Transsináptica Rastreamento de Alvos periféricos com vírus da pseudo-Seguido por cólera toxina e Biotinilado Dextran aminas Duplo Labeling

Resumo

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Resumo

Rastreamento transsináptica tornou-se uma poderosa ferramenta utilizada para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos através de circuitos multi-sinápticos. Esta abordagem tem sido mais amplamente utilizado no cérebro, utilizando o vírus da pseudo-raiva de agentes patogénicos suína (PRV) ^1. O PRV não infectar grandes macacos, incluindo os seres humanos, por isso é mais comumente usado em estudos sobre pequenos mamíferos, especialmente roedores. O PRV152 pseudorabies estirpe expressa a proteína fluorescente (eGFP) gene repórter verde reforçada e só atravessa sinapses funcionais retrogradamente através da seqüência hierárquica das conexões sinápticas de distância do local da infecção ^2,3. Outras estirpes de PRV têm propriedades microbiológicas distintas e pode ser transportado em ambas as direcções (PRV-Becker e PRV-Kaplan) ^4,5. Este protocolo tratará exclusivamente com PRV152. Ao fornecer o vírus num sítio periférico, tais como o músculo, é possível limitar a entrada do vírus em tele cérebro através de um conjunto específico de neurônios. O padrão resultante de sinal eGFP em todo o cérebro, em seguida, resolve os neurónios que são ligados às células inicialmente infectadas. Como a natureza distribuída de rastreamento transsináptica com o vírus da pseudo-raiva faz interpretar conexões específicas dentro de uma rede identificada difícil, apresentamos um método sensível e confiável que emprega aminas biotinilados dextrano (BDA) e toxina da cólera subunidade b (CTB) para confirmar as conexões entre as células identificadas usando PRV152. Detecção imunoquímica de BDA e CTB e com peroxidase de DAB (3, 3'-diaminobenzidina) foi escolhida, porque eles são eficazes em processos celulares, incluindo revelando dendritos distais ^6-11.

Introdução

Rastreamento transsináptica tornou-se uma poderosa ferramenta utilizada para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos através de circuitos multi-sinápticos. Esta abordagem tem sido o mais amplamente utilizado no cérebro de roedor, utilizando o vírus da pseudo-raiva de agentes patogénicos suína (PRV), especialmente a estirpe atenuada de PRV-Bartha descrita pela primeira vez em 1961 ^12. A seguir, apresentamos um protocolo para a identificação da representação cortical motora dos músculos específicos ou grupos musculares utilizando uma estirpe do vírus da pseudo-raiva recombinantes (PRV152) que expressa o reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) gene repórter ^2. O método descrito explora o comportamento de vírus neurotrópico, que produzem progénie infeccioso que sinapses cruzadas para infectar outros neurónios dentro de um circuito funcional ^3,4,13. PRV152, que é isogênico com PRV-Bartha, única atravessa sinapses retrogradamente através da seqüência hierárquica das conexões sinápticas longe do local de infecção ^{3,5 <}/ sup>. Ao controlar com precisão o local periférico de infecção é possível limitar a entrada do vírus para o cérebro através de um subconjunto específico de neurónios motores. À medida que o vírus infecta sequencialmente cadeias de neurónios ligados, o padrão resultante de sinal eGFP em todo o cérebro, em seguida resolver a rede de neurónios que estão ligados às células inicialmente infectadas.

Uma vantagem adicional da utilização de vírus, para um rastreio neural é a amplificação da proteína repórter (eGFP, neste caso) no interior das células infectadas. Esta amplificação de sinal fornece um nível de sensibilidade que permite a detecção de projeções ainda esparsas. Por exemplo, uma projecção a partir de córtex motor esparso vibrissa para os neurónios motores faciais que controlam os bigodes foi encontrada em ratos utilizando viralmente expressa a proteína fluorescente verde ^14; Estudos anteriores não conseguiram encontrar essa projeção usando marcadores clássicos sem amplificação do gene repórter ^11,15. Infelizmente, Muitos vectores virais de rastreio, tal como o utilizado no estudo citado, não atravessam sinapses, limitando assim o seu uso para o rastreamento de circuitos multi-sinápticos.

