الفأر الجنينية التنمية في الجامعة نظام الثقافة الأجنة الخالية من المصل

Summary

المصل المستخدمة في الثقافات الجنين يحتوي على مكونات غير معروفة يمكن أن تؤثر على نتائج التجارب وخاصة في الدراسات التي تنطوي على إشارات التفاعلات. نحن هنا لاستخدام الاوكسيجين نظام الثقافة المصل خالية وتبين أن الأجنة منتصف الحمل الماوس تربيتها لمدة 16-40 ساعة تظهر التنمية المورفولوجية مماثلة لأجنة النامية في الرحم.

Abstract

تم تربيتها الأجنة منتصف الحمل مرحلة الماوس الاستفادة من مستنبت المصل خالية أعدت من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا المكملات الخلايا الجذعية في نظام الثقافة زجاجة المتداول الاوكسيجين. أجنة الفئران في E10.5 تم عزل بعناية من الرحم مع سليمة صفار الكيس وفي عملية تنطوي على المناورة جراحية دقيقة الأجنة وexteriorized بلطف من الكيس المحي مع الحفاظ على استمرارية الأوعية الدموية للجنين مع الكيس المحي. مقارنة مع الأجنة أعدت مع سليمة صفار الكيس أو الكيس المحي مع إزالتها، عرضت هذه الأجنة معدل البقاء على قيد الحياة متفوقة والتقدم التنموي عندما مثقف في ظل ظروف مماثلة. وتبين لنا أن هذه الأجنة الماوس، عندما مثقف في المتوسط ​​المحدد في أجواء من 95٪ O _2/5٪ CO ₂ في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 16-40 ساعة، تظهر النمو المورفولوجية والتنمية مماثلة ل الأجنة النامية في الرحم. نعتقد الهو الأسلوب سوف تكون مفيدة للمحققين الذين يحتاجون إلى الاستفادة من ثقافة الجنين كله لدراسة التفاعلات إشارات هامة في توالد الأعضاء الجنينية.

Introduction

في المختبر باستخدام أساليب الثقافة الأجنة كلها هي مناسبة تماما لدراسة الآليات التي تشارك في إشارة توالد الأعضاء الجنينية التي يصعب الوصول إليها إلا في الرحم. توفير الأجنة الجامعة على سلامة الأنسجة والدعم المناسب للتفاعلات الأنسجة التي تعتبر حاسمة بالنسبة لحدوث الوقت المناسب مما يشير الآليات الأساسية للعمليات الخلوية المختلفة خلال توالد الأعضاء. بينما توفر الثقافات الجنين كله منبرا لمجموعة كبيرة من التطبيقات مثل دراسات الزرع، التلاعب الجيني والأنسجة، والدراسات حبة زرع والدراسات السمية، الخ.، ونظم الثقافة الجنين المستخدمة حاليا تعتمد بشكل أساسي على مصل للنمو السليم والحفاظ على الأجنة في الثقافة ^1-9.

وقد استخدمت المصل باعتبارها واحدة من المكونات الرئيسية التي تتراوح 10-100٪ من وسائل الإعلام الثقافة ^{6-8، 10، 11.}؛ ومع ذلك، فإن تركيبة المصل لم يتم تعريف بشكل جيد ويمكن أن تختلف من حيوان إلى حيوان وفي كل مرة يتم جمع المصل. في حين إعداد مختبر المصل هو مضيعة للوقت وينطوي على إجراءات صارمة، مصل شراؤها يسلك تجاريا تفاوتا كبيرا بين الكثير مختلفة ويرفع تكاليف التجريبية. تضاف إلى هذه، قد يحتوي المصل عوامل غير معروفة مثل عوامل النمو والهرمونات والبروتينات أو غيرها، والتي يمكن أن تؤثر على نتائج بعض التجارب، وخاصة تلك التي تنطوي على دراسة إشارات جزيئات مهمة في تفاعلات الأنسجة. وقد أظهرت الدراسات أن إضافة مصل للثقافة يمكن أن يحتمل تغيير مستويات الخلايا من بعض الجزيئات يشير الى مثل أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي (المخيم) والبروتينات المشاركة في إشارة مولد للتفتل وفسفوإينوزيتيد 3 (PI 3) كيناز مسارات إشارات ^12-14. خلافا لهؤلاء، نظام الثقافة المصل خالية يوفر مزايا البيئة مستضد الحرة،الامتناع عن الانزيمات النشطة بيولوجيا التي يمكن أن تغير العمليات الخلوية ويتيح الاتساق بين التجارب.

