Transináptico Seguimiento de Metas periféricos con Pseudorrabia Virus Seguido de la toxina del cólera y Biotinylated dextrano Aminas doble etiquetado

Resumen

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Resumen

Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque ha sido utilizado más extensivamente en el cerebro mediante la utilización del virus de la pseudorrabia porcina patógenos (PRV) ^1. PRV no infecta a los grandes simios, incluidos los humanos, por lo que es más comúnmente utilizado en estudios de pequeños mamíferos, especialmente roedores. El PRV152 seudorrabia cepa expresa la proteína fluorescente (EGFP) gen indicador verde mejorado y sólo cruza la sinapsis funcionales retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia desde el sitio de la infección ^2,3. Otras cepas PRV tienen propiedades microbiológicas distintos y pueden ser transportados en ambas direcciones (PRV-Becker y PRV-Kaplan) ^4,5. Este protocolo se ocupará exclusivamente de PRV152. Al entregar el virus en un lugar periférico, tales como el músculo, es posible limitar la entrada del virus en tque el cerebro a través de un conjunto específico de neuronas. El patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro a continuación, resuelve las neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente. Como la naturaleza distribuida de rastreo transináptico con el virus de la pseudorrabia hace interpretar conexiones específicas dentro de una red identificada difícil, presentamos un método sensible y fiable empleando aminas biotina dextrano (BDA) y la toxina del cólera subunidad B (CTB) para confirmar las conexiones entre las células identificadas utilizando PRV152. Detección inmunoquímica de BDA y CTb con peroxidasa y DAB (3, 3'-diaminobencidina) fue elegido porque son eficaces a revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales ^6-11.

Introducción

Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque se ha utilizado más ampliamente en el cerebro de roedores utilizando el virus de la pseudorrabia patógenos porcina (PRV), especialmente la cepa atenuada PRV-Bartha describió por primera vez en 1961 ^12. A continuación, presentamos un protocolo para la identificación de la representación cortical motora de los músculos específicos o grupos musculares utilizando una cepa del virus de la pseudorrabia recombinantes (PRV152) que expresa el aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) gen informador ^2. El método descrito explota el comportamiento de los virus neurotróficos, que producen progenie infecciosa que las sinapsis transversales para infectar otras neuronas dentro de un circuito funcional ^3,4,13. PRV152, que es isogénica con PRV-Bartha, solamente cruza la sinapsis retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia del sitio de la infección ^{3,5 <}/ sup>. Al controlar con precisión el sitio periférico de la infección es posible limitar la entrada del virus en el cerebro a través de un subconjunto específico de las neuronas motoras. A medida que el virus infecta secuencialmente cadenas de neuronas conectadas, el patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro entonces resolver la red de neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente.

Una ventaja adicional del uso de virus para el rastreo neural es la amplificación de la proteína indicadora (eGFP en este caso) dentro de las células infectadas. Esta amplificación de la señal proporciona un nivel de sensibilidad que permite la detección de proyecciones incluso dispersos. Por ejemplo, una proyección de escasa corteza motora Vibrisas a las neuronas motoras faciales que controlan los bigotes se encontró en ratas utilizando la proteína fluorescente verde de forma viral expresado ^14; estudios previos no lograron encontrar esta proyección utilizando trazadores clásicos sin amplificación del gen reportero ^11,15. Desafortunadamente, Muchos vectores virales de rastreo, como el usado en el estudio citado, no se cruzan las sinapsis, lo que limita su uso para el rastreo de circuitos multi-sinápticas.

