Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage

Résumé

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Résumé

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau en utilisant le virus de la pseudorage porcine pathogène (PRV) ^1. PRV ne pas infecter les grands singes, dont les humains, il est le plus souvent utilisé dans les études sur les petits mammifères, en particulier les rongeurs. La souche de la pseudorage PRV152 exprime la protéine fluorescente (eGFP) gène rapporteur verte améliorée et que traverse synapses fonctionnelles manière rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques de distance à partir du site d'infection ^{de 2,3.} D'autres souches de PRV ont des propriétés distinctes et microbiologiques peuvent être transportés dans les deux directions (PRV-Becker et Kaplan-PRV) ^4,5. Ce protocole traitera exclusivement avec PRV152. En fournissant le virus à un site périphérique, par exemple muscle, il est possible de limiter l'entrée du virus dans til cerveau à travers un ensemble spécifique de neurones. Le motif de signal de eGFP résultant dans tout le cerveau résout alors les neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement. Comme la nature distribuée de traçage transsynaptique par le virus de la pseudo rend l'interprétation des connexions spécifiques au sein d'un réseau identifié difficile, nous présentons une méthode sensible et fiable utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la toxine du choléra sous-unité B (CTB) pour confirmer les connexions entre les cellules identifiées à l'aide PRV152. La détection immunochimique de BDA et la CTB à la peroxydase et DAB (3, 3 'diaminobenzidine) a été choisi parce qu'ils sont efficaces à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales ^6-11.

Introduction

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau de rongeurs en utilisant le virus de la pseudo pathogènes porcine (PRV), en particulier la souche atténuée PRV-Bartha décrite pour la première en 1961 ^12. Ici, nous présentons un protocole pour identifier la représentation corticale motrice des muscles spécifiques ou groupes de muscles à l'aide d'une souche de virus de la pseudorage recombinant (PRV152) exprimant la protéine de renforcement fluorescente verte (EGFP) gène rapporteur ^2. La méthode décrite exploite le comportement des virus neurotropes, qui produisent une descendance infectieuse que les synapses croisées pour infecter d'autres neurones dans un circuit fonctionnel ^3,4,13. PRV152, qui est isogénique avec PRV-Bartha, seule traverse synapses rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques en dehors du site d'infection ^{3,5 <}/ sup>. En contrôlant avec précision le site de l'infection périphérique, il est possible de limiter la pénétration du virus dans le cerveau à travers un sous-ensemble spécifique des motoneurones. Comme le virus infecte de manière séquentielle de chaînes de neurones connectés, le motif de signal de eGFP dans le cerveau résultant sera alors de résoudre le réseau de neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement.

Un avantage supplémentaire de l'utilisation de virus pour le traçage de neurones est l'amplification de la protéine rapporteur (eGFP dans ce cas) dans les cellules infectées. Cette amplification de signal fournit un niveau de sensibilité qui permet la détection des projections même clairsemés. Par exemple, une projection creuse de vibrisses de cortex moteur aux neurones moteurs faciaux contrôlant les whiskers a été trouvé chez les rats en utilisant viralement exprimé la protéine fluorescente verte ^14; études précédentes ont échoué à trouver cette projection utilisant des traceurs classiques sans amplification du gène rapporteur ^11,15. Malheureusement, De nombreux vecteurs de traçage virales, comme celui utilisé dans l'étude citée, ne traversent pas les synapses, ce qui limite leur utilisation pour le traçage des circuits multi-synaptiques.

Bien que présentant des avantages distincts pour identifier le réseau de cellules participant à un circuit de moteur, la nature distribuée transsynaptique de traçage avec PRV-152 rend l'interprétation de liaisons spécifiques dans le circuit difficile. Par conséquent, nous présentons une méthode simple pour valider les connexions spécifiques au sein de circuits identifiés en utilisant PRV-152 par double marquage utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB). L'utilisation combinée de BDA et la CTB est une approche bien établie pour tracer des liens entre des ensembles spécifiques de neurones ^6-8,11. Lorsqu'ils sont utilisés ensemble, ces deux traceurs peuvent être visualisées dans la même section en utilisant un DAB à deux couleurs (3, 3 'diaminobenzidine) procédure ^16. Haut poids moléculaire BDA (BDA10kDa) a été choisi pour ce protocole parce qu'il yOMAINES étiquetage détaillé des processus neuronaux ^6,7,9. Des avantages supplémentaires de BDA10kDa sont les suivants: il est de préférence transporté dans le sens antérograde ^6-8; il peut être livré par iontophorèse ou l'injection de pression ^6-8; il peut être visualisée par une simple avidine-HRP biotinylé de (ABC) ¹⁷ procédure; et il peut être imagée par microscopie optique ou électronique ^6,7,18. La détection immunochimique de la CTB à la peroxydase et DAB a été choisi pour marquage rétrograde des motoneurones parce qu'il est efficace à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales ^10,19. Nous avons récemment utilisé cette approche pour identifier la voie de moteur vocal chez la souris et de révéler une connexion clairsemée du cortex moteur primaire des neurones moteurs du larynx, qui était auparavant supposées être absent ^20.

