neuronen innerhalb einer Funktionsschaltung 3,4,13 infizieren zu produzieren. PRV152, die isogen mit PRV-Bartha ist, kreuzt nur Synapsen retrograd durch die hierarchische Reihenfolge der synaptischen Verbindungen von der Infektionsstelle 3,5 </ sup>. Durch präzises Steuern der peripheren Stelle der Infektion ist es möglich, den Eintritt des Virus in das Gehirn durch eine spezifische Untergruppe von Motoneuronen zu begrenzen. Da das Virus infiziert Ketten sequentiell verbundenen Neuronen, wird das sich ergebende Muster eGFP Signal gesamten Gehirn dann lösen das Netzwerk von Neuronen, die zu den ursprünglich infizierten Zellen verbunden sind.

Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung von Virus für neuronale Verfolgung ist die Amplifikation des Reporter-Protein (eGFP in diesem Fall) in infizierten Zellen. Diese Signalverstärkung bietet ein Maß an Sensibilität, die Detektion auch spärlich Projektionen ermöglicht. Zum Beispiel wurde eine spärliche Projektion aus vibrissa motorischen Cortex zu den Gesichtsmotoneuronen Steuern der Whisker in Ratten unter Verwendung viral exprimierten green fluorescent protein 14 gefunden; früheren Studien konnte diesen Vorsprung mit klassischen Tracern ohne Reporter-Gen-Amplifikation 11,15 zu finden. leiderViele virale Verfolgung Vektoren, wie das in der zitierten Studie verwendeten nicht kreuzen Synapsen, wodurch ihre Verwendung für die Rückverfolgung Mehrsynapsenschaltungen einschränkend.

Während der Präsentation deutliche Vorteile für die Identifizierung der Netzwerk von Zellen, die an einem Motorstromkreis, der verteilten Natur transsynaptische Tracing mit PRV-152 macht die Interpretation von spezifischen Verbindungen innerhalb der Schaltung schwierig. Daher präsentieren wir ein einfaches Verfahren für die Validierung von spezifischen Verbindungen innerhalb Schaltungen identifiziert mit PRV-152 durch Doppelklick Etikettierung unter Verwendung von biotinylierten Dextran Amine (BDA) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTB). Der kombinierte Einsatz von BDA und CTB ist ein etablierter Ansatz zur Verfolgung Verbindungen zwischen bestimmten Gruppen von Neuronen 6-8,11. Wenn sie zusammen verwendet werden, können diese beiden Tracer in demselben Abschnitt unter Verwendung eines Zweifarben DAB (3, 3'-Diaminobenzidin) Prozedur 16 visualisiert werden. Hochmolekulare BDA (BDA10kDa) wurde für dieses Protokoll ausgewählt, weil es yields detaillierte Kennzeichnung von neuronalen Prozessen 6,7,9. Zusätzliche Vorteile BDA10kDa gehören die folgenden: Es ist bevorzugt in der anterograde Richtung 6-8 transportiert wird; sie kann durch iontophoretische oder Druckeinspritzung 6-8 geliefert werden; sie kann durch einen einfachen Avidin-biotinyliertem HRP (ABC) Verfahren 17 dargestellt werden; und es kann durch Licht- oder Elektronenmikroskopie 6,7,18 abgebildet werden. Immunchemischen Nachweis von CTb mit Peroxidase und DAB wurde für retrograde Markierung von Motoneuronen gewählt, weil es effektiv bei enthüllt zelluläre Prozesse einschließlich distalen Dendriten 10,19 ist. Vor kurzem haben wir diesen Ansatz verwendet, um die Stimmkraftwegs in Mäusen zu identifizieren und ein Sparse-Verbindung vom primären Motorkortex den Kehlkopfmotorneurone, was bisher angenommen wurde 20 abwesend sein offenbaren.

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Protokoll

HINWEIS: Alle tierischen Verfahren wurden überprüft und von der Duke University Institutional Animal Care & Use Committee genehmigt.