في هذه الدراسة، ونحن تستخدم لمستنبت المصل خالية أعدت من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا المكملات الخلايا الجذعية لثقافة مرحلة منتصف الحمل الأجنة كله في جو من 95٪ O _2/5٪ CO ₂ في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 ° C ^15،16. أجنة الفئران مثقف ل16-40 ساعة في ظل هذه الظروف المحددة عرضت التقدم في التنمية الصرفي من الجسم ومختلف الهياكل الشاملة الجنينية مثل القلب والأطراف والمخ والعينين تشير مستويات مناسبة من انتشار الخليوي، والهجرة، والتمايز والتفاعل الأنسجة. وكشف التحليل الجزيئي للالتطور الجنيني في الثقافة لأحد أنظمة جهاز معقد مثل العين تطور العين لتكون متسقة مع تلك التي لوحظت في أنسجة العين في EMBRيوس النامية في الرحم (Kalaskar وودرديل، قيد الإعداد). وهكذا تبين لنا أن أجنة الفئران مثقف في مرحلة منتصف الحمل، تظهر النمو المطرد والتنمية المورفولوجية مماثلة لتلك التي لوحظت في الأجنة النامية في الرحم.

Protocol

الماوس الثقافة الجنين:

وأجريت كافة الإجراءات التجريبية وفقا صارمة مع المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية التالية بروتوكول # A2010 07-119، الذي تم مراجعتها والموافقة عليها من قبل جامعة جورجيا المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، التي تحافظ استمرت الرقابة التنظيمية.

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام

1. تحضير مستنبت باستخدام وسائل الإعلام الخلايا الجذعية المتاحة تجاريا والمكملات الغذائية في المبالغ التالية: خروج المغلوب DMEM، خروج المغلوب المصل استبدال (KSR) (10٪)، N-2 الملحق (1X)، الزلال، من المصل البقري (2٪)، البنسلين ( 50 وحدة دولية / مل)، الستربتوميسين (50 ميكروغرام / مل) والامفوتريسين-B (1.25 ميكروغرام / مل). مستنبت أعدت مماثلة لتلك التي سبق وصفها ¹⁵ مع التغييرات التالية: إضافة لمكافحة mycotics واستخدام ضعف تركيز المضادات الحيوية (للاطلاع على تفاصيل الكواشف والمعدات محددة، انظر لىالحادي والمواد).
   ملاحظة: تركيز المضادات الحيوية المستخدمة سابقا (. سكوت مور، ¹⁵ وآخرون) كان كافيا للثقافات الجنين حمل ما يصل إلى 24 ساعة الفترة الزمنية. ولكن عندما استمر ثقافة ما بعد 24 ساعة، عانينا من التلوث من الثقافة وهذه كانت تسيطر بنجاح من خلال مضاعفة تركيز المضادات الحيوية.
2. تخزين مكونات وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية أو في -20 درجة مئوية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. KSR وN-2 الملحق يجب أن يتم تخزينها في aliquots في -20 درجة مئوية لتجنب تكرار تجميد والذوبان. خروج المغلوب DMEM فتحت مرة واحدة ينبغي أن تستخدم في غضون 30 يوما وفقا لتوصية الشركة الصانعة. قبل استخدامها، تدفئة المكونات في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية.
3. إعداد وسائل الإعلام تحت ظروف معقمة. تطهير السطح من جميع المعدات والزجاجات التي تحتوي على مكونات وسائل الإعلام مع 70٪ رذاذ الكحول قبل وضعها في الثقافة هود.
4. مكونات وسائل الإعلام يمكن أن تكون مختلطة إما في كوب معقمة أو مباشرة في نظام تصفية (كورنينج). أولا إضافة مسحوق الزلال إلى خروج المغلوب DMEM. مزيج دقيق من قبل يهز بلطف حتى يذوب تماما الزلال. قم بإضافة الملحق N-2، KSR والمضادات الحيوية وتخلط جيدا باستخدام pipettor. ثم تصفية تعقيم وسائل الإعلام باستخدام 0.22 ميكرون حجم المسام تصفية فراغ مع الشفط. الاستغناء عن وسائل الاعلام في أنابيب مخروطية 50 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها. أعدت وسائل الإعلام مرة واحدة وينبغي أن تستخدم في غضون 4-5 أيام للثقافة.