Ao apresentar vantagens distintas para identificar a rede de células que participam em um circuito de motor, a natureza distribuída da transsináptica rastreamento com PRV-152 torna a interpretação de conexões específicas dentro do circuito difícil. Por isso, apresentamos um método simples para a validação de conexões específicas dentro de circuitos identificados usando PRV-152 by-dupla rotulagem utilizando aminas biotinilados dextrano (BDA) e toxina da cólera subunidade b (CTB). O uso combinado do BDA e CTb é uma abordagem bem estabelecido para rastreamento de conexões entre conjuntos específicos de neurônios ^6-8,11. Quando utilizados em conjunto, estes dois marcadores podem ser visualizados na mesma secção utilizando um DAB duas cores (3, 3'-diaminobenzidina) Procedimento ^16. Alto peso molecular BDA (BDA10kDa) foi selecionada para este protocolo porque yfields rotulagem detalhada dos processos neuronais ^6,7,9. As vantagens adicionais da BDA10kDa incluem o seguinte: ele é preferencialmente transportados na direcção anterógrada ^6-8; que podem ser entregues por iontoforese ou de injecção a pressão ^6-8; que pode ser visualizada por uma simples HRP (ABC) Procedimento ¹⁷ biotinilada-avidina; e pode ser fotografada pela luz ou microscopia eletrônica ^6,7,18. Detecção imunoquímica da CTB com peroxidase e DAB foi escolhido para a marcação retrógrada de neurónios motores, pois é eficaz em processos celulares, incluindo revelando dendritos distais ^10,19. Nós recentemente utilizado esta abordagem para identificar a via motora vocal em camundongos e para revelar uma conexão escasso de córtex motor primário para os neurônios motores da laringe, que foi previamente assumidos estar ausente ^20.

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Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram revistos e aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso da Universidade Duke.

1. Armazenando vírus da pseudo-

1. Obtemos vírus vivo (PRV152) a partir do laboratório do Dr. Lynn Enquist na Universidade de Princeton com uma concentração de 1 x ¹⁰ 9 pfu / m. O protocolo para gerar o vírus foi publicada ^2.
2. Alíquota do vírus em 20 ul por tubo dentro de um gabinete de biossegurança BSL-2 e armazenar a -80 ° C em condições de biossegurança adequadas.
3. Descongelar uma alíquota de PRV imediatamente antes da injecção.

2. Preparação cirúrgica para injecções no músculo

1. Induzir a anestesia geral por injeco intramuscular de cetamina-xilazina (100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg xilazina) e manter uma plano anestésico apropriado utilizando isofluorano.
2. Proteja as córneas com uma pomada oftálmica.
3. Prepare tele sítio cirúrgico de acordo com a técnica asséptica por aparar o cabelo e desinfecção do local cirúrgico com a alternância de scrubs de Betadine e álcool a 70% (mínimo de 3 ciclos). Certifique-se de usar campos estéreis para cobrir áreas cirúrgicas. Certifique-se a aderir às técnicas estéreis durante os procedimentos.
4. Faça uma incisão na pele e revelar o músculo de interesse. Por exemplo, para acessar a musculatura laríngea cricothyroid é necessário primeiro remover a parte sobreposta do músculo esterno.
5. Selar qualquer músculos transeccionados com adesivo de tecido Vetbond.

3. Injecção de PRV em músculo

1. Carregue a 10 ul sistema de micro Nanofil com solução PRV recém-descongelado, coloque uma agulha de aço inoxidável 34 G, e montá-lo cuidadosamente no dispositivo estereotáxico.
2. Lentamente limpar o espaço morto e verifique se solução saia a ponta micro. Descarte fluido como resíduos bioharzard.
3. Usando um microp estereotáxicodispositivo ositioning coloque cuidadosamente a ponta da microsseringa no músculo de interesse e lentamente encher o músculo até um ligeiro inchaço é visível. A taxa de injecção variará dependendo do tamanho do músculo e o volume a ser injectado. Por exemplo, de cinco injecções de 200 nl (1 mL no total) a uma taxa de 4 nl / s deve ser feito para além de 1 min no mesmo local para preencher o músculo crico. Mova a seringa para o próximo músculo de interesse (cricoaritenóideo lateral, neste caso) e repita o procedimento de injeção. Apenas perfurar cada músculo uma vez.
4. Retrair o micro depois de cinco minutos.
5. Selar a ruptura na fáscia usando adesivo de tecido Vetbond.
6. Depois de todas as injecções foram concluídos, fechar a ferida utilizando adesivo de tecido Vetbond. Dependendo de suas diretrizes locais institional uso de animais, suturas ou clipes ferida pode ser usado.
7. Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por ynossas diretrizes de uso de animais institucionais.
8. Após o tempo de sobrevivência determinados experimentalmente (neste caso, 90 h para rotular ^2a ordem neurónios corticais), sacrifício do animal por dose excessiva de pentobarbital e perfundir transcardíaca com solução salina a 0,9%, seguido por 4% de formaldeído em PBS a 0,1 M.
9. Retire e pós-fixar o cérebro em formaldeído 4% durante 24 horas.
10. Cryoprotect o cérebro em tampão de fosfato contendo 30% de sacarose pelo menos durante 48 horas.