1. Speichern Pseudorabiesvirus

  1. Wir erhalten Lebendvirus (PRV152) aus dem Labor von Dr. Lynn Enquist an der Princeton University mit einem Titer von 1 × 10 9 pfu / m. Das Protokoll, das Virus zu erzeugen, ist veröffentlicht worden 2.
  2. Aliquot des Virus bei 20 & mgr; l pro Röhrchen in einem BSL-2 Biosicherheitswerkbank und bei -80 ° C unter angemessenen Biosicherheitsbedingungen.
  3. Tauwetter ein Aliquot PRV unmittelbar vor der Injektion.

2. Chirurgische Vorbereitung für Injektionen in den Muskel

  1. Induzieren Narkose durch intramuskuläre Injektion von Ketamin-Xylazin (100 mg / kg Ketamin, 10 mg / kg Xylazin) und Aufrechterhaltung eines geeigneten Anästhetikums Ebene mit Isofluran.
  2. Schützen die Hornhaut mit einer ophthalmischen Salbe.
  3. Bereiten ter Operationsstelle nach aseptischen Bedingungen durch Trimmen Haare und Desinfektion des Operationsstelle mit alternierenden Peelings von Betadine und 70% Alkohol (mindestens 3 Zyklen). Achten Sie darauf, sterilen Tüchern zu verwenden, um chirurgische Bereiche abdecken. Achten Sie darauf, um sterile Techniken in den Verfahren einzuhalten.
  4. Machen Sie einen Hautschnitt und zeigen die Muskeln von Interesse. Zum Beispiel, um den Kehlkopf cricothyroideum Muskel Zugriff ist es erforderlich, zunächst die darüberliegende Teil des M. sternohyoideus entfernen.
  5. Verschließen Sie alle durchtrennten Muskeln mit Vetbond Gewebekleber.

3. Injektion von PRV in Muscle

  1. Laden Sie die 10 & mgr; NanoFil Mikrosystem mit frisch aufgetauten PRV-Lösung, fügen Sie eine 34 G Nadel aus rostfreiem Stahl, und sorgfältig montieren Sie ihn auf der stereotaktischen Gerät.
  2. Langsam löschen Sie den toten Raum und prüfen, ob Lösung tritt aus der Mikrospitze. Entsorgen Flüssigkeit als bioharzard Abfälle.
  3. Unter Verwendung eines stereotaktischen microPositionierung Gerät stellen sorgfältig die Mikrospitze in den Muskel von Interesse und langsam füllen die Muskeln bis leichte Schwellung sichtbar ist. Die Einspritzrate in Abhängigkeit von der Größe des Muskels und das Volumen zu variieren, um injiziert werden. So sollte beispielsweise fünf Injektionen von 200 nl (1 ul insgesamt) bei einer Rate von 4 nl / sec 1 min auseinander am gleichen Ort, um die cricothyroideus füllen. Bewegen Sie die Spritze in die nächste Muskel von Interesse (die seitliche cricoarytenoideus in diesem Fall) und wiederholen Sie den Einspritzvorgang. Jeden Muskel nur einmal zu durchstechen.
  4. Ziehen Sie die Mikrospritze nach fünf Minuten.
  5. Verschließen Sie den Bruch in der Faszie mit Vetbond Gewebekleber.
  6. Nachdem alle Injektionen abgeschlossen sind, schließen Sie die Wunde mit Vetbond Gewebekleber. Abhängig von Ihrer lokalen institional Tiernutzung Richtlinien, Nähten oder Wundklammern verwendet werden.
  7. Überwachen Sie das Tier bis zum Brustlage und bieten Analgesie, Nahrung, Wasser, und die Fürsorge, durch y erforderlichunsere institutionellen Tiernutzung Richtlinien.
  8. Nach dem experimentell ermittelten Überlebenszeit (in diesem Fall 90 h bis zu markieren 2. Ordnung kortikalen Neuronen), opfert das Tier Pentobarbitalüberdosis und transkardial perfundiert mit 0,9% Salzlösung, gefolgt von 4% Formaldehyd in 0,1 M PBS.
  9. Entfernen und nach der Fixierung des Gehirns in 4% Formaldehyd für 24 Stunden.
  10. Cryoprotect das Gehirn in Phosphatpuffer, enthaltend 30% Sucrose für mindestens 48 Std.