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Protocole

NOTE: Toutes les procédures d'animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Duke.

1. Enregistrement des virus de la pseudo

1. Nous obtenons virus vivant (PRV152) du laboratoire du Dr Lynn Enquist à l'Université de Princeton à un titre de 1 x 10 ⁹ pfu / m. Le protocole pour générer le virus a été publiée ^deux.
2. Aliquoter le virus à 20 pi par tube à l'intérieur d'une armoire et un magasin BSL-2 biosécurité à -80 ° C dans des conditions de biosécurité appropriées.
3. Décongeler une aliquote de PRV immédiatement avant injection.

2. Préparation chirurgicale pour injections dans le muscle

1. Induire une anesthésie générale par injection intramusculaire de kétamine-xylazine (100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine) et maintenir un plan anesthésique approprié en utilisant isofluorane.
2. Protéger les cornées avec une pommade ophtalmique.
3. Préparer til site chirurgical selon la technique aseptique en coupant les cheveux et la désinfection du site chirurgical avec gommages alternées de Bétadine et 70% d'alcool (minimum de 3 cycles). Veillez à utiliser des champs stériles pour couvrir les zones chirurgicales. Assurez-vous d'adhérer à des techniques stériles tout au long des procédures.
4. Faire une incision de la peau et de révéler le muscle d'intérêt. Par exemple, pour accéder au muscle laryngé cricothyroïdienne il est nécessaire d'enlever d'abord la partie recouvrant le muscle sterno de.
5. Sceller toutes les muscles sectionnés avec colle tissulaire Vetbond.

3. Injection de PRV dans le muscle

1. Charger le système d'microseringue Nanofil de 10 pi avec une solution de PRV fraîchement décongelé, fixer une aiguille en acier inoxydable de 34 G, et monter avec précaution sur l'appareil stéréotaxique.
2. Lentement effacer l'espace mort et vérifiez que la solution quitte la pointe microseringue. Jeter fluide comme un déchet bioharzard.
3. Utilisation d'un microP stéréotaxiqueDispositif OSITIONNEMENT placer soigneusement la pointe de la microseringue dans le muscle d'intérêt et remplir lentement le muscle jusqu'à ce qu'une légère enflure est visible. La vitesse d'injection varie en fonction de la taille du muscle et le volume à injecter. Par exemple, cinq injections de 200 nl (1 pi totale) à un taux de 4 nl / s devraient être faites 1 min part sur le même site pour remplir le muscle cricothyroïdienne. Déplacez la seringue à la prochaine musculaire d'intérêt (le crico-aryténoïdienne latéral dans ce cas) et répétez la procédure d'injection. Seulement une fois perforer chaque muscle.
4. Rétracter la microseringue après cinq minutes.
5. Sceller la rupture de l'aponévrose en utilisant un adhésif de tissu Vetbond.
6. Après toutes les injections ont été réalisées, fermer la plaie avec de la colle tissulaire Vetbond. Selon vos INSTITUTIONNEL directives d'utilisation des animaux locaux, des sutures ou des clips plaie peut être utilisé.
7. Surveiller l'animal jusqu'à décubitus sternal et de fournir l'analgésie, de la nourriture, de l'eau, et aux soins requis par ynos institutionnels directives d'utilisation des animaux.
8. Après le temps de survie déterminée expérimentalement (dans ce cas, 90 h à l'étiquette ^d'ordre 2 neurones corticaux), sacrifier l'animal par une overdose de pentobarbital et perfuser transcardiaque avec saline à 0,9% suivi par 4% de formaldéhyde dans 0,1 M de PBS.
9. Retirez et post-fixer le cerveau de 4% de formaldéhyde pendant 24 heures.
10. Cryoprotect du cerveau dans du tampon phosphate contenant 30% de saccharose pendant au moins 48 heures.