4. detecção imunoquímica de eGFP

1. Cortar secções de 40 um em um micrótomo deslizante e salvar seções flutuantes em 0,1 M PBS. Cortes mais finos, por exemplo de 30 um, pode ser utilizado quando a coloração secções montadas.
2. Extingue-se secções durante 30 minutos em _0,3% de H 2 _O 2 em PBS protegidas da luz.
3. Bloquear antigénios não específicos nas secções durante 30 minutos em PBS contendo 0,3% de Tween 20 com soro de cabra normal a partir do kit Vectastain Elite (VE kit).
4. Incubar secções bloqueados durante 3,5 horas em coelho anti-EGFP (1: 1.000), à TA.
5. Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida incubar durante 1 h em anticorpo secundário de cabra anti-coelho a partir do kit de VE, à TA.
6. Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante.
7. Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem, durante 1 h em solução ABC do kit de VE, à TA.
8. Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e desenvolver durante 8 minutos em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidina) e _0,015% de H 2 _O 2.
9. Seções de montagem em lâminas SuperFrost Bonés e desidratar-los através de uma série álcool graduado (70%, 95%, 100% e 100% durante 5 minutos cada).
10. Desmarque as secções através de duas lavagens xileno (5 min cada) e lamela as lâminas com Permount meio de montagem.
11. Imagem as seções montadas em um microscópio. O produto da reacção DAB inside as células devem aparecer marrom. Imagens digitalizadas podem ser cor invertida para realçar processos finas.

5. Preparação cirúrgica para a injeção de Tracers em regiões do cérebro Descoberto por PRV Tracing

1. Induzir a anestesia geral por injeco intramuscular de cetamina-xilazina (100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg xilazina) e manter uma plano anestésico apropriado utilizando isofluorano.
2. Proteja as córneas com uma pomada oftálmica.
3. Fixe a cabeça em um quadro estereotáxico apropriado.
4. Prepare o local cirúrgico de acordo com a técnica asséptica por aparar o cabelo e desinfecção do local com a alternância de scrubs de Betadine e álcool a 70% (mínimo de 3 ciclos).
5. Faça uma incisão no couro cabeludo e retrair a pele sobre a região do cérebro de interesse.
6. Realize uma pequena craniotomia nas coordenadas estereotáxica adequadas. Por exemplo, as coordenadas para córtex motor laryngeally conectado identificado por PRV rastreamento em umn rato adulto são 1,2 milímetros lateral e 0,2 mm rostral para Bregma.

6. Injecção da biotinilados Dextran Aminas em Cérebro

1. Prepare a 7,5% biotinilados aminas dextrano (BDA) por dissolução de 25 mg de BDA (MW 10.000) em 333 ul de solução salina estéril.
2. Carregar o sistema micropipeta Nanoject II com solução BDA suficiente para as injeções planejadas.
3. Lentamente limpar o espaço morto e verificar que a solução é sair da ponta da micropipeta.
4. Usando um dispositivo estereotáxico microposicionamento cuidadosamente abaixe a ponta da micropipeta para a região do cérebro de juros e injetar lentamente BDA. Ajustar a velocidade de injecção, dependendo do tamanho da região a ser marcado. Por exemplo, 12 injeções de 4,6 nl deve ser fez em quatro locais diferentes 0,2 milímetros distante (sentido rostro-caudal) para cobrir o córtex motor laryngeally conectado em ratos adultos. O volume final de injecção deve ser ajustada de acordo com o tamanho da região do cérebro de interesse, Tendo em mente que a etiqueta pode difundir a partir do núcleo de injecção por difusão através do tecido cerebral e ao longo dos processos de neurónios marcados.
5. Selar a craniotomia com cimento dental, e fechar o ferimento no couro cabeludo usando adesivo de tecido Vetbond.
6. Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por suas diretrizes de uso de animais institucionais.