4. immunchemischen Nachweis von eGFP

  1. Zuschnitte bei 40 & mgr; m auf einem Schlittenmikrotom und speichern schwebenden Abschnitte, in 0,1 M PBS. Dünneren Abschnitten, beispielsweise 30 & mgr; m kann beim Beizen Einbaufelder verwendet werden.
  2. Stillen Abschnitte für 30 min in 0,3% H 2 O 2 in PBS vor Licht geschützt.
  3. Blockieren nicht-spezifischer Antigene in den Abschnitten für 30 min in PBS mit 0,3% Tween 20 mit normalem Ziegenserum vom VECTASTAIN Elite Kit (VE-Kit).
  4. Inkubation blockiert Abschnitte für 3,5 Stunden in Kaninchen-anti-eGFP (1: 1.000) bei RT.
  5. Dreimal in PBS waschen Abschnitte für 5 min, dann inkubiert sie für 1 Stunde in Ziegen-Anti-Kaninchen sekundären Antikörpers von dem VE Kit bei RT.
  6. Vorbereitung der ABC-Lösung von der VE-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  7. Dreimal in PBS waschen Abschnitte für 5 min, dann reagieren sie für 1 Stunde in ABC-Lösung von der VE Kit bei RT.
  8. Dreimal waschen Abschnitte in Phosphatpuffer für 10 min, und zu entwickeln, für 8 min in Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,05% DAB (3, 3'-Diaminobenzidin) und 0,015% H 2 O 2.
  9. Montageabschnitte auf Superfrost Plus Rutschen und entwässern sie durch eine abgestufte Alkoholserie (70%, 95%, 100% und 100% für jeweils 5 Minuten).
  10. Deaktivieren Sie die Schnitte durch zwei Wäschen Xylol (5 min jeweils) und Deckglas die Folien mit Permount Eindeckmedium.
  11. Bild die montierten Teile auf einem Mikroskop. Die DAB Reaktionsprodukt inside die Zellen sollten braun erscheinen. Digitalisierte Bilder können Farben umgekehrt, um feine Prozesse hervorzuheben ist.

5. Chirurgische Vorbereitung für die Injektion von Tracern in Hirnregionen Entdeckt von PRV Tracing

  1. Induzieren Narkose durch intramuskuläre Injektion von Ketamin-Xylazin (100 mg / kg Ketamin, 10 mg / kg Xylazin) und Aufrechterhaltung eines geeigneten Anästhetikums Ebene mit Isofluran.
  2. Schützen die Hornhaut mit einer ophthalmischen Salbe.
  3. Befestigen Sie den Kopf in einem geeigneten stereotaktischen Rahmen.
  4. Bereiten Sie die Operationsstelle nach aseptischen Bedingungen durch Trimmen Haare und Desinfektion der Website mit alternierenden Peelings von Betadine und 70% Alkohol (mindestens 3 Zyklen).
  5. Machen Sie einen Kopfhauteinschnitt und Einfahren der Haut über der Hirnregion von Interesse.
  6. Führen Sie eine kleine Kraniotomie bei den entsprechenden stereotaktischen Koordinaten. Zum Beispiel werden die Koordinaten für laryngeally verbunden motorischen Kortex von PRV-Tracing in einer identifiziertenn erwachsenen Maus sind 1,2 mm lateral und 0,2 mm rostral Bregma.

