从外围目标跨突触跟踪与伪狂犬病病毒其次是霍乱毒素和生物素葡聚糖胺双标

摘要

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

摘要

跨突触跟踪已成为用于分析调节通过多突触电路周边靶中央传出神经的有力工具。这种方法已通过利用猪病原体伪狂犬病毒^（PRV）1最广泛使用的大脑中的。 PRV不会感染大猿，包括人类，所以它是最常用的研究，小型哺乳动物，尤其是啮齿动物。的伪狂犬病应变PRV152表达增强的绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因和只有逆行通过突触连接远离感染部位^2,3的分层顺序跨过功能性突触。其他PRV毒株具有不同的微生物学性质，并且可以在两个方向（PRV-Becker和PRV-卡普兰^）-4,5-运输。该协议将专门处理PRV152。通过提供该病毒在外围部位，如肌肉，也能够限制病毒的进入吨通过一组特定的神经元的他大脑。的eGFP信号的整个大脑所得图案然后解决了连接到最初感染的细胞的神经元。作为跨突触跟踪与伪狂犬病毒的分布特性使得解释中所标识的网络专用连接困难，我们目前采用生物素葡聚糖胺（BDA）和霍乱毒素B亚基（CTB）进行确认，使用鉴定细胞间的连接灵敏，可靠的方法PRV152。免疫化学检测BDA和CTB的具有过氧化物和DAB（3，3'-二氨基联苯胺）的选择是因为它们是在揭示细胞过程，包括远侧树突^6-11有效。

引言

跨突触跟踪已成为用于分析调节通过多突触电路周边靶中央传出神经的有力工具。这种方法已通过利用猪病原体伪狂犬病毒（PRV），尤其是减毒株PRV-巴萨在1961年首先描述最广泛使用的啮齿动物的大脑^12。在这里，我们提出了一个协议，确定具体肌肉的运动皮层表现或使用重组伪狂犬病病毒株（PRV152）表达绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因²的肌肉群。所描述的方法利用的嗜神经病毒，产生感染性子代跨突触感染功能电路^3,4,13中的其他神经细胞的行为。 PRV152，这是同基因与PRV-巴萨，只有穿越突触逆行通过突触连接的分层顺序远离感染部位^{3,5- <}/ SUP>。通过精确控制感染的周边部位也能够限制病毒的进入大脑通过运动神经元的特定子集。作为依次病毒感染连接神经元的链，eGFP的信号的整个大脑所得图案然后将解决在连接到最初感染的细胞的神经元网络。

使用病毒神经跟踪的一个附加的优点是报告蛋白（eGFP的在这种情况下）感染的细胞内的扩增。这个信号放大提供灵敏度的电平，它允许检测甚至稀疏突起。例如，一个稀疏突起从鼻毛运动皮层的面部运动神经元控制所述晶须被发现在使用病毒表达的绿色荧光蛋白^14只大鼠 ;先前的研究没有使用经典的示踪剂没有报告基因扩增^11,15找到这个投影。不幸的是，许多病毒追踪载体，如在引用的研究中使用的，不交叉的突触，从而限制了其用于跟踪多突触电路。

而呈现明显的优点，用于识别参与的电动机电路单元的网络，跨突触的分布式特性跟踪与PRV-152使得该电路难以解释内特定的连接。因此，我们提出了验证识别电路中的特定连接使用PRV-152双标使用生物素葡聚糖胺（BDA）和霍乱毒素B亚基（CTB）的简单方法。北京经济技术开发区和CTB的结合使用是一种行之有效的追踪神经元^6-8,11的特定集合之间的连接方式。一起使用时，这两种示踪剂可以在相同的部分用双色DAB（3，3'-二氨基联苯胺）过程¹⁶可视化。高分子量BDA（BDA10kDa）被选定为这个协议，因为它ÿields神经元突起^6,7,9进行详细标注。 BDA10kDa的其它优点包括以下：它是在顺行方向^6-8优先运输;它可以通过离子电渗或压力注射^6-8交付;它可以通过简单的抗生物素蛋白-生物素化辣根过氧化物酶（ABC）的程序¹⁷被可视化;它可以通过光或电子显微镜^6,7,18进行成像。免疫化学检测CTB的具有过氧化物和DAB被选择为运动神经元逆行标记，因为它是在揭示细胞过程，包括远侧树突^10,19有效。我们最近使用这种方法来识别发声运动通路在小鼠和以显示从主运动皮层稀疏连接到喉运动神经元，这是以前假定为缺席^20。