Al presentar distintas ventajas para la identificación de la red de las células que participan en un circuito del motor, la naturaleza distribuida de transináptico rastreo con PRV-152 hace que la interpretación de conexiones específicas dentro del circuito difícil. Por lo tanto, se presenta un método simple para la validación de las conexiones específicas dentro de los circuitos identificados con PRV-152 haciendo doble etiquetado utilizando aminas biotina dextrano (BDA) y la subunidad toxina del cólera b (CTB). El uso combinado de BDA y CTb es un enfoque bien establecido para el rastreo de conexiones entre conjuntos específicos de neuronas ^6-8,11. Cuando se usan juntos, estos dos marcadores se pueden visualizar en la misma sección usando un DAB de dos colores (3, 3 '-Diaminobencidina) Procedimiento ^16. De alto peso molecular BDA (BDA10kDa) fue seleccionado para este protocolo, ya que yields etiquetado detallado de los procesos neuronales ^6,7,9. Las ventajas adicionales de BDA10kDa incluyen los siguientes: se transporta preferentemente en la dirección anterógrada ^6-8; puede ser entregado por iontoforesis o la inyección de presión ^6-8; se puede visualizar con un simple HRP avidina-biotina (ABC) procedimiento ^17; y puede ser fotografiado por la luz o microscopía electrónica ^6,7,18. Detección inmunoquímica de CTb con peroxidasa y DAB fue elegido para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras, ya que es eficaz en revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales ^10,19. Recientemente hemos utilizado este enfoque para identificar la vía motora vocal en ratones y revelar una conexión escasa de la corteza motora primaria de las neuronas motoras de la laringe, que fue asumido previamente a estar ausente ^20.

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Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos con animales han sido revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional Animal Care & Use la Universidad de Duke.

1. Almacenamiento Pseudorrabia Virus

1. Obtenemos virus vivo (PRV152) desde el laboratorio del Dr. Lynn Enquist en la Universidad de Princeton en un título de 1 x 10 ⁹ pfu / m. El protocolo para generar el virus ha sido publicada ^2.
2. Alícuota el virus en 20 l por tubo dentro de un gabinete de bioseguridad BSL-2 y se almacena a -80 ° C bajo condiciones de bioseguridad apropiadas.
3. Descongelar una alícuota del PRV inmediatamente antes de la inyección.

2. Preparación quirúrgica para inyección en el músculo

1. Inducir la anestesia general mediante inyección intramuscular de ketamina-xilazina (100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina) y mantener un plano anestésico apropiado utilizando isofluorano.
2. Proteja las córneas con una pomada oftálmica.
3. Preparar tél sitio quirúrgico de acuerdo con una técnica aséptica por el recorte de pelo y la desinfección de la zona quirúrgica con alternancia de matorrales de Betadine y alcohol al 70% (mínimo de 3 ciclos). Asegúrese de utilizar paños estériles para cubrir las áreas quirúrgicas. Asegúrese de que se adhieran a las técnicas estériles durante todo el procedimiento.
4. Hacer una incisión en la piel y revelar el músculo de su interés. Por ejemplo, para acceder al músculo de laringe cricotiroidea es necesario quitar primero la porción suprayacente del músculo esternohioideo.
5. Selle cualquier músculos seccionados con Vetbond adhesivo tisular.

3. La inyección de PRV en el músculo

1. Cargar el sistema de 10 l microjeringa nanofil con solución PRV recién descongelado, adjunte una aguja de acero inoxidable 34 G, y cuidadosamente montarlo en el dispositivo estereotáxico.
2. Lentamente despejar el espacio muerto y verificar que la solución sale de la punta microjeringa. Deseche el fluido como residuos bioharzard.
3. El uso de un microP estereotáxicodispositivo ositioning coloque cuidadosamente la punta microjeringa en el músculo de interés y llenar lentamente el músculo hasta hinchazón leve es visible. La velocidad de inyección variará dependiendo del tamaño del músculo y el volumen a inyectar. Por ejemplo, cinco inyecciones de 200 nl (1 l total) a una velocidad de 4 nl / seg deben hacerse 1 min aparte en el mismo sitio para llenar el músculo cricotiroideo. Mover la jeringa a la siguiente músculo de interés (la cricoaritenoideo lateral en este caso) y repetir el procedimiento de inyección. Sólo perforar cada músculo una vez.
4. Retraer la microjeringa después de cinco minutos.
5. Selle la rotura en la fascia usando Vetbond adhesivo tisular.
6. Después de todas las inyecciones se han completado, cierre la herida utilizando Vetbond adhesivo tisular. Dependiendo de sus directrices locales institional uso de animales, suturas o grapas de la herida puede ser utilizado.
7. Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por ynuestras pautas de uso de los animales institucionales.
8. Después de que el tiempo de supervivencia determinada experimentalmente (en este caso, 90 hr para etiquetar 2 ^nd orden neuronas corticales), sacrifica el animal por sobredosis de pentobarbital y perfundir transcardially con 0,9% de solución salina seguido por 4% de formaldehído 0,1 M en PBS.
9. Retire y posterior a solucionar el cerebro en formaldehído al 4% durante 24 horas.
10. Cryoprotect el cerebro en tampón fosfato que contiene 30% de sacarosa durante al menos 48 h.