6. Die Injektion von biotinylierten Dextran Amine in Gehirn-

  1. Bereiten Sie 7,5% biotinylierten Dextran Amine (BDA) durch Lösen von 25 mg des BDA (10.000 MW) in 333 ul steriler Kochsalzlösung.
  2. Laden Sie die Mikropipette System Nanoject II mit ausreichender BDA-Lösung für die geplanten Injektionen.
  3. Langsam löschen Sie den toten Raum und prüfen, ob Lösung Verlassen der Mikropipettenspitze.
  4. Unter Verwendung eines stereotaktischen Mikropositionierung Gerät vorsichtig niedriger die Mikropipettenspitze in das Gehirn Region von Interesse und langsam injizieren BDA. Stellen Sie die Einspritzrate in Abhängigkeit von der Größe der Region, um zu kennzeichnen. Zum Beispiel sollten 12 Injektionen von 4,6 NL hat an vier verschiedenen Standorten 0,2 mm auseinander (rostro-kaudal), um die laryngeally verbunden motorischen Kortex in erwachsenen Mäusen zu decken. Das endgültige Injektionsvolumen sollte entsprechend der Größe der Hirnregion von Interesse angepasst werden, Wenn man bedenkt, dass Etikett kann aus der Spritzkern durch Diffusion durch Hirngewebe und entlang den Prozessen der markierten Neuronen ausgebreitet.
  5. Verschließen Sie die Kraniotomie mit Zahnzement, und schließen Sie die Kopfhaut Wunde mit Vetbond Gewebekleber.
  6. Überwachen Sie das Tier bis zum Brustlage und bieten Analgesie, Nahrung, Wasser, und die Fürsorge, die von Ihrem institutionellen Tiernutzung Richtlinien erforderlich.

7. Die Injektion von Cholera Toxin-Untereinheit b in Muscle

  1. Vorbereitung 1% Cholera Toxin-Untereinheit B (CTB), die durch Auflösen von 1 mg CTb in 100 ul steriler Kochsalzlösung.
  2. Sechs Tage nach BDA Injektion in das Gehirn, führen die chirurgische Vorbereitung wie oben für PRV Injektionen beschrieben in den Muskel.
  3. Laden Sie die 10 & mgr; NanoFil Mikrosystem mit CTb Lösung, fügen Sie eine 34 G Nadel aus rostfreiem Stahl, und sorgfältig montieren Sie ihn auf der stereotaktischen Gerät.
  4. Führen die Mikroinjektion in den Muskel (n) von Interesse, wie vorstehend dePRV beschrieben.
  5. Überwachen Sie das Tier bis zum Brustlage und bieten Analgesie, Nahrung, Wasser, und die Fürsorge, die von Ihrem institutionellen Tiernutzung Richtlinien erforderlich.
  6. Drei Tage nach CTb Injektion, zu opfern das Tier durch Überdosis Pentobarbital und perfundieren transkardial mit 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Formaldehyd in 0,1 M PBS.
  7. Entfernen und nach der Fixierung des Gehirns in 4% Formaldehyd für 24 Stunden.
  8. Cryoprotect das Gehirn in Phosphatpuffer, enthaltend 30% Sucrose für mindestens 48 Std.

8. Nachweis der BDA und CTB in dieselben Abschnitte

  1. Zuschnitte bei 40 & mgr; m auf einem Mikrotom und speichern schwebenden Abschnitte, in 0,1 M PBS.
  2. Stillen Abschnitte für 30 min in 0,3% H 2 O 2 in PBS vor Licht geschützt.
  3. Vorbereitung der ABC-Lösung von der VE-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  4. Dreimal waschen Schnitte in PBS für 5 min, dann reagieren sie für 1 Stunde in ABC-Lösung bei RT.
  5. Dreimal waschen Abschnitte in Phosphatpuffer für 10 min, und zu entwickeln, für 8 min in Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,05% DAB (3, 3'-Diaminobenzidin), 0,015% H 2 O 2 und 0,05% Nickelchlorid. Die DAB Reaktionsprodukt innerhalb der Zellen sollte erscheinen schwarz.
  6. Blockabschnitte für 30 min in PBS mit 0,3% Tween 20 mit normalem Kaninchenserum aus dem VECTASTAIN Elite Kit.
  7. Inkubieren blockiert Abschnitten 2 h in Ziegen-Anti-CTb (1: 10.000) bei RT.
  8. Dreimal waschen Schnitte in PBS für 5 min und dann inkubiert sie für 1 h in Kaninchen-anti-Ziege-sekundärem Antikörper von dem VE Kit bei RT.
  9. Vorbereitung der ABC-Lösung von der VE-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  10. Dreimal waschen Schnitte in PBS für 5 min, dann reagieren sie für 30 min in ABC-Lösung bei RT.
  11. Dreimal in Phosphatpuffer gewaschen Schnitte für 10 min, und die Entwicklung bis zu 8 min in Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) und 0,015% H 2 O 2. Die DAB Reaktionsprodukt innerhalb der Zellen sollte braun erscheinen.
  12. Montageabschnitte auf Superfrost Plus Rutschen und entwässern sie durch eine abgestufte Alkoholserie (70%, 95%, 100% und 100% für jeweils 5 Minuten).
  13. Deaktivieren Sie die Schnitte durch zwei Wäschen Xylol (5 min jeweils) und Deckglas die Folien mit Permount Eindeckmedium.
  14. Bild die montierten Teile auf einem Mikroskop.