2. إعداد معدات الثقافة

1. تعقيم الزجاجات الثقافة الزجاج والفلين والمطاط. التفاف زجاجات الثقافة في رقائق الألومنيوم ووضع الفلين زجاجة المطاط في كوب الماء وتعقيم بواسطة التعقيم.
2. تعقيم غرفة الثقافة (وحدة حاضنة الدقة) مع 70٪ رذاذ الكحول ودافئة إلى 37 درجة مئوية قبل البدء في الثقافة. غرفة الثقافة الإلكترونيةساخرا مع قرص المتداول في المركز الذي يحمل زجاجات الثقافة. وينظم تدفق الغاز الى غرفة من قبل قياس الضغط، ويمكن تعديله معدل التدفق من خلال مراقبة تدفق فقاعات الهواء من خلال الماء في أنبوب زجاجي في نهاية المطاف. هذا المتداول زجاجة جهاز الثقافة هو نسخة معدلة من الجهاز الأصلي الذي عرضته جديد وكوكروفت ^17.
3. توصيل اسطوانة غاز تحتوي على خليط الغاز من 95٪ O _2/5٪ CO ₂ إلى غرفة الثقافة وضبط تدفق الغاز إلى "فقاعة هواء واحد في الثانية الواحدة" الذي يعطي معدل تدفق 50 سم / دقيقة ويضمن امدادات كافية من الأوكسجين إلى الأجنة الثقافة.