4. Detección inmunoquímica de eGFP

1. Cortar secciones a 40 micras en un micrótomo de deslizamiento y guardar secciones flotantes en 0,1 M PBS. Secciones más delgadas, por ejemplo 30 m, se pueden usar cuando la tinción de secciones montadas.
2. Saciar secciones durante 30 minutos en 0,3% de H _{2 O 2} en PBS protegidas de la luz.
3. Bloquear antígenos no específicos en las secciones durante 30 min en PBS que contenía 0,3% de Tween 20 con suero de cabra normal desde el Kit VECTASTAIN Elite (VE kit).
4. Incubar bloqueado secciones de 3,5 horas en conejo anti-eGFP (1: 1000) a TA.
5. Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego incubarlos durante 1 h en cabra anti-conejo anticuerpo secundario del kit VE a TA.
6. Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
7. Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 1 hora en una solución de ABC de la VE kit a TA.
8. Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar durante 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3'-diaminobencidina) y 0,015% de H ₂ O _2.
9. Mount secciones sobre portaobjetos SuperFrost Plus y deshidratar a través de una serie graduada de alcohol (70%, 95%, 100% y 100% durante 5 minutos cada uno).
10. Desactive las secciones a través de dos lavados de xileno (5 min cada uno) y el cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje Permount.
11. Imagen de las secciones montadas en un microscopio. El producto de reacción DAB inside las células deben aparecer marrón. Las imágenes digitalizadas pueden ser de color invertido para poner de relieve los procesos finos.

5. Preparación quirúrgica para inyección de trazadores en regiones del cerebro descubiertas por PRV Tracing

1. Inducir la anestesia general mediante inyección intramuscular de ketamina-xilazina (100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina) y mantener un plano anestésico apropiado utilizando isofluorano.
2. Proteja las córneas con una pomada oftálmica.
3. Fijar la cabeza en un marco estereotáxico apropiado.
4. Preparar el sitio quirúrgico de acuerdo con una técnica aséptica por el recorte de pelo y desinfectar el sitio con alternancia de matorrales de Betadine y alcohol al 70% (mínimo de 3 ciclos).
5. Haga una incisión del cuero cabelludo y retraer la piel sobre la región del cerebro de interés.
6. Realizar una pequeña craneotomía en las coordenadas estereotáxicas apropiados. Por ejemplo, las coordenadas de la corteza motor conectado laryngeally identificado por el rastreo en un PRVn ratón adulto son 1,2 mm lateral y de 0,2 mm rostral a Bregma.

6. La inyección de dextrano biotinilados aminas en el cerebro

1. Preparar 7,5% Aminas dextrano biotina (BDA) por disolución de 25 mg de BDA (10.000 MW) en 333 l de solución salina estéril.
2. Cargue el sistema de micropipeta Nanoject II con suficiente solución BDA para las inyecciones previstas.
3. Lentamente despejar el espacio muerto y verificar que la solución está saliendo de la punta de la micropipeta.
4. El uso de un dispositivo de microposicionamiento estereotáxica bajar con cuidado la punta de la micropipeta en la región del cerebro de interés y lentamente inyecte BDA. Ajustar la velocidad de inyección en función del tamaño de la región a ser etiquetado. Por ejemplo, 12 inyecciones de 4,6 nl deben ser hechas en cuatro lugares diferentes de 0,2 mm de distancia (dirección rostro-caudal) para cubrir el córtex motor conectado laryngeally en ratones adultos. El volumen de inyección final debe ser ajustado de acuerdo con el tamaño de la región del cerebro de interés, Teniendo en cuenta que la etiqueta puede extenderse desde el núcleo de inyección por difusión a través tejido cerebral y a lo largo de los procesos de neuronas marcadas.
5. Selle la craneotomía con cemento dental, y cerrar la herida del cuero cabelludo utilizando Vetbond adhesivo tisular.
6. Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por sus directrices institucionales de uso animal.