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研究方案

注：所有动物的程序进行了审查和批准杜克大学实验动物管理及使用委员会。

1.存储伪狂犬病毒

1. 我们获得林恩·恩奎斯特博士在普林斯顿大学的实验室活病毒（PRV152）以1×10 ⁹ PFU / m的效价。该协议产生的病毒已经出版^2。
2. 分装病毒以每管20微升BSL-2生物安全柜和商店内于-80℃下适当的生物安全的条件。
3. 立即注射前解冻PRV的等分。

2.手术准备注射到肌肉

1. 诱导通过注射氯胺酮 - 甲苯噻嗪的肌内全身麻醉（100mg / kg的氯胺酮; 10毫克/公斤赛拉嗪），并使用异氟烷维持适当的麻醉剂平面。
2. 保护角膜与眼用软膏。
3. 准备吨按照无菌技术通过修剪头发，用聚维酮碘交替磨砂和70％的酒精（至少3次）消毒手术部位，他的手术部位。请务必使用无菌单覆盖手术区域。请务必遵守无菌技术整个过程。
4. 做一个皮肤切口，揭示感兴趣的肌肉。例如，进入环甲喉肌，必须先删除胸骨舌骨肌上覆部分。
5. 任何密封切断肌肉VetBond组织粘合剂。

3.注射伪狂犬病毒进入肌肉

1. 装载10微升NanoFil微量系统刚解冻的PRV的解决方案，附加一个34克的不锈钢针，并小心地将其安装在立体设备上。
2. 慢慢地清除死角和验证解决方案退出微量尖。丢弃液体作为bioharzard浪费。
3. 使用立体micropositioning设备的微量尖小心放置到感兴趣肌肉和慢慢填充肌肉直到轻微肿胀是可见的。喷射率将取决于肌肉和体积的大小而变化，以喷射。例如，200 NL（1微升数量），在4升/秒的速率五次喷射应1分钟间隔在同一地点，以填补环甲肌。移动注射器到感兴趣的肌肉下（在这种情况下，环杓侧），并重复注入过程。只有穿刺每一块肌肉一次。
4. 五分钟后缩回微量。
5. 密封在使用VetBond组织粘合剂筋膜断裂。
6. 毕竟注入已经完成，关闭使用VetBond组织粘合剂伤口。根据本地institional动物使用指南，缝合或伤口剪辑可以使用。
7. 监测动物，直到胸骨斜卧并提供镇痛，食物，水和护理要求由y我们的机构动物使用指南。
8. 后的实验确定生存时间（在这种情况下，90小时至标记²次皮层神经元），戊巴比妥过量牺牲动物和用0.9％盐水 ​​随后的4％甲醛的0.1M的PBS灌注transcardially。
9. 除去和后固定大脑中的4％甲醛24小时。
10. Cryoprotect大脑中含30％蔗糖的至少48小时的磷酸缓冲液。

