無血清全胚培養系で、マウス胚発生

要約

胚培養に利用される血清は、特にシグナル伝達の相互作用を含む研究での実験の結果に影響を与えることができ、未知のコンポーネントが含まれています。ここでは、無血清酸素化培養系を利用し、16〜40時間培養妊娠中期のマウス胚が子宮内で発生中の胚に匹敵する形態的発展を示すことを示している。

要約

妊娠中期段階のマウス胚の酸素圧延ボトル培養系で商業的に入手可能な幹細胞培地補充物から調製された無血清培地を用いて培養した。 E10.5でのマウス胚を慎重に無傷の卵黄嚢と子宮から単離し、卵黄嚢と胎児の血管の連続性を維持しながら、正確な外科的手技を含むプロセスにおいて胚をゆっくりと卵黄嚢から体外た。無傷の卵黄嚢または削除卵黄嚢を用いて調製した胚と比較して、これらの胚は、優れた生存率と同様の条件下で培養し、発生の進行を示した。我々は、これらのマウス胚は、ときに16〜40時間、37℃で95％O圧延ボトル培養装置での_{2/5％CO 2}の雰囲気中で定義された培地で培養し、匹敵する形態学的成長と発展を示すことを示して胚は子宮内での開発。我々は目を信じるこの方法は、胚器官形成において重要なシグナル伝達相互作用を研究するために全胚培養を利用する必要が捜査のために有用である。

概要

全体の胚を用いた体外培養法では子宮内でアクセスしにくい胚の器官形成に関与するメカニズムのシグナリングの研究に非常に適しています。全胚組織の完全性を提供し、必要不可欠なシグナル伝達機構の適時発生に重要である組織の相互作用のための適切なサポート器官形成中に異なる細胞プロセスのため。全胚培養物は、移植研究、遺伝的および組織操作、ビード移植研究、毒物学的研究等のような用途の過多のためのプラットフォームを提供しているが、現在利用胚培養システムは、胚の適切な成長および維持のために血清に主に依存している文化^1-9。

血清は、培養培地^{6-8、10、11} 10〜100％の範囲の主要成分の一つとして利用されている。;しかし、血清の組成物は、明確なものではなく、動物に、動物異なり、血清が収集されるたびにすることができる。血清の実験室の準備は時間がかかり、厳しい手順が含まれますが、血清調達は、商業的に異なるロット間でかなりのばらつきを示し、実験的なコストを発生させます。これらに加え、血清は、潜在的に特定の実験の結果に影響を与えることができ、このような成長因子、ホルモン、または他のタンパク質などの未知の要因、組織の相互作用において重要なシグナル伝達分子の研究を含むことを特に含むことができる。研究は、培養物への血清の添加は潜在的にそのようなサイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）および分

プロトコル

マウス胚培養：

すべての実験手順を見直し、継続的な規制監督を維持グルジア機関動物実験委員会、大学によって承認されたプロトコル番号のA2010 07から119、次の健康ガイドラインの国立研究所に厳密に従って行った。

1。培養培地の調製

1. ノックアウトDMEM、ノックアウト血清代替（KSR）（10％）、N-2サプリメント（1×）、アルブミン、ウシ血清から（2％）、ペニシリン（以下の量で市販されている幹細胞培地およびサプリメントを用いて培地を調製50 IU / ml）を、ストレプトマイシン（50μg/ ml）を、およびアンホテリシン-B（1.25μg/ ml）を。李を参照して、抗真菌剤を添加して特定の試薬 ​​や機器の詳細については、抗生物質の濃度の2倍を（使用して：調製した培養培地は、以前に以下のように変更して^15を説明したものと同様であるマテリアルのST）。
   注：以前に使用され（ムーア·スコットら ^15）のような抗生物質の濃度は、胚培養物は24時間の期間まで搬送するために十分であった。培養は24時間を超えて継続したときしかし、我々は、培養物の汚染を経験し、これは正常に抗生物質濃度を倍にすることによって制御した。
2. 4℃で、またはメーカーの推奨に従って、-20℃でメディアコンポーネントを

結果

マウス胚の開発は子宮外子宮が受精卵を培養する時に、本 ​​体から分離された時点から開始して、複数の要因によって異なります。 図1に示されるように、手順は、身体から妊娠子宮の分離（ 図1A）、インタクトな卵黄嚢（ 図1B）を有する胚の単離、を含む一連の工程を含む、卵黄嚢からの胚の具象化（ 図1C）、および37℃でのロー...

ディスカッション

妊娠中期段階のマウス胚は、37℃でのローリングボトル培養装置で95％O _{2/5％CO 2}の雰囲気下で無血清培地中で培養した。胚発生の元の子宮は、子宮は培養終了します（ 図1）に安楽死させたマウスから単離した時点から手術中の各段階で複数の要因に決定的に依存していた。現像に影響を与えた最も重要な要因は、培養を開始するのに要する時間であった。最も注意...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
KnockOut DMEM	Invitrogen	10829-018
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
N-2 Supplement	Invitrogen	17502-048	Stock: 100x
Albumin, from Bovine Serum	Sigma	A9418-50G	Stock: 100%
Antibiotic - Antimycotic Solution	Cellgro	30-004-Cl	Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml)
DMEM	Cellgro	15-013-CV
Precision Incubator Unit	B.T.C. Engineering Milton Cambridge England	Id.No. 840-374
Glass Bottles for Rotating Unit	B.T.C. Engineering
Silicone Rubber Cork	B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 Cylinder	AirGas Inc.
Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope	Zeiss
Stemi SV6 Microscope	Zeiss
CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific	Model: 3110
Culture Hood	Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2	Model: Nu-425-600
Water Bath	Fisher Scientific	IsoTemp205
Weigh Balance	Mettler Toledo	AG285
Centrifuge Tube – 50ml	Corning	430291
Light Operating Scissors	Roboz	RS-6702
Operating Sharp-Blunt Scissors	Roboz	RS-6812
Micro Dissecting Forceps – 4”	Roboz	RS-5211
Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) – 4-3/4”	Roboz	RS-5237
Micro Dissecting Tweezers (5/45)	Roboz	RS-5005	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (5)	Roboz	RS-5060	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (55)	Roboz	RS-5063	Modified - Sharp ends were made blunt
Instrument Tray	Roboz	RT-1401S
Instrument Tray Lid	Roboz	RT-1401L
Petri Dish-100mm	Fisher Scientific	087571Z
Petri Dish-60mm	Fisher Scientific	0875713A
Petri Dish-35mm	Fisher Scientific	0875711YZ
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml	Corning	431153
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml	Corning	430756
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml	Corning	430758
Pipet-aid Pipetter	Drummond Scientific Co.	D57849
Serological Pipette-10ml	VWR	89130-898
Disposable Serological Pipette-25ml	Corning	4251
Transfer Pipette - 7.7ml	Thermo Scientific	202-20S