7. La inyección de la toxina del cólera subunidad b en el músculo

1. Preparar 1% cólera subunidad B de la toxina (CTB) disolviendo 1 mg de CTb en 100 l de solución salina estéril.
2. Seis días después de la inyección de BDA en el cerebro, realizar la preparación quirúrgica como se describió anteriormente para las inyecciones de PRV en el músculo.
3. Cargar el sistema de 10 l microjeringa nanofil con solución CTB, adjuntar una aguja de acero inoxidable 34 G, y cuidadosamente montarlo en el dispositivo estereotáxico.
4. Realizar las microinyecciones en el músculo (s) de interés como anteriormente desdescrito por PRV.
5. Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por sus directrices institucionales de uso animal.
6. Tres días después de la inyección CTB, sacrificar al animal por sobredosis de pentobarbital y perfundir transcardially con 0,9% de solución salina seguido por 4% de formaldehído 0,1 M en PBS.
7. Retire y posterior a solucionar el cerebro en formaldehído al 4% durante 24 horas.
8. Cryoprotect el cerebro en tampón fosfato que contiene 30% de sacarosa durante al menos 48 h.

8. Detección de BDA y CTb en las mismas secciones

1. Cortar secciones a 40 micras en un micrótomo y guardar secciones flotantes en 0,1 M PBS.
2. Saciar secciones durante 30 minutos en 0,3% de H _{2 O 2} en PBS protegidas de la luz.
3. Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 1 hora en una solución de ABC a TA.
5. Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar durante 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3'-diaminobencidina), 0,015% de H ₂ O _2, y 0,05% de cloruro de níquel. El producto de reacción DAB dentro de las células debería aparecer negro.
6. Secciones de bloque de 30 min en PBS que contenía 0,3% de Tween 20 con suero de conejo normal desde el Kit VECTASTAIN Elite.
7. Incubar bloqueado secciones durante 2 horas en cabra anti-CTB (1: 10.000) a TA.
8. Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego incubarlos durante 1 h en conejo anti-cabra de anticuerpo secundario de la VE kit a TA.
9. Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
10. Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 30 min en una solución de ABC a TA.
11. Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar para un máximo de 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3'diaminobenzidine) y 0,015% de H _{2 O 2.} El producto de reacción DAB dentro de las células debería aparecer marrón.
12. Mount secciones sobre portaobjetos SuperFrost Plus y deshidratar a través de una serie graduada de alcohol (70%, 95%, 100% y 100% durante 5 minutos cada uno).
13. Desactive las secciones a través de dos lavados de xileno (5 min cada uno) y el cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje Permount.
14. Imagen de las secciones montadas en un microscopio.

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Resultados

La tinción para eGFP debería comenzar a mostrar señales débiles en las neuronas motoras primarias, aproximadamente 72 horas después de la inyección de PRV152 en el músculo. La replicación y transporte transináptico del virus son titer- y dependiente del tiempo ^4. Aproximadamente 90 horas después de la inyección, la tinción eGFP revelará potente señal en las células infectadas de orden 2 ^nd. Tiempos de supervivencia más largos revelarán ^3º y células de orden superior, p...

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Discusión

Hay una serie de cuestiones que deben tenerse en cuenta al planificar un experimento utilizando PRV152 ^4,21. Lo más importante, virus de la pseudorrabia es letal. Como se mencionó anteriormente, los grandes simios, incluidos los seres humanos no son susceptibles a la infección, pero la atención adecuada deben ejercerse para proteger a otros animales. Los ratones adultos normalmente sobreviven cinco a siete días después de la inoculación con la cepa atenuada PRV152. Por lo tanto, PRV152 no es apropiado ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
NanoFil Microinjection System	World Precision Instruments	IO-Kit	34 G option
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-204
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
[header]
VetBond	3M	1469SB
Isofluorane (Forane)	Baxter	1001936060
Betadine Swab Stick	Cardinal Health	2130-01	200 count
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
SuperFrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
Biotinylated dextran amines	Invitrogen	D-1956	10,000 MW
Pseudorabies virus	Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)	PRV152	Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)	List Biological Laboratories	703
Cholera Toxin B Subunit	List Biological Laboratories	103B
Anti-eGFP	Open Biosystems	ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine	Sigma-Aldrich	D5905	10 mg tablets
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute to 4%
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H3410	30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chloride	Sigma-Aldrich	339350
Phosphate buffer	Sigma-Aldrich	P3619	1.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	10x; pH 7.4
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg/ml dose
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Xylenes	Sigma-Aldrich	534056	Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointment	Vet Depot	1017992