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Ergebnisse

Färbung für eGFP sollten anfangen, die schwaches Signal in primären Motoneuronen in etwa 72 Stunden nach der Injektion in den Muskel PRV152. Replikation und transsynaptische Transport von Virus titer- und zeitabhängige 4. Etwa 90 Stunden nach der Injektion wird eGFP-Färbung zeigen robuste Signal in 2. Ordnung infizierten Zellen. Längere Überlebenszeiten werden offenbaren 3. und höherer Ordnung Zellen, aber die Überlebenszeiten durch die Letalität von PRV auf etwa 5 Tage nach de...

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Diskussion

Es gibt eine Reihe von Fragen, die berücksichtigt bei der Planung eines Experiments unter Verwendung PRV152 4,21 getroffen werden müssen. Am wichtigsten ist, Pseudorabies-Virus tödlich. Wie zuvor erwähnt, Menschenaffen, einschließlich Menschen, sind nicht anfällig für Infektionen, sondern müssen entsprechende Sorgfalt auf andere Tiere zu schützen. Erwachsene Mäuse überleben in der Regel fünf bis sieben Tage nach der Impfung mit attenuierten PRV152 Belastung. Daher ist PRV152 nicht für Experimente...

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Offenlegungen

No conflicts of interest declared.

Danksagungen

Wir danken Dr. Toshio Terashima der Universität Kobe, Japan, für die Lehre des Kehlkopfoperationstechnik und Dr. Lynn Enquist von der Princeton University für die Versorgung PRV-Bartha. Forschung wurde von NIH Pioneer Award DP1 OD000448 Erich D. Jarvis und ein NSF Graduate Research Fellowship Award an Gustavo Arriaga unterstützt. Zahlen entsprechend gutgeschrieben früheren Arbeiten werden unter der PLoS ONE offenen Zugang Creative Commons-Lizenz (CC-BY) gemäß redaktionelle Politik der Zeitschrift verwendet.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent/MaterialCompanyCatalog NumberComments
NanoFil Microinjection SystemWorld Precision InstrumentsIO-Kit34 G option
Stereotaxic frameDavid Kopf InstrumentsModel 900
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond Scientific Company3-000-204
Sliding microtomeLeicaSM2010 R
[header]
VetBond3M1469SB
Isofluorane (Forane)Baxter 1001936060
Betadine Swab StickCardinal Health2130-01200 count
Permount Mounting MediumFisher ScientificSP15-500
SuperFrost Plus slidesFisher Scientific12-550-15
Biotinylated dextran aminesInvitrogenD-195610,000 MW
Pseudorabies virusLaboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)PRV152Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)List Biological Laboratories703
Cholera Toxin B SubunitList Biological Laboratories103B
Anti-eGFPOpen BiosystemsABS4528
3, 3'-diaminobenzidineSigma-AldrichD590510 mg tablets
EthanolSigma-AldrichE7023200 proof
FormaldehydeSigma-AldrichF8775Dilute to 4%
Hydrogen peroxideSigma-AldrichH341030%
Ketamine HCl & Xylazine HClSigma-AldrichK413880 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chlorideSigma-Aldrich339350
Phosphate bufferSigma-AldrichP36191.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP549310x; pH 7.4
Sodium PentobarbitalSigma-AldrichP376150 mg/ml dose
SucroseSigma-AldrichS9378
Tween 20Sigma-AldrichP1379
XylenesSigma-Aldrich534056Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC KitVector LaboratoriesPK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointmentVet Depot1017992

Referenzen

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  2. Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
  3. Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
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