7. Injecção da toxina da cólera Subunidade b no músculo

1. Prepare 1% Toxina da Cólera subunidade b (CTB) por dissolução de 1 mg de CTB em 100 ul de solução salina estéril.
2. Seis dias após a injecção BDA no cérebro, realizar a preparação cirúrgica, como acima descrito para injecções PRV no músculo.
3. Carregue a 10 ul sistema de micro Nanofil com solução CTb, anexar uma agulha de aço inoxidável 34 G, e cuidadosamente montá-lo no dispositivo estereotáxico.
4. Execute as microinjeções no músculo (s) de interesse como anteriormente descrito para PRV.
5. Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por suas diretrizes de uso de animais institucionais.
6. Três dias após a injecção de CTB, sacrifício do animal por dose excessiva de pentobarbital e perfundir transcardíaca com solução salina a 0,9%, seguido por 4% de formaldeído em PBS a 0,1 M.
7. Retire e pós-fixar o cérebro em formaldeído 4% durante 24 horas.
8. Cryoprotect o cérebro em tampão de fosfato contendo 30% de sacarose pelo menos durante 48 horas.

8. Detecção de BDA e CTb nas mesmas seções

1. Cortar secções de 40 um em um micrótomo e salvar seções flutuantes em 0,1 M PBS.
2. Extingue-se secções durante 30 minutos em _0,3% de H 2 _O 2 em PBS protegidas da luz.
3. Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante.
4. Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem, durante 1 h em solução ABC à TA.
5. Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e desenvolver durante 8 minutos em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidina), _0,015% de H 2 _O 2, e 0,05% de cloreto de níquel. O produto da reacção DAB no interior das células deve aparecer preto.
6. Secções de blocos de 30 min em PBS contendo 0,3% de Tween 20 com soro normal de coelho a partir do kit Vectastain Elite.
7. Incubar secções bloqueados durante 2 horas em cabra anti-CTB (1: 10.000), à TA.
8. Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, depois incubar durante 1 h em anticorpo secundário de coelho anti-cabra a partir do kit de VE, à TA.
9. Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante.
10. Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem durante 30 min em solução ABC à TA.
11. Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e para desenvolver até 8 min em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidine) e _0,015% de H 2 _O 2. O produto da reacção de DAB no interior das células deve aparecer castanho.
12. Seções de montagem em lâminas SuperFrost Bonés e desidratar-los através de uma série álcool graduado (70%, 95%, 100% e 100% durante 5 minutos cada).
13. Desmarque as secções através de duas lavagens xileno (5 min cada) e lamela as lâminas com Permount meio de montagem.
14. Imagem as seções montadas em um microscópio.

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Resultados

A coloração para eGFP deve começar mostrando sinal fraco em neurônios motores primários de aproximadamente 72 horas após a injecção de PRV152 em músculo. A replicação e transporte transsináptica de vírus são titer- e ⁴ dependente do tempo. Aproximadamente 90 horas após a injecção, coloração eGFP irá revelar sinal robusto em células infectadas ^2ª ordem. Tempos mais longos de sobrevivência irá revelar ³ e células de ordem superior, mas o tempo de sobrevivência sã...

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Discussão

Há uma série de questões que devem ser levadas em consideração ao planejar uma experiência usando PRV152 ^4,21. Mais importante ainda, vírus da pseudo é letal. Como mencionado anteriormente, grandes macacos, incluindo os seres humanos não são suscetíveis à infecção, mas cuidado apropriado deve ser exercido para proteger outros animais. Ratos adultos normalmente sobreviver cinco a sete dias após a inoculação com a estirpe atenuada PRV152. Portanto, PRV152 não é adequado para experiências que...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
NanoFil Microinjection System	World Precision Instruments	IO-Kit	34 G option
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-204
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
[header]
VetBond	3M	1469SB
Isofluorane (Forane)	Baxter	1001936060
Betadine Swab Stick	Cardinal Health	2130-01	200 count
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
SuperFrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
Biotinylated dextran amines	Invitrogen	D-1956	10,000 MW
Pseudorabies virus	Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)	PRV152	Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)	List Biological Laboratories	703
Cholera Toxin B Subunit	List Biological Laboratories	103B
Anti-eGFP	Open Biosystems	ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine	Sigma-Aldrich	D5905	10 mg tablets
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute to 4%
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H3410	30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chloride	Sigma-Aldrich	339350
Phosphate buffer	Sigma-Aldrich	P3619	1.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	10x; pH 7.4
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg/ml dose
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Xylenes	Sigma-Aldrich	534056	Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointment	Vet Depot	1017992