4.免疫化学检测绿色荧光蛋白的

1. 切段在40微米的滑动切片，并保存浮动部分为0.1M PBS。较薄部分，例如30微米，可以染色安装部分时使用。
2. 淬火部分在_0.3％的H 2 _O 2的30分钟的PBS避光。
3. 方框中的部分的非特异性抗原在含有0.3％吐温20与来自VECTASTAIN精英套件正常山羊血清的PBS 30分钟（VE盒）。
4. 孵育在兔网眼堵塞部分3.5小时抗eGFP的（1：1,000）在RT。
5. 5分钟洗切片在PBS中三次，然后孵育它们1小时中的山羊抗兔二抗从VE试剂盒在RT。
6. 制备的ABC溶液从根据制造商的指示VE套件。
7. 5分钟洗切片在PBS中三次，然后使它们反应1小时在ABC溶液从VE试剂盒在RT。
8. 在磷酸盐缓冲液进行10分钟清洗切片三次，并发展为在磷酸盐缓冲液8分钟，pH为7.4，含0.05％DAB（3，3'-二氨基联苯胺）和0.015％的H _{2 O 2。}
9. 上Superfrost Plus或滑动安装部分和脱水它们通过一个分级醇系列（70％，95％，100％和100％，每次5分钟）。
10. 通过两个二甲苯洗涤（每次5分钟），清除部分和盖玻片Permount安装介质中的幻灯片。
11. 图像在显微镜安装的部分。民建联反应产物insidE中的细胞应该会出现褐色。数字化图像可以彩色倒要突出精细的工序。

5.手术准备注射示踪成脑区通过PRV追踪发现

1. 诱导通过注射氯胺酮 - 甲苯噻嗪的肌内全身麻醉（100mg / kg的氯胺酮; 10毫克/公斤赛拉嗪），并使用异氟烷维持适当的麻醉剂平面。
2. 保护角膜与眼用软膏。
3. 修正头在适当的立体框架。
4. 根据无菌技术通过修整毛发和优碘交替磨砂和70％的醇（至少3个周期）消毒站点准备手术部位。
5. 使头皮切口并缩回皮在感兴趣的大脑区域。
6. 在适当的立体坐标进行一个小的开颅手术。例如，对于确定的PRV跟踪在一个laryngeally连接运动皮层的坐标ñ成年小鼠的1.2毫米横向0.2毫米喙前囟门。

6.注射生物素葡聚糖胺进入脑

1. 通过将25毫克的北京经济技术开发区（1000万千瓦）的333微升无菌生理盐水的准备7.5％生物素葡聚糖胺（BDA）。
2. 加载Nanoject II微管系统为计划注入足够的BDA解决方案。
3. 慢慢地清除死角和验证的解决方案正在退出枪头。
4. 使用立体微定位装置小心地将枪头到感兴趣的脑区，并缓缓注入BDA。调整取决于区域的大小的喷射率来进行标记。例如，12注射4.6 NL应制成处于四个不同地点0.2毫米的间隔（rostro - 尾方向），以覆盖laryngeally连接运动皮层在成年小鼠。最后一次注射体积应根据所关注的大脑区域的大小来调整，牢记标签可以通过脑组织和沿标记的神经元的处理扩散从注射芯通过扩散。
5. 用牙科水泥密封了开颅手术，并关闭使用VetBond组织粘合剂头皮伤口。
6. 监测动物，直到胸骨斜卧并提供镇痛，食物，水和护理按要求通过体制动物使用指南。

7.注射霍乱毒素B亚单位变成肌肉

1. 通过溶解在100μl的无菌盐水的1毫克CTB的制备1％霍乱毒素B亚基（CTB）。
2. BDA注射入脑六天后，执行上述用于PRV注射到肌肉的手术准备。
3. 装载10微升NanoFil微量系统CTB的解决方案，附加一个34克的不锈钢针，并小心地将其安装在立体设备上。
4. 执行显微注射​​到感兴趣肌肉（多个）如前面解划为PRV。
5. 监测动物，直到胸骨斜卧并提供镇痛，食物，水和护理按要求通过体制动物使用指南。
6. CTB注射后三天，通过戊巴比妥过量牺牲动物和灌注transcardially用0.9％盐水随后的4％甲醛的0.1M PBS中。
7. 除去和后固定大脑中的4％甲醛24小时。
8. Cryoprotect大脑中含30％蔗糖的至少48小时的磷酸缓冲液。