3. الماوس الأجنة جمع وإعداد للثقافة

1. للحصول على النوع البري أجنة الفئران، ونحن الاستفادة من الفئران C57BL/6J وCD-1 (مختبرات نهر تشارلز) سلالات الخلفية الوراثية.
2. التحقق من إناث الفئران عن المقابس المهبل كل صباح اليوم. في ظهر يوم من العثور على الوينبغي النظر في المكونات الإلكترونية المهبل كما E0.5 DPC (آخر أيام الجماع).
3. جمع أجنة الفئران في E10.5 DPC بواسطة القتل الرحيم الفئران الحوامل التالية البروتوكولات القياسية. والموت الرحيم الفئران باستخدام جهاز الاستنشاق CO ₂ كما هو محدد من قبل الجمعية الأميركية للطب البيطري (اخر احصاء) المبادئ التوجيهية للالقتل الرحيم للحيوانات (2013). لضمان الموت، تم تنفيذ خلع عنق الرحم بعد التعرض لأول أكسيد الكربون _2.
4. رذاذ الايثانول 70٪ على السطح البطني البطن لتجنب التصاق الشعر في البطن لهذه الصكوك. ثم فتح تجويف البطن البطني باستخدام مقص حاد حادة التشغيل وزوج من 4-3/4 في microdissecting ملقط لتحديد موقع الرحم. باستخدام ملقط 4 في microdissecting رفع الرحم بالكامل وفصلها عن الجسم عن طريق قطع مع مقص التشغيل الضوء في جسم الرحم وعلى نصائح من قرون الرحم.
5. شطف بسرعة الرحم بأكمله في برنامج تلفزيوني 1X تحسنت إلى 37 درجة مئويةلإزالة أي خلاف الدم إلى الرحم ووضع على الفور في DMEM تحسنت إلى 37 درجة مئوية في طبق بتري. تعقيم الأدوات بنسبة 70٪ رذاذ الايثانول قبل استخدامها مرة أخرى.
   ملاحظة: التسخين الحلول بما في ذلك برنامج تلفزيوني، DMEM والمتوسطة الثقافة والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية خلال الإجراء بأكمله من المستحسن.
6. تحت المجهر تشريح، الرحم ينبغي تشريح segmentally مع ضوء مقص التشغيل. هذه النتائج في فتحات صغيرة على جانبي الرحم مجزأة من خلالها زوج من تعديل (نهايات اضعافها) ملاقط microdissecting يمكن إدراج بلطف لتوسيع الافتتاح. هذا يسمح التعرض للالساقط المشيمة، ومن ثم يمكن إزالتها عن طريق تمزيق بلطف مع زوج من ملاقط microdissecting لفضح الكيس المحي الجداري (PYS) مع غشاء رايخرت. باستخدام حافة واحدة من ملاقط بلطف يخترق غشاء رايخرت جنبا إلى جنب مع PYS وفصل من اله الكامنة الحشوية الكيس المحي (VYS) طبقة لفضح الأجنة مع VYS سليمة. يمكن إزالة مخروط المشيمة الظاهر والمشتقات trophoectoderm إما مع الساقط المشيمة أو مع غشاء رايخرت. يجب توخي الحذر لتجنب تمزق VYS كما الأجنة تخرج فورا.
7. وينبغي بعد ذلك يتم نقل الأجنة مع VYS سليمة إلى طبق بتري تحتوي على مستنبت تحسنت إلى 37 درجة مئوية باستخدام ماصة نقل البلاستيك.
   ملاحظة: نقل إلى مستنبت مباشرة بعد الانفصال عن الرحم يساعد على تنمية أفضل للجنين في الثقافة.
8. وينبغي بذل فتحة صغيرة في الكيس المحي مع زوج من ملاقط microdissecting تجنب الأوعية الدموية الرئيسية. ألف زوج من ملاقط حادة يمكن استخدامها لجعل الافتتاح ثقب بلطف في المنطقة المتاخمة لمنطقة الرأس. بدلا من اثنين من أزواج من ملاقط حادة يمكن أن تستخدم لعقد الكيس المحي وبلطف المسيل للدموع لجعل فتحة صغيرة.ثم توسيع بلطف افتتاح طريق توسيع مع ملاقط إلى حجم ما يكفي لتناسب الرأس الجنينية. الغشاء الذي يحيط بالجنين الذي يلف الجنين بشكل وثيق ينبغي أن تعقد بلطف بعيدا عن الجسم وممزقة باستخدام زوج من ملاقط. رئيس الجنينية والجنين في وقت لاحق كله ينبغي exteriorized بلطف من الكيس المحي مع الحفاظ على سلامة الأوعية الدموية الجنينية مع أن من الكيس المحي ^15.
   ملاحظة: أي الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية الكيس المحي يمكن أن يؤثر على تطور الجنين في الثقافة. هذه الأجنة مع الأوعية الدموية التالفة لا ينبغي أن تستخدم للثقافة، ويمكن استخدامها لتنظيم الأجنة التي يمكن فيما بعد التخلص منها.
9. معايير التدريج الجنينية: فحص الأجنة تحت المجهر تشريح ومجموعة وفقا لمعايير شكلية بما في ذلك الجسم وحجم الرأس والأطراف والعين والتشكل المرحلة عن طريق عد عدد الجسيدة (ق) لمدة سنتين على الأقل الأجنة من كل مجموعة.
   <قوية> ملاحظة: عادة الأجنة التي تم الحصول عليها من نفس المعرض القمامة الاختلافات في التنمية في الرحم وتختلف في حجم الجسم، وميزات المورفولوجية وعدد من somites. ومع ذلك، وجدنا أن الأجنة التي تم تجميعها حسب المعايير المورفولوجية لدينا عادة عرضت عدد الجسيدة مماثلة (± 1). لهذا السبب، ليس مطلوبا لحساب somites لكل الجنين لأن هذا من شأنه أن يؤخر الوقت للبدء في الثقافة.
   ملاحظة: لا تستخدم الأجنة التي تم استخدامها لحساب و somites للثقافة. عد و somites بعد بدء الثقافة للأجنة أخرى من أجل تجنب تأخير الوقت في البدء في الثقافة. الأجنة التي تم تأجيلها للثقافة بعد الانفصال عن الرحم عادة ما تظهر سوء التنمية.
10. نقل الأجنة فورا إلى طبق بتري مع ثقافة جديدة المتوسطة تحسنت إلى 37 درجة مئوية، وأعتبر أن الثقافة هود مرة أخرى حيث يجب أن يتم نقل الأجنة إلى طبق بتري مع الثقافة العقيمةوسائل الإعلام الإلكترونية قبل وضعها في زجاجات الثقافة مع المتوسطة لبدء الثقافة.
    ملاحظة: إن وسائل الإعلام المتعددة لنقل الأجنة قبل الثقافة يساعد في منع التلوث حيث تم تنفيذ الخطوات المختلفة لجمع الأجنة وتشريح تحت المجهر تشريح التي لم يتم تثبيت في الثقافة هود.
    ملاحظة: عندما يكون حجم القمامة كبيرة (> 12 الأجنة)، عملية نصف الأجنة وبدء الثقافة أو وضعها في طبق مع مستنبت وضعه في حاضنة CO ₂ عند 37 درجة مئوية. عندما تركت الأجنة خارج لفترات أطول (> 35-40 دقيقة) لاحظنا ضربات القلب لإبطاء، وهذا سوف يؤثر على تطور لاحق في الثقافة.