4. immunochimique Détection de eGFP

1. Couper des sections à 40 um sur un microtome à glissière et économisez sections flottantes dans 0,1 M PBS. Sections plus minces, par exemple de 30 um, peuvent être utilisés lorsque la coloration sections montées.
2. Étancher sections pendant 30 min dans 0,3% _H 2 O 2 dans PBS protégées de la lumière.
3. Bloquer antigènes non spécifiques dans les sections pendant 30 min dans du PBS contenant 0,3% de Tween 20 avec du sérum de chèvre normal à partir du Kit VECTASTAIN Elite (VE kit).
4. Incuber sections bloqué pendant 3,5 heures chez le lapin anti-eGFP (1: 1 000) à température ambiante.
5. Lavez sections trois fois dans PBS pendant 5 min, puis les incuber pendant 1 heure dans un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin de la VE kit à température ambiante.
6. Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant.
7. Lavez sections trois fois dans PBS pendant 5 min, en les ensuite réagir pendant 1 heure dans une solution ABC de la VE kit à température ambiante.
8. Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et développer pendant 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidine) et 0,015% de H _{2 O 2.}
9. Sections de montage sur des lames Superfrost Plus et les déshydrater à travers une série d'alcool graduée (70%, 95%, 100% et 100% pendant 5 minutes chacun).
10. Désactivez les sections à travers deux lavages xylène (5 minutes chacun) et les diapositives avec lamelle Permount milieu de montage.
11. Image les sections montées sur un microscope. Le produit de réaction DAB inside les cellules doivent apparaître brun. Les images numérisées peuvent être de couleur inversé pour mettre en évidence les processus fines.

5. Préparation chirurgicale pour injection de traceurs dans les régions cérébrales Découvert par PRV Tracing

1. Induire une anesthésie générale par injection intramusculaire de kétamine-xylazine (100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine) et maintenir un plan anesthésique approprié en utilisant isofluorane.
2. Protéger les cornées avec une pommade ophtalmique.
3. Fixer la tête dans un cadre stéréotaxique appropriée.
4. Préparer le site chirurgical selon une technique aseptique en coupant les cheveux et la désinfection du site avec des gommages alternées de Bétadine et 70% d'alcool (minimum de 3 cycles).
5. Faire une incision du cuir chevelu et se rétracter la peau sur la région du cerveau d'intérêt.
6. Effectuer une petite craniotomie les coordonnées stéréotaxiques appropriées. Par exemple, les coordonnées de laryngeally relié cortex moteur identifié par un PRV en traçantn souris adulte sont de 1,2 mm et 0,2 mm latérale rostrale à Bregma.

6. L'injection de dextrane Amines biotinylés en réflexion

1. Préparer 7,5% Amines dextran biotinylé (BDA) en dissolvant 25 mg de BDA (10.000 MW) dans 333 ul de solution saline stérile.
2. Charger le système d'micropipette Nanoject II avec une solution BDA suffisante pour les injections prévues.
3. Lentement effacer l'espace mort et vérifier que la solution est de quitter la pointe de la micropipette.
4. L'utilisation d'un dispositif de micropositionnement stéréotaxique abaisser soigneusement la pointe de la micropipette dans la région du cerveau d'intérêt et injecter lentement BDA. Ajuster le débit d'injection en fonction de la taille de la zone à marquer. Par exemple, 12 injections de 4,6 nl devraient être faites à quatre endroits différents de 0,2 mm de distance (direction rostro-caudale) pour couvrir le cortex moteur laryngeally connecté chez la souris adulte. Le volume d'injection final doit être ajustée en fonction de la taille de la région du cerveau d'intérêt, En gardant à l'esprit que l'étiquette peut se propager à partir du noyau d'injection par diffusion à travers les tissus du cerveau et le long des processus de neurones marqués.
5. Sceller le craniotomie utilisant ciment dentaire, et de fermer la plaie du cuir chevelu avec de la colle tissulaire Vetbond.
6. Surveiller l'animal jusqu'à décubitus sternal et de fournir l'analgésie, de la nourriture, de l'eau, et aux soins requis par vos directives institutionnelles de l'utilisation des animaux.