8.检测BDA和CTB在同一节

1. 切段在40微米的切片，并保存浮动部分为0.1M PBS。
2. 淬火部分在_0.3％的H 2 _O 2的30分钟的PBS避光。
3. 制备的ABC溶液从根据制造商的指示VE套件。
4. 在PBS中5分钟洗部分三次，然后使它们反应1小时在室温ABC溶液。
5. 在磷酸盐缓冲液进行10分钟清洗切片三次，并发展为在磷酸盐缓冲液8分钟，pH为7.4，含0.05％DAB（3，3'-二氨基联苯胺_{），0.015％}的H 2 _O 2，和0.05％的氯化镍。在细胞内的DAB反应产物应显示为黑色。
6. 块部分为在PBS中30分钟含有0.3％吐温20与来自VECTASTAIN精英套件正常兔血清。
7. 孵育在山羊网眼堵塞部分2小时抗CTB（1：10,000）于RT。
8. 在PBS中5分钟洗部分三次，然后孵育它们1小时在兔抗山羊二抗从VE试剂盒在RT。
9. 制备的ABC溶液从根据制造商的指示VE套件。
10. 在PBS中5分钟洗部分三次，然后使它们反应在在室温下的ABC溶液30分钟。
11. 洗部分在磷酸盐缓冲液三次10分钟，并发展为在磷酸盐缓冲液达8分钟，pH为7.4，含0.05％DAB（3,3'二氨基联苯胺）和0.015％H _{2 O 2。}在细胞内的DAB反应产物应该出现褐色。
12. 上Superfrost Plus或滑动安装部分和脱水它们通过一个分级醇系列（70％，95％，100％和100％，每次5分钟）。
13. 通过两个二甲苯洗涤（每次5分钟），清除部分和盖玻片Permount安装介质中的幻灯片。
14. 图像在显微镜安装的部分。

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结果

染色的绿色荧光蛋白应该开始呈现出微弱的信号在主运动神经元注入PRV152进入肌肉后大约72小时。的复制和病毒的跨突触传输是titer-和时间依赖性^4。大约90小时注射后，绿色荧光蛋白染色将显示强劲的信号²次感染的细胞。较长的生存时间，就会发现3 ^次和更高阶的细胞，但生存时间由伪狂犬病病毒，在接种后5天左右的杀伤力有限。

图1a显示

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讨论

有一些必须规划使用PRV152 ^4,21的实验时，应考虑到的问题。最重要的是，伪狂犬病毒是致命的。正如前面提到的，大猿，包括人类不容易受到感染，但相应的必须小心保护其他动物。成年小鼠通常接种减毒PRV152应变后五至七天生存。因此，PRV152是不适合用于需要存活时间超过一周长的实验。此外，受感染的动物在生存期通常显示疾病的迹象，从而限制PRV152为需要观察的正常行为的实验工具...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
NanoFil Microinjection System	World Precision Instruments	IO-Kit	34 G option
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-204
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
[header]
VetBond	3M	1469SB
Isofluorane (Forane)	Baxter	1001936060
Betadine Swab Stick	Cardinal Health	2130-01	200 count
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
SuperFrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
Biotinylated dextran amines	Invitrogen	D-1956	10,000 MW
Pseudorabies virus	Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)	PRV152	Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)	List Biological Laboratories	703
Cholera Toxin B Subunit	List Biological Laboratories	103B
Anti-eGFP	Open Biosystems	ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine	Sigma-Aldrich	D5905	10 mg tablets
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute to 4%
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H3410	30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chloride	Sigma-Aldrich	339350
Phosphate buffer	Sigma-Aldrich	P3619	1.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	10x; pH 7.4
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg/ml dose
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Xylenes	Sigma-Aldrich	534056	Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointment	Vet Depot	1017992