4. زراعة أجنة الفئران

1. فتح زجاجات الثقافة تعقيمها في غطاء محرك السيارة والثقافة، وصحيح تسمية لهم. نقل 3 مل من مستنبت تحسنت إلى 37 درجة مئوية إلى كل من رانه الزجاجات ومن ثم ينبغي نقل الأجنة الماوس برفق في زجاجات معقمة الثقافة باستخدام الماصات البلاستيكية نقل. وينبغي بعد ذلك توج الزجاجات الثقافة مع الفلين زجاجة المطاط التي تساعد على الاستمرار على زجاجات الثقافة إلى القرص المتداول في الجهاز الثقافة.
   ملاحظة: الزجاجات الثقافة مع وسائل الإعلام يمكن أن تكون على استعداد ووضعها على القرص المتداول من قبل جهاز ثقافة القتل الرحيم الفئران. هذا تقصير الوقت لنقل الأجنة في زجاجات الثقافة.
   ملاحظة: أجنة الفأر يمكن تربيتها بشكل فردي أو كما cocultures مع اثنين أو ثلاثة أجنة في زجاجة الثقافة نفسها.
2. الزجاجات الثقافة ينبغي إجراء جو معقم و مطهر للجهاز الثقافة في 37 درجة مئوية، وربط بإحكام لهم الثقوب على القرص المتداول مع الفلين المطاط. بدوره على القرص المتداول لتدوير بسرعة ثابتة من 35 التناوب في الدقيقة الواحدة (دورة في الدقيقة)، والتي تمكن التعويم الحر للEMBRيوس في وسائل الإعلام، وكذلك يساعد في تبادل الغازات المجاني من الأنسجة الجنينية. الغاز من اسطوانة متصلة غرفة الثقافة يتدفق عبر القرص المتداول والفلين والمطاط في زجاجات الثقافة.
3. ثقافة الأجنة ل16-40 ساعة وبانتظام تحقق لتدفق الغاز ودرجة حرارة غرفة الثقافة.
   ملاحظة: الفأر التلاعب الجنين في الثقافة: دعونا الحصول على تكييفها الأجنة لشروط الثقافة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ثم الأجنة التي تظهر أداء ضعيفا واهنا ضربات القلب يمكن التخلص منها ويمكن استخدام الأجنة المتبقية لإجراء المزيد من الدراسات التلاعب. التلاعب الجنين مثل ^5،9،16 التثقيب الكهربائي، إبر دقيقة جدا ¹⁸ حبة زرع ^16، العلاج من تعاطي المخدرات وغيرها من الإجراءات لا يمكن أن يؤديها في هذا الوقت. أجرينا بنجاح زرع حبات الاغاروز افى جل تعامل مع بعض الجزيئات يشير الى دراسة دورها في التنمية العين في وقت مبكر. الأجنة بعديمكن إرجاع التلاعب مرة أخرى في وسيلة جديدة، واستمر في الثقافة.
4. استبدال سائل الإعلام والثقافة تماما مع وسائل الإعلام الجديدة على فترات محددة بعد 9-10 ساعة 18-19 ساعة والثقافة عندما استمر الثقافة لمدة 40 ساعة.
   ملاحظة: قد لا تكون هناك حاجة الثقافة استبدال وسائل الإعلام إذا تم إيقاف الثقافة عن طريق 16-18 ساعة.
5. مقاييس النجاح في الثقافة: ينبغي أن تحدد بقاء الجنينية في الثقافة عن طريق نبضات القلب والدورة الدموية وضوحا في الجسم في حين ينبغي تقييم النمو الجنيني في الثقافة عن طريق الزيادة في حجم الجسم، وعدد الجسيدة والتنمية المورفولوجية للرئيس، وأطرافه والقلب والعينين.
6. في الرحم وضعت الأجنة في E11.0 DPC (~ 40-41 ق) وE12.0 DPC (~ 49-50 ق) ينبغي أن تستخدم ضوابط لمقارنة الأجنة تربيتها لمدة 16-18 ساعة و38-40 ساعة، على التوالي.
7. التطور الجنيني في نقاط زمنية مختلفة خلال الثقافة وللفي مراحل الرحم يمكن الكابتنمحكم تحت مجهر تشريح. وقد استخدمت برامج التصوير بقعة لالتقاط الصور ومعالجتها في وقت لاحق باستخدام برامج معالجة الصور.