7. L'injection de toxine cholérique Subunit b dans le muscle

1. Préparer une sous-unité de choléra% toxine B (CTB) en dissolvant 1 mg de CTB dans 100 ul de solution saline stérile.
2. Six jours après l'injection dans le cerveau BDA, effectuer la préparation chirurgicale décrite ci-dessus pour les injections dans le muscle PRV.
3. Charger le système d'microseringue Nanofil de 10 pi avec une solution CTb, fixer une aiguille en acier inoxydable de 34 G, et soigneusement le monter sur le dispositif stéréotaxique.
4. Effectuez les micro-injections dans le muscle (s) d'intérêt comme précédemment déprescrite pour PRV.
5. Surveiller l'animal jusqu'à décubitus sternal et de fournir l'analgésie, de la nourriture, de l'eau, et aux soins requis par vos directives institutionnelles de l'utilisation des animaux.
6. Trois jours après l'injection CTb, sacrifier l'animal par une overdose de pentobarbital et perfuser transcardiaque avec saline à 0,9% suivi par 4% de formaldéhyde dans 0,1 M de PBS.
7. Retirez et post-fixer le cerveau de 4% de formaldéhyde pendant 24 heures.
8. Cryoprotect du cerveau dans du tampon phosphate contenant 30% de saccharose pendant au moins 48 heures.

8. Détection de BDA et la CTB dans les mêmes sections

1. Couper des sections à 40 um sur un microtome et économisez sections flottantes dans 0,1 M PBS.
2. Étancher sections pendant 30 min dans 0,3% _H 2 O 2 dans PBS protégées de la lumière.
3. Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant.
4. Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis leur réagir pendant 1 heure dans une solution ABC à TA.
5. Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et développer pendant 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidine), 0,015% de H _{2 O 2,} et 0,05% de chlorure de nickel. Le produit de la réaction DAB à l'intérieur des cellules devrait apparaître en noir.
6. Sections de bloc pendant 30 minutes dans du PBS contenant 0,3% de Tween 20 avec du sérum de lapin normal à partir du Kit VECTASTAIN Elite.
7. Incuber sections bloqué pendant 2 heures dans de chèvre anti-CTB (1: 10,000) à la température ambiante.
8. Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis les incuber pendant 1 heure dans un anticorps secondaire de lapin anti-chèvre de la VE kit à température ambiante.
9. Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant.
10. Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis leur réagir pendant 30 min dans une solution ABC à TA.
11. Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et pour développer jusqu'à 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidine) et 0,015% de H _{2 O 2.} Le produit de la réaction DAB à l'intérieur des cellules devrait apparaître brun.
12. Sections de montage sur des lames Superfrost Plus et les déshydrater à travers une série d'alcool graduée (70%, 95%, 100% et 100% pendant 5 minutes chacun).
13. Désactivez les sections à travers deux lavages xylène (5 minutes chacun) et les diapositives avec lamelle Permount milieu de montage.
14. Image les sections montées sur un microscope.

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Résultats

Coloration pour eGFP devrait commencer à montrer des signaux faibles dans les neurones moteurs primaires d'environ 72 heures après l'injection dans le muscle PRV152. La réplication et de transport transsynaptique du virus sont titer- et dépendante du temps ^4. Environ 90 heures après l'injection, eGFP coloration va révéler signal fort dans les cellules infectées par ordre ² e. Prolongement de la durée de survie révéleront ³ ème et cellules d'ordre supérieur ma...

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Discussion

Il ya un certain nombre de questions qui doivent être prises en considération lors de la planification d'une expérience utilisant PRV152 ^4,21. Plus important encore, virus de la pseudorage est létale. Comme mentionné précédemment, les grands singes, dont les humains ne sont pas sensibles à l'infection, mais des soins appropriés doivent être exercés pour protéger les autres animaux. Les souris adultes survivent généralement de cinq à sept jours après l'inoculation avec la souche att...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
NanoFil Microinjection System	World Precision Instruments	IO-Kit	34 G option
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-204
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
[header]
VetBond	3M	1469SB
Isofluorane (Forane)	Baxter	1001936060
Betadine Swab Stick	Cardinal Health	2130-01	200 count
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
SuperFrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
Biotinylated dextran amines	Invitrogen	D-1956	10,000 MW
Pseudorabies virus	Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)	PRV152	Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)	List Biological Laboratories	703
Cholera Toxin B Subunit	List Biological Laboratories	103B
Anti-eGFP	Open Biosystems	ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine	Sigma-Aldrich	D5905	10 mg tablets
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute to 4%
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H3410	30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chloride	Sigma-Aldrich	339350
Phosphate buffer	Sigma-Aldrich	P3619	1.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	10x; pH 7.4
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg/ml dose
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Xylenes	Sigma-Aldrich	534056	Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointment	Vet Depot	1017992