النتائج

تطوير أجنة الفئران السابقين الرحم يعتمد على عوامل متعددة بدءا من الوقت الذي يتم عزل الرحم من الجسم إلى الوقت الأجنة هي مثقف. كما هو مبين في الشكل 1، الإجراء ينطوي على سلسلة من الخطوات بما في ذلك، والفصل بين الرحم حامل من الجسم (الشكل 1A)، عزل الأج?...

Discussion

تم تربيتها الأجنة منتصف الحمل مرحلة الماوس في وسائل الإعلام ثقافة خالية من مصل في جو من 95٪ O _2/5٪ CO ₂ في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 درجة مئوية. كان تطور الجنين داخل الرحم السابقين اعتمادا كبيرا على عوامل متعددة في كل خطوة أثناء الإجراء من وقت عزل ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KnockOut DMEM	Invitrogen	10829-018
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
N-2 Supplement	Invitrogen	17502-048	Stock: 100x
Albumin, from Bovine Serum	Sigma	A9418-50G	Stock: 100%
Antibiotic - Antimycotic Solution	Cellgro	30-004-Cl	Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml)
DMEM	Cellgro	15-013-CV
Precision Incubator Unit	B.T.C. Engineering Milton Cambridge England	Id.No. 840-374
Glass Bottles for Rotating Unit	B.T.C. Engineering
Silicone Rubber Cork	B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 Cylinder	AirGas Inc.
Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope	Zeiss
Stemi SV6 Microscope	Zeiss
CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific	Model: 3110
Culture Hood	Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2	Model: Nu-425-600
Water Bath	Fisher Scientific	IsoTemp205
Weigh Balance	Mettler Toledo	AG285
Centrifuge Tube – 50ml	Corning	430291
Light Operating Scissors	Roboz	RS-6702
Operating Sharp-Blunt Scissors	Roboz	RS-6812
Micro Dissecting Forceps – 4”	Roboz	RS-5211
Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) – 4-3/4”	Roboz	RS-5237
Micro Dissecting Tweezers (5/45)	Roboz	RS-5005	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (5)	Roboz	RS-5060	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (55)	Roboz	RS-5063	Modified - Sharp ends were made blunt
Instrument Tray	Roboz	RT-1401S
Instrument Tray Lid	Roboz	RT-1401L
Petri Dish-100mm	Fisher Scientific	087571Z
Petri Dish-60mm	Fisher Scientific	0875713A
Petri Dish-35mm	Fisher Scientific	0875711YZ
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml	Corning	431153
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml	Corning	430756
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml	Corning	430758
Pipet-aid Pipetter	Drummond Scientific Co.	D57849
Serological Pipette-10ml	VWR	89130-898
Disposable Serological Pipette-25ml	Corning	4251
Transfer Pipette - 7.7ml	Thermo Scientific	202-20S